Summary
L'objectif de ce protocole est d'induire photochimique lésion ischémique du nerf optique postérieure chez le rat. Ce modèle est essentiel à l'étude de la physiopathologie de la neuropathie optique ischémique postérieure, et des approches thérapeutiques pour ceci et d'autres neuropathies optiques, ainsi que d'autres maladies ischémiques du système nerveux central.
Abstract
Postérieure neuropathie optique ischémique (PION) est une maladie de la vue dévastateur dans la pratique clinique. Cependant, sa pathogénie et d'histoire naturelle sont restés mal compris. Récemment, nous avons développé un modèle fiable, animal reproductible de PION et testé l'effet du traitement de certains facteurs neurotrophiques dans ce modèle 1. Le but de cette vidéo est de démontrer notre modèle photochimique induite de neuropathie optique ischémique postérieure, et d'évaluer ses effets avec marquage rétrograde des cellules ganglionnaires de la rétine. Suite à l'exposition chirurgicale du nerf optique postérieure, d'un colorant photosensibilisant, l'érythrosine B, est injecté par voie intraveineuse et un faisceau laser est focalisé sur la surface du nerf optique. Interaction photochimique de l'érythrosine B et le laser pendant dommages d'irradiation de l'endothélium vasculaire, incitant occlusion microvasculaire médiée par une thrombose plaquettaire et la compression oedémateux. La lésion ischémique résultant donne une progressive mais pronounced dépérissement rétinienne des cellules ganglionnaires, en raison d'une perte d'entrée axonale - une distance, induite par blessure et le résultat clinique. Ainsi, ce modèle fournit une plate-forme nouvelle pour étudier le cours de physiopathologique Pion, et peut être en outre optimisée pour tester approches thérapeutiques pour neuropathies optiques ainsi que d'autres maladies ischémiques du système nerveux central.
Introduction
Chez les patients âgés de plus de 50 ans, une neuropathie optique ischémique (ION) est le type le plus répandu de l'optique aiguë neuropathie 2. La condition peut présenter comme l'un des deux sous-types en fonction de la source d'approvisionnement spécifique affectée de sang et la présentation clinique: antérieure (AION) ou postérieure (PION) 3. Bien que la pathogenèse et l'évolution de AION ont été largement étudiés 4-7, PION est restée mal comprise en raison de sa faible prévalence, la présentation de variable, les critères de diagnostic mal définies et le manque d'un modèle animal. En outre, aucun des traitements ont été prouvées pour prévenir ou inverser la perte de la vision de AION ou PION efficacement. Par conséquent, un modèle animal reproductible et fiable des PION est d'une grande valeur pour étudier le processus de la maladie in vivo et de tester de nouveaux schémas thérapeutiques pour la neuroprotection et la régénération des axones.
Photochimique induite par une lésion ischémique à la microvascularisation résultant en vasogenic oedème et la thrombose crée effectivement une ischémie tissulaire régionale 8-12. Après l'injection dans la circulation vasculaire, le colorant photosensible érythrosine B produit de l'oxygène moléculaire singulet réactif lors de l'activation par irradiation au laser des vaisseaux cibles. L'oxygène singulet peroxidizes directement l'endothélium vasculaire, en stimulant l'adhésion plaquettaire / agrégation et conduisant à la formation de thrombus occlusif. Lésion ischémique est étendue à des régions voisines et exacerbée par la compression microvasculaire due à un œdème vasogénique. L'objectif global de ce protocole est d'induire une ischémie photochimique dans le nerf optique rétrobulbaire pour refléter les dommages causés par PION.
A notre connaissance, ceci est le premier modèle de lésion ischémique dans la partie postérieure du nerf optique 1. Comme ce modèle produit une ischémie, tout en évitant les traumatismes physiques, les processus physiologiques de la neuropathie optique ischémique postérieure sont mieux imité et étudiés. En outre, ce modèle offre un roman plate-forme pour le dépistage de produits thérapeutiques candidats pour les neuropathies optiques ischémiques et d'autres maladies du système nerveux central. Ici, un protocole détaillé pour le cathétérisme de la veine fémorale, l'exposition du nerf optique, une injection intraveineuse d'érythrosine B et l'irradiation du laser dans un modèle de rat de pions sont décrits.
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Protocol
Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par l'Université de Californie à San Diego et l'Université de Miami protection des animaux et des comités d'utilisation (IACUC) et réalisées en conformité avec la Déclaration ARVO pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et de la recherche visuelle. Tous les réactifs et les instruments utilisés dans les procédures chirurgicales sont stériles.
1. Anesthésier et préparer le Rat pour la chirurgie
- Avant l'intervention, les rats sont anesthésiés avec une injection intraperitoneale de kétamine (60 mg / kg) et de xylazine (8 mg / kg) en fonction du poids corporel. Une profondeur adéquate de l'anesthésie doit être déterminée par une réponse négative à pincement de l'orteil stimulus.
- Une fois anesthésié, tirer la langue en avant pour éviter l'asphyxie et d'appliquer une pommade lubrifiante pour les deux yeux pour éviter le dessèchement de la cornée pendant la chirurgie.
- Rasez les sites chirurgicaux en utilisant une tondeuse à cheveux et essuyez la zone trois fois avec une solution détergente de providone iodée 10% et 70% d'éthanol.
- Drapé til animaux dans un champ stérile. Gants stériles et les instruments chirurgicaux sont utilisés au cours de la chirurgie de la survie. Re-stériliser les conseils d'instruments utilisant un stérilisateur de perles chaud entre les animaux.
2. Approche chirurgicale
- PION induction
- Fémorale cathétérisme de la veine
- Préparer et nettoyer le site chirurgical. Rasez la cuisse intérieure droite en utilisant une tondeuse à cheveux et essuyez la zone trois fois chacun avec une solution détergente de providone iodée 10% et 70% d'éthanol.
- Préparer le tube. Couper une longueur de 40 cm d'un tube en polyethylene (PE 10) stérilisé dans 70% d'éthanol. Rincer la tubulure avec une solution saline et le connecter à une seringue de 1 ml contenant une solution pré-mesurée de 2% érythrosine B colorant (1 ul / mg, ce qui donne une dose de 20 mg / kg de poids corporel). Monter la seringue dans un pied-interrupteur commandé pompe à perfusion à un débit de 600 pi / min.
- En utilisant une lame n ° 15, faire une petite incision horizontale aula base de la cuisse droite. Couper et répandre la membrane à l'intérieur et nettoyer la zone avec des cotons-tiges stériles.
- Séparer le muscle avec des pinces jusqu'à ce que la branche de la veine fémorale est visible. Une gaine entoure l'artère, une veine et le nerf. Pincez et tirez cette gaine vers le haut avec une pince (forceps à pointe fine Dumont), et couper une petite incision (2-4 mm est généralement suffisant) près de la base de la cale de forme triangulaire avec Vannas ciseaux à ressort. Développer la coupe comme nécessaire.
- Séparer la veine et l'artère d'un micro-crochet chirurgical émoussé parallèle à la direction de la veine. Veillez à ne pas endommager la membrane et la veine branches délicates. Puis, soulevez doucement la veine et le séparer du tissu conjonctif sous-jacent.
- Obtenir une suture de nylon sans aiguille et le placer à côté de la veine fémorale. Utilisation de la micro-chirurgicale crochet, élever la veine et passer les pinces à pointe fine sous la région distale. Prenez une extrémité de la suture et tirez-le sous leveine. Ligaturer la veine distale étroitement. Passez une seconde suture d'une manière similaire en vertu de la veine proximale et faire un noeud lâche.
- Faire une petite incision dans la veine près de la ligature distale avec Vannas ciseaux à ressort. Développer le trou si nécessaire avec la pince à pointe fine. Du sang peut fuir à travers la coupe. Nettoyez la zone chirurgicale avec le froid, BSS stérile et des cotons-tiges stériles.
- En tenant la paroi de la veine au niveau du bord de la découpe, cathétériser le vaisseau avec le tube de solution saline préparée rincé au moyen d'un porte-aiguille. Serrez le noeud proximale autour de la veine et les tubes. Ensuite, ancrer le tube en le liant à la suture distale.
- Vérifiez la qualité de l'cathétérisme en appuyant sur le commutateur au pied pour injecter une solution saline, <1 ml est suffisante. Assurez-vous que le tube est dégagée et n'a pas de fuites. Fermer temporairement l'incision avec des sutures pour protéger le cathétérisme et de tissus.
- Exposition du nerf optique
- Prepare site chirurgical en essuyant la zone de pré-rasé dessus de l'oeil gauche trois fois chacun avec une solution détergente de providone iodée 10% et 70% d'éthanol.
- Faire une incision le long de la peau 2-3 mm derrière l'œil avec une lame n ° 15. Pincez et soulevez le tissu conjonctif avec des pinces dentelées, et faire une petite incision avec Vannas ciseaux à ressort. Cette petite incision est généralement d'environ 5 mm de longueur, mais peut être plus long pour fournir une plus grande exposition pour un chirurgien dans la formation. Continuer à disséquer carrément à travers le tissu conjonctif le long du bord supérieur de l'os orbital, en prenant soin d'éviter de perturber les vaisseaux sanguins. Nettoyez la zone chirurgicale avec des cotons-tiges.
- Disséquer vers le bas à travers la conjonctive jusqu'à ce que le muscle droit supérieur est visible. Pincez et de disséquer à travers le muscle; le muscle sera libéré au plus profond de l'orbite. Or, les tissus environnants peuvent être utilisées pour aider à la rétraction et l'élévation de l'œil pour faciliter la visualisation.
- Rétracter le lambeau de peau et du tissu conjonctif latéralement et vers le bas, et de maintenir en place avec une suture et hémostatique. Cela va tourner l'œil avant et en dehors afin de révéler la gaine contenant de la graisse qui entoure le nerf optique.
- Insérez délicatement une paire de pinces acérées et développer parallèlement au nerf optique pour séparer le tissu conjonctif entourant la gaine. Ne pas toucher le nerf optique avec les bouts pointus de la pince.
- Une longueur de 5 mm du nerf optique et de la gaine entourant doit maintenant être visible. Un réseau de micro-vaisseaux sur la surface de la gaine entoure le nerf optique. Ceux-ci seront ciblés lors de l'irradiation laser.
- L'injection intraveineuse d'érythrosine B et l'irradiation laser
- Porter des lunettes de couleur orange sécurité en tout temps pendant le fonctionnement de l'appareil d'irradiation laser pour vous protéger de la lumière laser vert. Allumez le laser, ouvrir l'obturateur et ajuster la crête et moyenne powers du laser nécessaire. Fermez le volet.
- Positionner le rat dans l'appareil d'irradiation laser. Pour assurer le placement de faisceau approprié, un faible faisceau de visée est produit par filtrage spatial du laser à travers un trou de 100 um de diamètre percé dans la lame de volet fermé. Re-exposer le nerf optique avec une paire de pince fine pointe, et positionner le faisceau de visée sur le nerf optique intraorbitaire entre 3 mm et 4 mm derrière la tête du nerf optique.
- Injecter la solution d'érythrosine B à 2% par activation de la pompe de perfusion. Il peut circuler pendant quelques secondes pendant que le chirurgien ajoute une petite goutte de BSS pour humidifier la surface du nerf optique.
- Vérifiez la position du faisceau de visée et puis cliquez sur le commutateur au pied pour lancer l'irradiation. Un filtre de sécurité de couleur orange, qui est ajouté dans le chemin optique du microscope, déclenché sera immédiatement suivie par l'ouverture de l'obturateur après un délai d'une seconde.
- Irradier le nerf optique depuis 90 sec avec une puissance de crête de 135 MW et une puissance moyenne de 18mW produit par un hacheur de faisceau tournant à 250 Hz avec un rapport cyclique de 15% (ce qui réduit au minimum les effets thermiques). Fluorescence jaune, orange vif comme visualisé à travers le filtre de sécurité, sera émise à partir de la surface supérieure du nerf optique et est suffisante pour assurer que le faisceau irradie le nerf symétriquement.
- Après l'irradiation, le filtre de sécurité de couleur orange ouvrira automatiquement. Microhemorrhage peut être observée dans certains cas.
- Soulager la traction sur les muscles oculaires supplémentaires et retourner l'œil à une position neutre. Fermer l'incision avec des sutures interrompues. Ensuite, retirer le cathéter et attacher la veine fémorale étroitement pour éviter les fuites; fermer avec des sutures interrompues. Appliquer une pommade antibiotique pour les deux incisions. Vérifiez le fond pour vérifier l'intégrité vasculaire de la veine centrale de la rétine et de l'artère.
- Fémorale cathétérisme de la veine
- Marquage rétrogradedes cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) NOTE:. Afin d'évaluer la survie RGC, marquage rétrograde avec FluoroGold (FG) devrait être achevée une semaine avant PION. La méthode est décrite en détail dans le protocole JoVE 819 13.
- En bref: anesthésier l'animal avec de la kétamine (60 mg / kg) et de xylazine (8 mg / kg) et de se raser la tête.
- Frotter chirurgicalement le site d'incision et de faire une incision médiane sur la tête pour exposer le crâne.
- Percer des trous bilatéraux à travers le crâne (ø 2x2 mm) de 0,5 mm à la fois les sutures sagittale et transversales.
- Aspirer soigneusement le contenu cérébral qui se trouve sur la surface dorsale de la colliculus supérieur (SC) en utilisant une pompe à vide. Ensuite, placez un petit morceau de Gelfoam imbibé de 4% FG sur la surface de la SC.
- Fermer l'incision avec des sutures et des soins pour l'animal en utilisant les soins postopératoires standard.
- Soins post-opératoires et l'euthanasie
- Après la chirurgie, placer animal dans une cage séparée propre au-dessus d'un tampon de l'eau de recirculation chauffé jusqu'à ce que l'animal est récupérée.
- Analgésiques post-chirurgicales (HCl buprénorphine, 0,01 mg / kg) doit être administré deux fois par jour pendant trois jours consécutifs pour minimiser l'inconfort.
- Rat doit être conservé séparément et observé jusqu'à ce qu'ils soient en mesure de maintenir décubitus sternal et reprendre conscience suffisante.
- Les signes de reprise et une bonne santé sont suivis quotidiennement pendant au moins 5 jours après la chirurgie, ou jusqu'à ce que l'enlèvement de sutures et la guérison adéquate du site chirurgical, selon la dernière.
- Euthanasier les animaux par perfusion avec 4% de PFA à des points de temps scientifiquement appropriées après la chirurgie fonction de l'intérêt d'enquête.
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Representative Results
La lésion ischémique résultant induit par cette technique donne une mort progressive mais prononcé de cellules ganglionnaires rétiniennes après une lésion ischémique axone. Ceci est un résultat cliniquement significatif similaire à celle observée dans la maladie humaine. FG marquage rétrograde est utilisée pour quantifier la survie RGC après PION. La même méthode est utilisée pour valider une création de modèle de réussite ainsi que pour évaluer les effets de différents régimes thérapeutiques. La figure 1 montre des images confocales représentatives de cellules FG-positifs dans les montures plates rétiniennes de contrôle (figure 1A), traité fictivement (laser seulement / pas érythrosine B, figure 1B), et 2 semaines post-PION-traitées (figure 1C) animaux. Par rapport aux animaux témoins, moins de cellules FG-positifs sont présentes chez les animaux 2 semaines après induction PION. Aucune différence significative entre le nombre de CGR dans le contrôle et traité fictivement (laser seulement / non érythrosine B) des animaux est observée. This indique que la perte RGC induite Pion-est provoquée par la combinaison de l'érythrosine B et l'irradiation au laser, au lieu de l'énergie thermique du laser seul.
Figure 1. cellule ganglionnaire (RGC) survie après postérieure neuropathie optique ischémique (PION). Les cellules ganglionnaires rétiniennes marqués de façon rétrograde avec Fluorogold ont été imagées dans les montagnes plates rétiniennes (AC). Deux semaines après PION, un nombre similaire de CGR est observée dans le contrôle (A) et traité fictivement (B, laser ne / ne érythrosine B) yeux. Cependant, le nombre de RGC de Fluorogold marqué est nettement réduite dans le cadre de Pion (C). Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
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Acknowledgments
Nous sommes redevables à Eleut Hernandez pour l'élevage, Gabe Gaidosh d'expertise de la microscopie et Khue Tran et Zhenyang Zhao pour le montage vidéo. Cette étude a été financée par le National Eye Institute accorde R01-EY022129 à JLG et subventions P30 EY022589 à l'UCSD et EY014801 à UM; l'American Heart Association, la Fondation Jacques et Esther roi, le fonds du programme d'échange d'étudiants de doctorat de l'Université Fudan Graduate School (n ° 2010033), et une subvention sans restriction de la recherche pour prévenir la cécité, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 532-nm Nd:YAG laser | Laserglow | LRS-532-KM-200-3 | |
| Beam chopper | custom-made | custom-made | |
| Mechanical shutter and corresponding shutter drive timer | Vincent Associates | SD-10 | |
| 25-cm focal length spherical lens | CVI/Melles-Griot | 01 LPX 293 | plano-convexBK7 glass lens with HEBBARTM antireflection coating |
| Erythrosin B | MP Biomedicals | 190449 | |
| Fluorogold | Fluorochrome,LLC | ||
| Gelfoam | Cardinal Health | CAH1203421 | |
| Polyethylene tubing (PE10) | BD Intramedic | 427400 | |
| No. 10 Blade | Miltex | 4-110 | |
| Fine Forceps | F.S.T. | 91150-20 | Dumont #5 rustless non-magnetic |
| Forceps with Teeth | F.S.T. | 11153-10 | Germany stainless |
| Forceps | F.S.T. | 18025-10 | Germany stainless |
| Vannas spring scissors | F.S.T. | 2-220 | JJECK Stainless |
| Polyglactin suture | Ethicon | J488G | 7-0 suture |
| hemostat | F.S.T. | 12075-12 | Germany stainless |
References
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