Rat Modell av fotokjemisk-Induced posterior iskemisk optikusnevropati

Summary

Målet med denne protokollen er å fotokjemisk indusere iskemisk skade på bakre synsnerven i rotte. Denne modellen er kritisk for studier av patofysiologien til bakre ischemisk optisk nevropati, og terapeutiske tilnærminger for dette og andre optiske neuropatier, så vel som av andre CNS-ischemiske sykdommer.

Abstract

Posterior iskemisk optikusnevropati (PION) er en sight-ødeleggende sykdom i klinisk praksis. Imidlertid har sin patogenesen og naturhistorie forble dårlig forstått. Nylig utviklet vi en pålitelig, reproduserbar dyremodell av PION og testet behandlingseffekten av enkelte neurotrofe faktorer i denne modellen ^en. Formålet med denne videoen er å vise vår fotokjemisk indusert modell av posterior iskemisk optikusnevropati, og å vurdere sine effekter med retrograd merking av retinal ganglion celler. Etter kirurgisk eksponering av det bakre synsnerven, et fotosensibiliserende fargestoff, erythrosin B, blir injisert intravenøst, og en laserstråle fokuseres på synsnerven overflaten. Fotokjemisk samspill av erythrosin B og laser under bestrålings skader blodåreendotelets, spørre microvascular okklusjon formidlet av trombose og edematous komprimering. Den resulterende iskemisk skade gir en gradvis, men pronounced retinal ganglion celle dieback grunn av et tap av aksonal innspill - en ekstern, skade-indusert og klinisk relevant resultat. Således tilveiebringer denne modellen en ny plattform for å studere den patofysiologiske forløpet av PION, og kan bli ytterligere optimalisert for testing av terapeutiske tilnærminger for optiske neuropatier, samt andre CNS-ischemiske sykdommer.

Introduction

Hos pasienter over 50 år gamle, er iskemisk optikusnevropati (ION) den mest utbredte typen akutt optikusnevropati ^to. Tilstanden kan presentere som en av to undertyper ifølge kilden til spesifikke berørte blodtilførsel og klinisk presentasjon: anterior (AION) eller posterior (PION) ^3. Mens patogenesen og forløp av AION har blitt studert ^4-7 har PION forble dårlig forstått på grunn av sin lav prevalens, variabel presentasjon, dårlig definerte diagnostiske kriterier og mangel på en dyremodell. Videre har ingen behandlinger vist seg å effektivt hindre eller reversere synstap fra AION eller PION. Derfor er en reproduserbar og pålitelig dyremodell av PION av stor verdi å studere sykdomsprosessen in vivo og teste nye terapeutiske regimer for neuroprotection og axon regenerering.

Fotokjemisk indusert iskemisk skade microvasculature resulterer i vasogENIC ødem og trombose skaper effektivt regional vevsischemi ^8-12. Etter injeksjon i det vaskulære sirkulasjon, produserer den lysfølsomme fargestoff erythrosin B reaktivt singlet molekylært oksygen ved aktivering av laserbestråling av mål-skip. Singlet oksygen peroxidizes direkte blodåreendotelets, stimulere blodplate tilslutning / aggregering og fører til okklusiv trombedannelse. Iskemisk skade er spredt til nærområder og ytterligere forverret av mikrovaskulær kompresjon på grunn vasogenic ødem. Det overordnede målet med denne protokollen er å fotokjemisk indusere iskemi i retrobulbar synsnerven å speile skader forårsaket av PION.

Så vidt vi vet, er dette den første modellen av iskemisk skade i bakre synsnerven ^en. Som denne modellen produserer iskemi samtidig unngå fysiske traumer, de fysiologiske prosessene i bakre iskemisk optikusnevropati er bedre etterlignet og studert. Dessuten tilbyr denne modellen en roman plattform for screening av kandidat therapeutics for optiske neuropathies og andre CNS iskemisk sykdom. Her er en detaljert protokoll for femoralvenepunksjon kateterisering, synsnerven eksponering, intravenøs injeksjon av Erythrosin B og laserbestråling i en rotte PION modellen beskrevet.

Protocol

Alle dyre prosedyrene ble godkjent av University of California San Diego og University of Miami institusjonell dyr omsorg og bruk komiteer (IACUC) og utført i samsvar med ARVO erklæringen for bruk av dyr i Ophthalmic og Visual Research. Alle reagenser og instrumenter som brukes i kirurgiske prosedyrer er sterile.

1. Anesthetize og Forbered Rat for kirurgi

1. Før fremgangsmåten, blir rottene bedøvet med en intraperitoneal injeksjon av ketamin (60 mg / kg) og xylazin (8 mg / kg) i henhold til kroppsvekt. Tilstrekkelig dybde av anestesi bør bestemmes av et negativt svar til tå klype stimulans.
2. Når bedøvet, trekke tungen fremover for å hindre kvelning og gjelder smøring salve til begge øynene for å hindre uttørking av hornhinner under operasjonen.
3. Barbere kirurgiske områder ved hjelp av en hårklipper og tørk området tre ganger med 10% providone-jod vaskemiddel, og 70% etanol.
4. Drape tHan dyr innenfor et sterilt felt. Sterile hansker og kirurgiske instrumenter brukes under overleve operasjonen. Re-sterilisere tips av instrumenter med en varm perle sterilisator mellom dyr.

2. Kirurgisk Approach

1. PION induksjon
   1. Femoralvenepunksjon kateterisering
      1. Forberede og rengjøre operasjonsstedet. Barbere høyre indre lår ved hjelp av en hårklipper og tørk området tre ganger hver med 10% providone-jod vaskemiddel, og 70% etanol.
      2. Forbered slangen. Skjær en 40 cm lengde av polyetylenrør (PE 10) steriliseres i 70% etanol. Spyl slangen med saltvann og koble den til en 1 ml sprøyte inneholdende en på forhånd målt oppløsning av 2% erythrosin B fargestoff (1 ul / mg, noe som ga en dose på 20 mg / kg kroppsvekt). Montere sprøyten inn en fot-bryteren kontrollert infusjonspumpe satt til en hastighet på 600 mL / min.
      3. Ved hjelp av en nr 15 blad, lage en liten horisontal snitt påbunnen av høyre lår. Klipp og spre membran inne og rengjøre området med sterile bomullspinner.
      4. Separer muskelen med pinsett til den grenen av lårvenen er synlig. En kappe omgir arterie, vene og nerven. Knip og trekke dette skjede oppover med tang (fin-tip Dumont tang), og skjær et lite snitt (2-4 mm er vanligvis tilstrekkelig) nær bunnen av den trekantede kile med Vännäs våren saks. Utvid kutt som er nødvendig.
      5. Separer vene og arterie med en stump mikro-kirurgiske krok parallelt med retningen av venen. Vær forsiktig så du ikke skader den delikate membran og vene grener. Deretter forsiktig løft venen og skille den fra den underliggende bindevev.
      6. Skaff en nålløs nylon sutur og plassere den ved siden lårvenen. Med micro-kirurgisk krok, heve venen og passere fin-tip pinsett under distal regionen. Grab den ene enden av sutur og trekk den underblodåre. Ligere venen tett. Passere en andre sutur på en tilsvarende måte under den proksimale venen og en løs knute.
      7. Lag et lite snitt i venen nær distal ligation med Vännäs våren saks. Utvide hullet som nødvendig med fin-tip pinsett. Litt blod kan lekke gjennom kutt. Rengjør kirurgiske området med kaldt, sterilt BSS og sterile bomullspinner.
      8. Holde blodåre veggen på kanten av kuttet, kateterisere fartøyet med den forberedte saltvann-spyles rør ved hjelp av en nål holder. Stram proksimale knute rundt venen og slangen. Deretter forankre slangen ved å binde den til den distale sutur.
      9. Sjekk kvaliteten kateterisering ved å trykke foten-bryteren for å injisere saltoppløsning, <1 ml er tilstrekkelig. Sørg for at slangen er fri og har ingen lekkasjer. Lukke midlertidig snittet med sting for å beskytte kateterisering og vev.
   2. Eksponering av synsnerven
      1. Prepare operasjonsstedet ved å tørke av pre-barbert området over det venstre øyet tre ganger hver med 10% providone-jod vaskemiddel, og 70% etanol.
      2. Lag et snitt langs huden 2-3 mm bak øyet med en nr 15 blad. Knip og løft bindevev med taggete tang, og lage et lite snitt med Vännäs våren saks. Dette lille innsnitt er vanligvis omtrent 5 mm i lengde, men kan være lengre for å gi større eksponering for en kirurg på trening. Fortsett å omsvøp dissekere gjennom bindevevet langs overlegen kanten av orbital bein, ta vare å unngå å forstyrre blodkar. Rengjør kirurgiske området med bomullspinner.
      3. Dissekere nedover gjennom konjunktiva til overlegen rectus muskelen er synlig. Knip og dissekere gjennom muskelen; muskelen vil bli frigjort fra dypt i banen. Nå kan omgivende vev benyttes for å hjelpe til med å tilbaketrekningen og heving av øyet for å lette visualiseringen.
      4. Reproselyttering klaffen av hud og bindevev sidelengs og nedover, og hold på plass med en sutur og hemostat. Dette vil rotere øyet fremover og utover for å avdekke det fettholdige kappe som omgir den optiske nerven.
      5. Sett forsiktig et par skarpe tang og utvide parallelt med synsnerven å skille bindevevet rundt skjeden. Ikke ta på synsnerven med den skarpe tuppen av tang.
      6. En 5 mm lengde på synsnerven og rundt skjede skal nå være synlig. Et nettverk av microvessels på kappen overflate omslutter den optiske nerven. Disse vil være rettet i løpet av laserbestråling.
   3. Intravenøs injeksjon av Erythrosin B og laserbestråling
      1. Slitasje oransje-farget vernebriller til alle tider når du bruker laseren bestråling apparat for å skjerme deg fra grønne laserlys. Slå på laseren, åpne lukkeren og justere topp og gjennomsnittlig powers av laseren som er nødvendig. Lukke lukkeren.
      2. Plasser rotte i laserbestråling apparat. For å sikre riktig plassering bjelke, er en svak sikter stråle produsert av romlig filtrering av laseren gjennom en 100 um diameter hull som er boret i den lukkede lukkerbladet. Re-utsett synsnerven med et par fin spiss tang, og plasser sikter strålen på intraorbital synsnerven mellom 3 mm og 4 mm bak synsnervepapillen.
      3. Injiser oppløsning av 2% erythrosin B via aktivering av infusjonspumpen. Det kan sirkulere i noen få sekunder mens kirurgen tilfører en liten dråpe BSS å fukte overflaten av den optiske nerven.
      4. Kontroller posisjonen til sikter strålen og klikk deretter foten-bryteren for å aktivere bestråling. Et orange-farget sikkerhetsfilter, som er lagt inn i den optiske banen til mikroskopet, vil umiddelbart utløste fulgt av åpning av lukkeren etter 1 sek forsinkelse.
      5. Bestråle synsnerven for 90 sek med en toppeffekt på 135mW og gjennomsnittlig effekt av 18mW produsert av en bjelke chopper hastighet på 250 Hz med en driftssyklus på 15% (dette minimaliserer termiske effekter). Gul fluorescens, visualiseres som lys oransje gjennom sikkerhetsfilter, vil bli utsendt fra den overlegne overflaten av synsnerven, og er tilstrekkelig til å sikre at strålen bestråler nerve symmetrisk.
      6. Etter bestråling, vil den oransje-farget sikkerhetsfilter åpnes automatisk. Microhemorrhage kan observeres i noen tilfeller.
      7. Avlaste trekkraft på ekstra okulære muskler og gå tilbake øyet til en nøytral posisjon. Lukk snittet med avbrutte suturer. Deretter trekke kateteret og feste lårvenen tett for å hindre lekkasje; lukke med avbrutte suturer. Påfør antibiotisk salve til begge snitt. Kontroller fundus å verifisere vaskulær integritet av den sentrale retinal arterie og vene.
2. Retrograd Merkingav Retinal ganglion celler (RGCs.) Merk: For å evaluere RGC overlevelse, retrograd merking med Fluorogold (FG) skal være ferdig en uke før PION. Metoden er beskrevet i detalj i Jove protokollen 819 ^13.
   1. I korte trekk: bedøve dyret med ketamin (60 mg / kg) og xylazin (8 mg / kg) og barbere hodet.
   2. Kirurgisk skrubbe innsnitt området og lage en midtlinjen snitt over hodet for å avsløre skallen.
   3. Bor bilaterale hull gjennom skallen (ø 2x2 mm) 0,5 mm fra både sagittal og tverrgående sting.
   4. Aspirate forsiktig cerebral innhold som ligger over den dorsale overflate av den overlegne colliculus (SC) ved hjelp av en vakuumpumpe. Deretter plasserer et lite stykke gelfoam dynket med 4% FG på overflaten av SC.
   5. Lukk snittet med sting og omsorg for dyret ved hjelp av standard postoperativ omsorg.
3. Postoperativ omsorg og Avliving
   1. Etter operasjonen, plasserer dyret i en separat ren bur på toppen av en resirkulerende vannputen oppvarmes inntil dyret blir gjenvunnet.
   2. Post-kirurgisk analgetika (buprenorfin HCl, 0,01 mg / kg) bør tas to ganger per dag i tre dager for å minimere ubehag.
   3. Rat bør holdes separat og observert før de er i stand til å opprettholde sternal recumbency og gjenvinne tilstrekkelig bevissthet.
   4. Tegn til bedring og god helse overvåkes daglig i minst 5 dager etter operasjonen, eller til sutur fjerning og tilstrekkelig helbredelse av kirurgiske området, avhengig av hva som inntreffer senest.
   5. Avlive dyrene ved perfusjon med 4% PFA på vitenskapelig passende tidspunkt etter operasjonen i henhold til undersøkende interesse.

Representative Results

Den resulterende iskemisk skade indusert av denne teknikken gir en gradvis, men uttales død av retinal ganglion celler etter iskemisk axon skade. Dette er en klinisk relevant resultat lik den som ble observert i den menneskelige sykdommen. FG retrograd merking brukes for å kvantifisere RGC overlevelse etter PION. Den samme metoden er ansatt for å validere en vellykket modellbygging, samt å vurdere virkningene av ulike terapiregimer. Figur 1 viser representative konfokale bilder av FG-positive celler i retina flat mounts fra kontroll (figur 1A), sham-behandlet (laser bare / nei erythrosin B, figur 1B), og 2 uker etter PION-behandlet (figur 1C) dyr. Sammenlignet med kontrolldyr, færre FG-positive celler som er til stede i dyrene 2 uker etter PION induksjon. Ingen signifikant forskjell mellom antall RGCs i kontroll og humbug-behandlet (laser bare / nei erythrosin B) dyr er observert. This indikerer at PION-indusert tap RGC er utløst av en kombinasjon av erythrosin B og laserbestråling, i stedet for termisk energi fra laseren alene.

Figur 1. Retinal ganglion celle (RGC) overlevelse etter posterior iskemisk optikusnevropati (PION). Retinal ganglion celler retrograd merket med Fluorogold ble fotografert i netthinnens flat mounts (AC). To uker etter PION, er et tilsvarende antall RGCs observert i kontroll (A) og sham-behandlet (B, laser bare / nei erythrosin B) øyne. Imidlertid er antallet Fluorogold merkede RGCs markert redusert i innstillingen av PION (C). Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se et større versjon av dette tallet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
532-nm Nd:YAG laser	Laserglow	LRS-532-KM-200-3
Beam chopper	custom-made	custom-made
Mechanical shutter and corresponding shutter drive timer	Vincent Associates	SD-10
25-cm focal length spherical lens	CVI/Melles-Griot	01 LPX 293	plano-convexBK7 glass lens with HEBBARTM antireflection coating
Erythrosin B	MP Biomedicals	190449
Fluorogold	Fluorochrome,LLC
Gelfoam	Cardinal Health	CAH1203421
Polyethylene tubing (PE10)	BD Intramedic	427400
No. 10 Blade	Miltex	4-110
Fine Forceps	F.S.T.	91150-20	Dumont #5 rustless non-magnetic
Forceps with Teeth	F.S.T.	11153-10	Germany stainless
Forceps	F.S.T.	18025-10	Germany stainless
Vannas spring scissors	F.S.T.	2-220	JJECK Stainless
Polyglactin suture	Ethicon	J488G	7-0 suture
hemostat	F.S.T.	12075-12	Germany stainless