Introduction
原发性青光眼是一种破坏性的眼科疾病在世界各地1影响的估计6050万的人，这可能会导致生命改变的视力下降和失明2。研究这种疾病的机制，以及新的治疗青光眼的发展，是依赖于疾病的良好模型其中概括一些病理的标志。
我们在这里提出一个大鼠青光眼模型基于Samsel 等人的方法。3本技术的总的目标是通过注入磁性微球进入前房，并使用磁性环，直接增加的眼内压（IOP）的眼睛他们到虹膜角膜角。这阻碍了含水流出，从而增加了眼压，导致神经元损伤和细胞损失。该协议被开发，以试图提供青光眼的一个更简单的，可诱导的模型。
这个协议可以具有一些优点在现有的技术。可用，不需要的程序，启动基因小鼠模型，如DBA / 2J;然而，这些可能有不可预知的发病进展4。与此相反，可诱导的模型，其中大部分依赖于手术升降眼压在啮齿类动物，有引发可以由用户来控制的优点。其中一些方法可以具有它们自己的缺点然而，包括在技术上具有挑战性的5，并且可需要多个程序，以维持高眼压6。
与此相反，在该手稿详述的诱导方法是一种产生稳定的，坚固的增加的压力，以对回注最小需要简单，有效，和可重现的技术。此外，它不涉及昂贵的设备，并且仅需要基本的手术技巧来执行。该协议可能是适当的读者谁是寻求建立一个不太技术要求诱导青光眼模型在他们的实验室。
Protocol
伦理学声明 ：所有的动物实验均按照该机构动物护理和使用委员会（IACUC）已经进行，并批准了与英国内政部的指导方针一致（ http://goo.gl/FLkirW ，上次访问10 日止 ，2014年）和ARVO声明动物的眼科和视觉研究（使用http://goo.gl/4LFOjD ，上次访问10 日 2014年6月，）。
1.高眼压感应
- 通过提高经由单侧注射顺磁性微球的眼内压（IOP）到棕色挪威大鼠前房，基于Samsel 等人的方法中诱导实验性青光眼。3的其它着色大鼠可以是合适的，尽管这些将需要进行验证首先由用户设定。
- 楼250-300克重的雌前饲养员布朗Norway大鼠中的恒定的低光环境（40-60勒克斯），以在眼压7最小化昼夜的波动，以获得食物和水随意 。
- 就拿基线眼压测量清醒动物8前麻醉和注射珠，利用反弹眼压计校准大鼠的眼睛9使用。眼压取为5个读数的平均值。
- 麻醉大鼠37.5毫克/公斤氯胺酮，并发表腹腔0.25毫克/公斤盐酸美托咪定。通过测试动物的后足反射确定麻醉深度，聚维酮碘的应用程序（见步骤1.5），和珠注射之前（见步骤1.8）。管理0.5％盐酸丙美卡因镇痛。
注：在任何阶段不要扩张瞳孔。这将有助于珠粒沉降更好入虹膜角膜角，并防止结合到透镜。适用于眼软膏以防止非手术对侧眼的角膜干燥。 - W¯¯灰手术眼用5％聚维酮碘在水注射前10 5分钟。
- 5分钟后，灯芯的聚维酮碘断用无菌纱布，并用0.9％无菌盐水的溶液洗眼睛。保持眼部麻醉用无菌生理盐水常规应用过程中湿润。
- 将眼睛周围的环形磁铁。
- 注入25μl的含30毫克/毫升的γ-照射消毒的Hank氏平衡盐溶液（HBSS）8微米的磁性微球进入前房，用33克斜口针的溶液中。
- 为了制备珠，通过再悬浮洗涤，然后离心3次以10,000×g离心5分钟，用1ml HBSS，使最后的30毫克/毫升溶液之前。保持整个无菌条件。
- 对于注射，要小心避免插入针虹膜，尽量减少虹膜损伤的风险。这可以通过定向针正切于角膜表面被防止，为平行于虹膜越好。这也将有助于减少从注射部位珠损失。
注：注入珠以极快的速度，以确保均匀围绕虹膜角膜角，这是为了提高眼压关键分布。此外，存储珠，针头和磁性环分开，使得所述珠不形成簇，使得它们难以加载到注射器中，并注入，以及针不会被磁化。
- 留针到位1分钟后注射，以确保珠融入了房角从小梁阻碍房水引流。稍后角珠针已初步解决，使水的一些泄漏，最大限度地减少瞬时增加IOP。在手术结束时通过冲洗将针与第一磷酸盐缓冲盐水（PBS），然后70％的乙醇，随后用蒸馏水，以确保继续使用在分开的程序针。可替代地，人们可以使用如果正确的计和注射器组合是可用的一次性针头。可选：针可以使用beveller延长它们的使用被激化。
- 在此阶段，如果需要，除去磁体，并用它来绘制珠粒成不完全覆盖的区域。
- 离开磁铁在眼睛周围的地方为另外的10分钟后喷射，确保珠粒沉降顺利进入虹膜角膜角。
- 使用0.25毫克/公斤盐酸反atipemezole麻醉。
- 辖氯霉素，或其他抗生素软膏，例如庆大霉素或土霉素局部，以防止感染，和0.5％的盐酸丙美卡因镇痛。离开动物恢复上热垫，直到他们恢复运动，然后转移到一个暖箱和供应额外的营养，比如辅食或蘸正常饮食，直到恢复完成。全身或局部镇痛应给动物手术后疼痛显示24小时的迹象。如果THESË症状持续，尽管治疗，动物应得到人道扑杀。
- 用对侧眼作为非工作的控制。
- 就拿IOP测量每2-3天珠给药后，每2-3天使用后的反弹眼压计校准大鼠的眼睛9使用。
- 的标准，包括眼睛的研究中可以是：如果1）眼压升高对侧控制压力之上5毫米汞柱，和2）不超过60毫米汞柱。
- 眼睛其中压力恢复到基线（通常1周后喷射）不应该被包括在研究中，但也可以在眼睛失败，如果需要开发高眼压重新注入珠。
- 安乐死的动物用CO 2窒息在实验结束。
- 解剖眼睛和视觉神经，并在4％多聚甲醛（PFA）过夜进一步的组织学分析解决。
2.评估视网膜神经元损伤使用TUNEL S泰宁
- 为了量化凋亡细胞在整装retinasuse终端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记（TUNEL）测定中，根据制造商的说明。
- 解剖从眼罩视网膜，冲洗3×5分钟，在0.3％的Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水（T-PBS）中。
- 透在3％的T-PBS中的组织2小时。
- 在37℃预平衡的平衡缓冲液视网膜10分钟，温育在TUNEL反应溶液之前1小时。
- 洗净组织在0.3％T-PBS 3×5分钟，冲洗0.3％T-PBS含5μMDAPI，并在安装媒体平板安装。
- 量化TUNEL阳性细胞核使用共聚焦显微镜拍到10微米的z栈通过神经节细胞层，在20X放大倍数。取3个图像上每个4花瓣，在站点靠近视神经，在中间周，并在视网膜的远边缘，总计每整MOUN 12的图像T，采样约7000细胞。形态学标准区分非神经元（内皮细胞和神经胶质细胞），从神经元细胞。
- 仅使用DAPI通道，并且掩模研究者对治疗组进行摄像选择区域。
3.评估视神经损害使用甲苯胺蓝染色
- 修复视神经一夜之间在4℃Karnovsky的解决方案。
- 在1％（重量/体积）的四氧化锇处理试样2小时，然后脱水在100％乙醇。
- 孵育视神经中的氧化丙烯30分钟，并将其放置在环氧丙烷的50:50混合物：ARALDITE过夜。
- 过夜，在60℃下改变该溶液至100％ARALDITE，接着培养。
- 切半薄切片（0.75毫米厚），并染色，用1％甲苯胺蓝/硼砂（TB）的在50％乙醇考试之前通过光学显微镜。
4.统计分析
- 进行统计语录裂解用适当的统计软件包。双向ANOVA和纽曼-Keul的事后检验可以用于计算统计学显着性为眼压随时间而改变。
- 小于0.05的p值可以被认为是显著。
Representative Results
注射磁珠进虹膜角膜角一致诱导延长的和强大的压力升高（ 图1），这是很容易观察到，在第一时间点，3天注射后。此外，增加的压力保持在整个实验期间，虽然我们的时间过程完成18天注射后，其他人报告说，压力仍然存在长期3。平均眼压的平均值在实验进行控制的全长，非珠注射的眼中是19.7±0.3毫米汞柱，具有40.5±2.8毫米汞柱的胎圈注入眼（P <0.001）。此外，峰值眼压从22.8±0.3毫米汞柱上升至49.9±2.3毫米汞柱。
以确定在眼压仰角是否导致视网膜神经节细胞的死亡，我们进行了TUNEL染色在视网膜，和组织学上横向视神经部分（ 图2）。在视网膜我们观察到在珠注射的眼中的增加TUNEL染色（ 图2A）与高眼压。凋亡细胞的数量增加约15倍，从1.6±0.5细胞对侧控制，为24.5±0.5个细胞在高血压视网膜（ 图2B; P <0.05）。此外，在眼，其中磁珠注射但压力没有增加（可能是由于虹膜角膜角的不完全堵塞），TUNEL阳性细胞的数量并没有显著不同于未注射的对照组（P> 0.05）。这表明，细胞死亡有关的压力增加，而不是由于在磁性微球体直接毒性。最后，我们研究了视神经病变在青光眼模型，看见甲苯胺蓝的蓄积在许多轴突，表明这些细胞过程（ 图2C）的变性。
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图1.高程的使用磁性微球体眼压升高。注射的磁性微球进入前房诱导健壮，显著升高的眼内压（IOP）相比，对侧对照，未注射的眼睛。 Y轴单位=毫米汞柱（毫米汞柱）。数据=平均值±SEM。 * = P <0.001，N = 12，这个数字已经被修改福克斯顿等，Am。病理学杂志182（4）：1379年至1390年。
图2.高程眼压通过注射的磁性微球到虹膜角膜角，诱导的神经元死亡的神经节细胞层（GCL）。 （A）从控制（左）和青光眼（右）眼用TUNEL（绿色染色凋亡细胞核视网膜的代表图像;白色箭头）和DAPI（蓝色），表明凋亡细胞核的数量增加为眼压上升。（B）中的TUNEL阳性细胞的GCL定量，显示出眼高眼压（中），在比较有显著更多细胞凋亡，以控制（左）。与此相反，在珠注射的眼中，其中压力没有上升（右），在TUNEL染色没有显著增加了观察。数据=平均值±SEM。 * = P <0.05; N = 7 - 8（C）的视神经染色的代表性图像，表明来自青光眼（右）的增加甲苯胺蓝累积（黑色箭头）中受损轴突，但不控制眼睛（左）。比例尺= 50微米。这个数字已经被修改福克斯顿等人 ，上午。病理学杂志182（4）：1379年至1390年。
Discussion
在这里，我们证明用于诱导高眼压在大鼠，注射的磁性微球到眼睛的前房的方法。这种方法是简单的开展，并要求小的手术经验，或实践和细化小时。此外，该过程是有效的;很少需要多于单次注射的珠诱导强，健壮的压力升高（约10％的回注率）。这可以提供优于现有诱导方法，如在技术上具有挑战性episceral静脉硬化11模型，或激光光凝协议6，它可以要求以维持升高的IOP的多个程序。
为了不过是成功的方法中，有一些需要采取一些小的关键步骤。首先，它是非常有用的，以使用一个环形的磁铁吸引小珠到虹膜角膜角。这一步是原始协议，wher的变形E中的珠粒分别注入前房，然后移至徒手眼部周围3。使用环形磁铁意味着微球应该解决周围均匀的角度，需要最少的手动重新分配。其次，注入的速度要快 - 太慢和珠粒将主要积聚在角的一侧，导致不完整的覆盖，并有可能没有压力上升。一般来说，虽然，该方法是足够简单的，用户可以很容易地进行修改的协议，如改变微球粒的尺寸或体积，也许试图改变IOP升高的程度。
然而，该方法的一个潜在的缺点是一个具有很少的控制高血压，这在大约5-10％，我们观察到的情况下上升到超过60毫米汞柱的范围内。眼压过度升高可以很破坏视网膜组织，而且可能使学习机制和生物细胞死亡的迟缓挑战。然而，该方法产生一个一致的神经病理学，无论是在视网膜和视神经，其可药理学12被操纵。这可能使开发创新疗法用于治疗青光眼模型的吸引力。另外，由于珠引导到虹膜角膜角，这留下自由为视网膜或视神经乳头的实时成像的视轴。我们预计，这种模式将进行调整和用于其他物种未来的应用，包括鼠标。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 - 300g female Brown Norway ex-breeder rats | Harlan UK | 203 | |
| Tonolab Rebound Tonometer | Tiolat | TV02 | |
| Ketaset (ketamine) | Fort Dodge Animal health | BN1000118 | 37.5 mg/kg |
| Domitor (medetomidine hydrochloride) | Orion Pharma | 140-999 | 0.25 mg/kg |
| Povidone iodine | Ecolab | BN4369LE10 | 5% in H2O |
| Minim's Saline Solution | Bausch and Lomb | PL00033/5017 | |
| Toroidal magnet | Supermagnete | R-10-07-03-N | |
| Magnetic Microspheres | Bangs Laboratories | UMC4N/9692 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| 33 G beveled needle | Hamilton | 7747-01 | Custom needle |
| Luer tip syringe | Hamilton | 80601 | |
| Antisedan (atipemezole hydrochloride ) | Orion Pharma | 141-003 | 0.25 mg/kg |
| Chloramphenicol ointment | Medicom | 18956-0005 | |
| TUNEL staining kit | Promega | G3250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Vectashield mounting media | Vector Labs | H-1000 |
References
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