Introduction
차 녹내장은 생활 바꾸는 시력 손실과 실명이 발생할 수있는 세계 일에 걸쳐 약 60,500,000명에 영향을 미치는 치명적인 안과 질환이다. 질병 메커니즘에 대한 연구, 녹내장에 대한 새로운 치료제의 개발, 병리의 특징 몇 가지 요점을 되풀이 질병의 좋은 모델에 따라 달라집니다.
우리는 Samsel 등의 방법에 기초하여 여기 래트 녹내장 모델을 제시한다. (3)이 기술의 전반적인 목적은, 직접을 전방으로 자성 미립자를 주입하고, 자성 링을 이용하여 눈에 안압 (IOP)을 증가시키는 그들 홍채 각막 각도로. 이 신경 세포의 손상 및 세포 손실로 이어지는, 안압을 증가 수성 유출을 방해한다. 프로토콜은 녹내장 간단 유도 모델을 제공하려고 시도하기 위해 개발되었다.
이 프로토콜은 몇 가지 장점을 가질 수있다기존의 기술을 통해. 이러한 DBA / 2J 같은 유전 마우스 모델을 시작하는 절차를 필요로하지 않는, 사용할 수 있습니다; 그러나 이러한 질병의 진행 (4)의 예측할 수없는 증상이있을 수 있습니다. 반대로, 외과 설치류 IOP 승강에 의존 대부분의 유도 가능한 모델은, 개시 사용자에 의해 제어 될 수있는 이점이있다. 이러한 방법 중 일부는 포함 5 기술적 도전 인, 그러나 자신의 단점을 가질 수 있고, 높은 안압 (6)을 유지하기 위해 여러 절차를 요구할 수 있습니다.
반면에,이 원고에 설명 된 유도 방법은 재 주입을위한 최소한의 필요와 압력에 안정적이며 견고한 증가, 생산, 간단하고 효과적이며 재생 가능한 기술이다. 또한, 고가의 설비를 포함하지 않는, 오직 수행하는 기본적인 수술 기술이 필요하다. 이 프로토콜은 덜 기술적 요구 유도를 설정하기 위해 찾고있는 독자들에게 적합 할 수 있습니다자신의 실험실에서 녹내장 모델.
Protocol
윤리 문 : 모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 수행되었으며, 영국 홈 오피스 가이드 라인에 동의 (승인했다 http://goo.gl/FLkirW는 지난 10 일 6 월 액세스 2014) 및 안과 및 비전 연구 (에서 동물의 사용을위한 ARVO 문 http://goo.gl/4LFOjD는 지난 10 일 6 월 2014) 액세스.
1. 안구 고혈압 유도
- Samsel 등의 방법에 따라, 갈색 노르웨이 쥐의 전방에 상자성 미소의 일방적 인 주입을 통해 안압 (IOP)를 올려서 실험 녹내장을 유도한다. 이러한 검증 할 필요가 있지만 3 기타 색소 쥐, 적합 할 수있다 사용자가 처음.
- 하우스 250-300의 g 여성일정한 낮은 조명 환경 (40 ~ 60 룩스)에서 전 개종 갈색 노르웨이 쥐 물과식이에 액세스 할 수있는, IOP 7 일중 변동을 최소화합니다.
- 쥐의 눈 (9)에 사용하기 위해 교정 리바운드 안압계를 이용하여, 이전에 마취 구슬 주입에 깨어 동물 8 기준 안압 측정을 수행. IOP는 다섯 개의 측정 값의 평균으로한다.
- 복강 전달 37.5 ㎎ / kg 케타민, 0.25 ㎎ / ㎏ medetomidine 염산염 쥐를 마취시키다. 동물의 뒷발 반사를 테스트함으로써 마취 깊이를 확인, 요오드 애플리케이션 (단계 1.5 참조), 비드 포비돈을 주입하기 전에 (단계 1.8 참조). 진통제 0.5 % proparacaine 염산염을 관리합니다.
참고 : 모든 단계에서 동공을 팽창하지 마십시오. 이 구슬은 홍채 각막 각도로 잘 정착하는 데 도움이 렌즈에 결합하는 것을 방지 할 수 있습니다. 수술하지 않은 반대편 눈에 각막 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. - W물에 주입하기 전에 10 5 분을 5 % 포비돈 요오드와 수술 눈 화산재.
- 5 분 후, 멸균 거즈을 개시 포비돈 요오드 심지, 0.9 % 멸균 식염수로 눈을 씻는다. 멸균 식염수의 일반 응용 프로그램과 마취 동안 촉촉한 눈을 유지합니다.
- 눈 주위에 도넛 자석을 배치합니다.
- 33 G 바늘을 이용하여 경 사진 30 ㎎ / 전방에 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)에 8 ㎛의 자성 마이크로 감마 멸균 ml의 조사를 함유하는 용액 25 ㎕를 주입한다.
- 구슬을 준비하려면, 다음 최종 30 ㎎ / ㎖ 솔루션을하기 전에, 1 ml의 HBSS 5 분 동안 10,000 XG에서 3 회 원심 분리, 다시 현탁하여 세척한다. 전체에서 무균 조건을 유지한다.
- 주사를 들어, 홍채 외상의 위험을 최소화하기 위해, 홍채에 바늘을 삽입하지 않도록주의해야합니다. 이는 병렬로, 각막 표면에 접하는 바늘을 배향함으로써 방지 될 수있다가능한 홍채. 이것은 또한 주사 부위에서 비드의 손실을 최소화 할 것이다.
참고 : 안압 상승에 중요한 홍채 각막 각도, 주위에 고른 분포를 보장하기 위해 빠른 속도로 구슬을 주입한다. 또한, 점포 비즈, 자성 바늘과 링 별도로 구슬 주사기 및 주입에로드하도록 어렵게 클러스터를 형성하지 않도록, 그리고 바늘 자화가되지 않는다.
- 비즈 섬유주에서 수성 배수를 방해 홍채 각막 각도에 정착되도록 1 분 후 주입을위한 장소에 바늘을 둡니다. 약간 각도 비드 후 바늘 처음 IOP 일시적인 증가를 최소화하기 위해, 수용액 중 일부를 누설하도록 정착했다. 수술의 끝에서 제 인산 완충 생리 식염수 (PBS)로 바늘을 통해 세척 한 후, 증류수이어서 70 % 에탄올, 분리 과정에서 바늘의 계속적인 사용을 보장한다. 대안 적으로, 하나는 사용할 수올바른 게이지 주사기 조합을 사용할 수있는 경우 일회용 바늘. 선택적 : 바늘의 사용을 연장 beveller을 날카롭게하여 될 수있다.
- 이 단계에서는 필요한 경우에, 자석을 제거하고 불완전한 범위의 영역으로 구슬을 그릴을 사용합니다.
- 비즈 홍채 각막 각도에 잘 정착하기 위해 추가로 10 분 후 주입 눈 주위 장소에 자석을 남겨주세요.
- 0.25 ㎎ / kg atipemezole 염산염을 사용하여 역방향 마취.
- 감염을 방지하기 위해 국소 예를 들어, 겐타 마이신 또는 terramycin에 대한 클로람페니콜, 또는 다른 항생제 연고를, 관리 및 통증에 대한 0.5 % proparacaine 염산염. 그들은 운동을 되 찾을 때까지, 열 매트에 복구하는 동물을 남겨 복구가 완료 될 때까지 다음과 같은 보조 식품이나 적신 일반 다이어트로 추가 영양, 따뜻한 상자와 공급에 전송합니다. 전신 또는 로컬 통증은 수술 후 통증이 24 시간의 흔적을 표시하는 동물에게 주어져야한다. 살전 경우전자 증상이 치료에도 불구하고 지속, 동물을 인도적으로 도태되어야한다.
- 작동이되지 않는 대조군으로 반대쪽 눈을 사용하십시오.
- 비드 투여 후 2-3 일마다 안압 측정을 수행하고, 2-3 일마다 그 후 쥐의 눈 (9)에 사용하기 위해 교정 리바운드 안압계를 사용하여.
- 1)는 IOP는 5mmHg 의해 반대측 제어 압력 이상 상승하는 경우, 2) 60 mmHg로를 초과하지 않는다 : 연구에서 눈을 포함하는 기준이 될 수있다.
- (통상 1 주일 후 분사함으로써) 기준선 압력 복귀가 연구에 포함되지 않아야 감아, 그러나 원하는 경우 높은 IOP를 개발하는 데 실패 눈에 다시 주입 비드 할 수있다.
- 실험의 끝에 CO 2 질식에 의해 동물을 안락사.
- 눈 및 시신경을 해부하고, 밤새 더 조직학 분석을 위해 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 고정한다.
2. TUNEL S를 사용하여 망막 신경 세포 손상 평가함유 성
- 제조업체의 지침에 따라, 단말기 데 옥시 뉴 클레오 타이 딜 트랜스퍼 중재 dUTP를 닉 라벨 (TUNEL) 분석 retinasuse 전체 마운트에서 사멸 세포를 정량화합니다.
- 인산 0.3 % 트리톤 X-100에 3 × 5 분 완충 식염수 (T-PBS)를 세척, 아이 컵에서 망막을 해부하다.
- 2 시간 동안 3 % T-PBS에서 조직을 Permeabilize 하시려면.
- 37 ° C에서 1 시간 동안 TUNEL 반응 용액에서 배양하기 전에, 10 분 동안 평형 완충액 망막 전 평형.
- 0.3 % T-PBS 5 μM DAPI를 포함하는 린스, 0.3 % T-PBS에서 3 × 5 분 동안 조직을 씻고 설치 미디어에서 평면 마운트합니다.
- TUNEL 긍정적 인 핵는 20 배 배율에서 신경절 세포 계층을 통해 10 μm의 Z - 스택을 취할 공 초점 현미경을 사용하여 정량화합니다. 전체 MOUN 당 12 이미지의 총을주고, 망막의 먼 주변에 중반 주변에, 시신경에 가까운 장소에서, 4 꽃잎에 각각 3 이미지를 가지고,t는 약 7000 세포를 샘플링. 형태 학적 기준은 신경 세포에서 비 신경 세포 (내피 세포와 교세포) 세포를 차별.
- 치료 그룹에 만 DAPI 채널, 마스크 조사관을 사용하여 이미지를 선택 영역.
3. 톨루이딘 블루 염색을 사용하여 시신경 손상 평가
- 밤새 4 ° C에서 Karnovsky의 솔루션에 시신경을 수정합니다.
- 1 % (w / v)의 산화 오스뮴에서 2 시간 동안 처리하고, 표본을 100 % 에탄올로 탈수.
- 30 분 동안 프로필렌 옥사이드의 시신경을 품어, 프로필렌 산화물의 50:50 혼합 배치 : 아랄 다이 하룻밤.
- 하룻밤 60 ℃에서 배양 한 다음 100 % 아랄 다이에이 솔루션을 변경할 수 있습니다.
- 컷 semithin 섹션 (0.75 mm 두께)과 광학 현미경으로 검사하기 전에 50 % 에탄올 1 % 톨루이딘 블루 / 붕사 (TB)와 얼룩.
4. 통계 분석
- 통계 아나을 수행적절한 통계 소프트웨어 패키지를 사용 lyses. 뉴만 - Keul의 사후 시험과 양방향 ANOVA는 IOP는 경시 변화에 대한 통계적 유의성을 계산하는데 사용될 수있다.
- 0.05 미만의 P 값은 유의 한 것으로 간주 될 수있다.
Representative Results
홍채 각막 각도에 자석 구슬의 주입은 지속적으로 처음 지점 3 일 후 분사에서 쉽게 관찰 할 수 있었다 압력 연장하고 강력한 상승 (그림 1), 유도. 또한, 압력의 증가는 실험 기간 내내 유지하였고, 우리 시간 코스에서 18 일 후 분사가 완료되지만, 나머지는 압력이 장기간 지속 3 것으로보고있다. 안압은 컨트롤 실험의 전체 길이에 걸쳐 평균 비 - 주입 된 비드는 비드 눈 주입 눈 40.5 ± 2.8 mmHg로 (P <0.001)에 비해 19.7 ± 0.3 mmHg로 하였다. 또한, 피크 안압은 49.9 ± 2.3 mmHg로 22.8 ± 0.3 mmHg로 증가.
안압의 상승이 망막 신경절 세포의 죽음에 이르게 여부를 확인하기 위해, 우리는 (그림 2) 가로 시신경 섹션에 TUNEL 망막에 염색 및 조직학을 수행 하였다. 망막에서 우리는 높은 안압 비드 주입 눈에 TUNEL 염색 (그림 2A)의 증가를 관찰했다. (; P <0.05도 2B) 사멸 핵의 수는 고혈압 망막 24.5 ± 0.5 세포, 대측 대조군에서 1.6 ± 0.5에서 세포를 약 15 배 증가했다. 또한, 눈에있는 자석 구슬 주입되었지만 압력 (때문에 홍채 각막 각의 불완전 막힘 가능성) 증가하지 않았다, TUNEL 양성 세포의 수는 uninjected 제어 (P> 0.05)과는 유의 한 차이가 없었다. 이는 세포사가 자성 미립자의 직접적인 독성에 기인하지 압력 증가와 관련되었음을 시사한다. 마지막으로, 우리는 녹내장 모델에서 시신경 병변을 조사하고, 이들 세포 과정 (그림 2C)의 변성을 나타내는, 축삭의 많은에 톨루이딘 블루의 축적을 보았다.
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전방에 자기 마이크로 스피어 그림 1. 자기 마이크로 스피어를 사용하여 안압 상승. 주입 반대측 제어, 비 주입 눈에 비해 안압 (IOP)의 강력한 상당한 상승을 유도. Y 축 단위 = 밀리미터 (수은 밀리미터) 수은. 데이터는 = ± SEM을 의미한다. * = P <0.001;. N = (12)이 수치는 폭스 톤 등, 암에서 수정되었습니다. J. Pathol 182 (4) :. 1379년에서 1390년까지.
신경절 세포 층 (GCL)에서 신경 세포의 죽음을 유도 홍채 각막 각도로 자기 미세 주입에 의해 안압 2. 고도 그림. (A) 제어 (왼쪽)와 녹내장 TUNEL (녹색에 의해 세포 사멸 핵 스테인드 (오른쪽) 눈에서 망막의 대표 이미지;안압 상승으로 세포 사멸 핵의 수가 증가 나타내는 흰색 화살표) 및 DAPI (파란색). (B) GCL의 TUNEL 양성 세포의 정량, 높은 안압 (가운데)와 눈에 비해 훨씬 더 많은 사멸 세포를 갖는다는 것을 확인 제어 (왼쪽). 대조적으로, 주입 된 비드 눈 압력 TUNEL 염색에서 유의 한 증가가 관찰되지 않았다 (오른쪽) 상승하지 않았다한다. 데이터는 = ± SEM을 의미한다. * = P <0.05; N = 7-8 (C) 대표 시신경 염색의 이미지, 녹내장 (오른쪽)에서 손상된 축삭의 톨루이딘 블루 축적의 증가 (검은 색 화살표)를 보여,하지만 제어하지 안 (왼쪽).. 스케일 바는 50 μm의 =. 이 수치는 폭스 톤 등 알에서 수정되었습니다., 오전. J. Pathol 182 (4) :. 1379년에서 1390년까지.
Discussion
여기서 우리는 눈의 전방 챔버로 자성 미립자를 주입하여, 래트에서 IOP 상승을 유도하는 방법을 보여준다. 이 방법을 수행하는 간단하고, 작은 수술 전문 지식을 필요로하거나 연습과 정제의 시간. 더욱이, 절차는 유효하다; 좀처럼 압력 강하고 견고한 상승 (약 10 % 재 주입 율)을 유도하기 위해 비드 단일 주입 이상을 필요로하지 않는다. 이 안압을 상승 유지하기 위해 여러 절차를 필요로 할 수있다 (11) 모델, 또는 레이저 광응고술 프로토콜 (6), 경화증 등의 기술적 도전 episceral 정맥 같은 기존의 유도 방법을 통해 이점을 제공 할 수있다.
그러나 성공하는 방법에 대한 위해 수행되어야 할 몇 가지 작은 중요한 단계가 있습니다. 첫째는 홍채 각막 각도로 구슬을 그릴 도넛 모양의 자석을 사용하는 것이 유용하다. 이 단계는 오리지널 프로토콜 어디 있나의 변형 인전자 구슬은 전방에 주입 한 다음 눈 3 주위에 자유를 이동했다. 토 로이드 자석을 사용하면 마이크로 최소한의 수동 재배포을 필요로 각도 주위에 균등하게 해결해야 함을 의미한다. 너무 느리고 불완전 주로 비드에 따르면, 잠재적 압력 상승도 선도 각도의 일측에 축적한다 - 두 번째로, 분사 속도는 빨라야한다. 하지만 일반적으로 말하면, 상기 방법은 사용자가 쉽게 아마도 IOP 상승의 정도를 변경하려고 시도하는, 미세 입자의 크기 또는 용적을 변화와 같은 프로토콜의 수정을 만들 수있을만큼 간단하다.
그러나, 방법의 잠재적 인 단점 중 하나는 우리가 관찰 사례의 약 5 ~ 10 %에서 60 mmHg로 위에 올랐다 고혈압의 정도를 통해 작은 제어 할 수 있다는 것입니다. IOP의 과도한 상승은 망막 조직에 매우 파괴적 일 수 있고, 메커니즘 및 바이오 연구를 만들 수 있습니다세포 사멸의 말의 뜻은 도전. 그러나, 상기 방법은 약리학 적으로 조작 할 수있다 (12) 망막 및 시신경 모두에서 일관된 신경 병리를 생성한다. 이는 녹내장 치료를위한 새로운 치료제 개발을위한 모델이 매력적으로 만들 수 있습니다. 비즈 홍채 각막 각도에 지시하기 때문에 또한,이 망막 또는 시신경 유두의 라이브 영상 무료 시축을 떠난다. 우리는이 모델 적응 및 마우스를 포함하는 다른 종의 미래 응용에 사용될 것으로 예상된다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 - 300g female Brown Norway ex-breeder rats | Harlan UK | 203 | |
| Tonolab Rebound Tonometer | Tiolat | TV02 | |
| Ketaset (ketamine) | Fort Dodge Animal health | BN1000118 | 37.5 mg/kg |
| Domitor (medetomidine hydrochloride) | Orion Pharma | 140-999 | 0.25 mg/kg |
| Povidone iodine | Ecolab | BN4369LE10 | 5% in H2O |
| Minim's Saline Solution | Bausch and Lomb | PL00033/5017 | |
| Toroidal magnet | Supermagnete | R-10-07-03-N | |
| Magnetic Microspheres | Bangs Laboratories | UMC4N/9692 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| 33 G beveled needle | Hamilton | 7747-01 | Custom needle |
| Luer tip syringe | Hamilton | 80601 | |
| Antisedan (atipemezole hydrochloride ) | Orion Pharma | 141-003 | 0.25 mg/kg |
| Chloramphenicol ointment | Medicom | 18956-0005 | |
| TUNEL staining kit | Promega | G3250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Vectashield mounting media | Vector Labs | H-1000 |
References
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