Protocol
HINWEIS: Alle in diesem Protokoll aufgeführten Methoden wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss gebilligt wurde.
1. Vorbereitung der OP-Tisch
- Richten Sie das Heizkissen mit Umlauf warmem Wasser auf dem OP-Tisch, unter dem Dissektionsmikroskop. Legen Sie die Grundplatte aus Edelstahl auf dem Heizkissen. Legen Sie eine sterile saugfähigen Kissen auf der Grundplatte und Heizkissen.
- Vereinbaren sterilen chirurgischen Instrumente auf einem angrenzenden sterilen saugfähigen Kissen. Sammeln zwei Paare von abgewinkelten spitzen Pinzette zwei Paare von abgewinkelten Zange drei Arterienklemmen, zwei Retraktoren Drähte, kleine chirurgische Schere, Mikroscheren, einer Angioplastie Draht (0,15 Zoll) Durchmesser und drei 6-Zoll-Segmente 6.0 Seidennaht .
- Beugen Sie das runde Ende des Angioplastie-Draht, um die Krümmung der Femoralarterie entsprechen. Dadurch wird es leichter, das Kabel während der Operation voraus.
2. Herstellung vonMaus für Chirurgie
- Anesthetize eine Maus bei kontinuierlichem Einatmen von 2,5% Isofluran. Achten Sie darauf, den Status des Tieres während des gesamten Verfahrens überwachen. Führen Sie eine Prise Test der Maus den Fuß, um zu bestätigen, dass es vollständig betäubt wird. Stellen Sie sicher, das Tier bewegt sich nicht, wenn die Prise Test verabreicht wird.
- Tragen Sie eine Schmiersalbe die Augen des Tieres, um ein Austrocknen zu verhindern. Sichern Sie das Tier in Rückenlage auf dem absorbierenden Kissen mit chirurgischen Band. Weiter Verwaltung 2,5% Isofluran via Nasenkegel.
- Mit einer Enthaarungscreme, entfernen Sie das Fell auf dem Bein und Bauch auf der Mittellinie. Mit Wasser ausspülen und die Haut gründlich. Depilation eines Tages vor der Operation durchgeführt werden. Beachten Sie, dass übermäßige Behandlung mit der Creme kann zu Hautreizungen führen.
- Unmittelbar vor der Operation, gelten PVP-Jod auf die enthaarte Bereich mit einem Wattestäbchen, um die Haut zu sterilisieren. Spülen Sie die enthaarte Haut mit 70% Ethanol und trockenmit einem sterilen Wattestäbchen. 3-mal wiederholen.
- Verwalten einer präoperativen Dosis von 5 mg / kg von Carprofen subkutan injiziert wird.
3. Isolierung der Oberschenkelschlagader
- Mit kleinen chirurgischen Schere, einen gebogenen Schnitt in der Haut über die Oberschenkelarterie. Stumpf sezieren und zu sichern umgebenden Gewebe mit Retraktoren Magnet Aufroller Fixatoren die Femoralarterie zu lokalisieren. Befeuchten Sie das Gewebe in regelmäßigen Abständen mit Kochsalzlösung für die Bewässerung Nehmen Kochsalzlösung mit einem sterilen Wattestäbchen.
- Isolieren Sie die Oberschenkelschlagader mit einer Pinzette. Trennen Sie vorsichtig die Nerven aus dem Gefäßbündel mit spitzen Pinzette. Vermeiden Punktion der Vene und nicht die Nerven schädigen. Schieben Sie den Nerven vom Bündel eine Anregung es.
- Trennen Sie vorsichtig die Vena femoralis von der Femoralarterie, Lokalisierung des Oberschenkel Bifurkation. Der Bereich der Bifurkation ist besonders schwierig zu sezieren.
- Posterior zur Bifurkation, Schleife 6,0 Seidenfaden unter der Oberschenkelarterie und sicher mit einer Gefäßklemme. Diese proximale Nahtmaterial verwendet werden, um den Blutfluss in der Arterie zu beschränken.
Hinweis: Es gibt eine leichte Variation in der Bande bei der Durchführung der Ligationsmethode gegenüber der Kauterisation Methode (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2). - Distal der Bifurkation, Schleife 6.0 Seidenfaden unter der Oberschenkelarterie und sicher mit einer Gefäßklemme. Diese distale Naht Hilfsmittel bei der Positionierung der Arterie.
- Schleife zwei Nähte unter der Muskel Zweig der Arteria femoralis, vorge binden sie und mit einer Gefäßklemme. Denken Sie daran, um das Gewebe mit Kochsalzlösung befeuchten. Bei Durchführung der Kauterisation Verfahren Draht Verletzung, ist nur eine Schlaufennaht an der Muskelast notwendig.
4. Durchführung der Femoralarterie Draht Injury
- Blutfluss in die Oberschenkelarterie zu beschränken, indem der proximalen Naht. Leicht ziehen Sie den distalen Hemostan und Gefäßklemme Sicherung der Niederlassung der Website für die Arteriotomie zu entlarven. Ligation der Muskulatur Zweig durch das Binden des Nahtmaterials um ihn herum.
HINWEIS: Die Aufhebung der Arterie nach oben wird effektiver beschränken Blutfluss als Ziehen horizontal allein. - Sever den kleinen Zweig mit dem Brenneisen zwischen den beiden Nähten. Mit Mikro-Schere, führen Sie eine Arteriotomie im Seitenzweig der Bifurkation. Verwenden einer Pinzette auf eine Rolle von chirurgischem Band ausgewogen, um die Mikroscheren stabilisieren.
- Bestätigen Sie die Anwesenheit der Arteriotomie mit spitzen Pinzette. Heben Sie die Öffnung der Arteriotomie mit der Zange. Führen Sie das abgerundete Ende des Drahtes in die Arteriotomie mit einer Pinzette. Zur Vorwärtsbewegung des Drahtes zu erleichtern, fügen ein oder zwei Tropfen von Lidocain auf die Region unter Verwendung einer Spritze.
- Wenn der Draht das proximale Naht erreicht, lassen Sie den Faden und so einstellen, dass sie die Weiterentwicklung des Drahtes nicht zu behindern. Führen Sie den Draht, bis es nicht weiter vorantreiben. Die Spitze the Draht sollte im Bereich des Leistenbandes zu stoppen.
- Lassen Sie den Draht in die Oberschenkelarterie für eine Minute bleiben. Nach einer Minute zurückziehen und rückt den Draht in einem Sägebewegung zehnmal zu verletzen und entblößen das Endothel der A. femoralis. Für eine Verletzung von geringerer Schwere, verringern die Anzahl der Male der Draht in und aus der Arterie herausgezogen oder aus dem Draht in der Arterie für 1 min nur.
- Fahren Sie den Draht langsam. Wenn das runde Ende des Drahtes hat die proximale Naht geführt, beschränken Fluss in der Arterie, indem die proximale Naht. Fahren Sie den Draht vollständig.
5. Ligation des Muskulös Niederlassung
- Ziehen Sie die verbleibenden Naht auf der Muskel Branche. Dies wird Blutung aus der Arteriotomie zu verhindern. Rückfluss zum Muskel Zweig, und bestätigen, dass das Blut nicht aus ihm austritt. Schneiden Sie die Enden der Fäden auf der Muskel Branche.
6. Alternative Methode: Lokalisierte Caumetrierung des Arteriotomie
HINWEIS: Ein alternativer Ansatz ergriffen werden können, um die Ligation der Muskulatur Zweig vermieden werden und Gefäßzugang durch die größere Hauptoberschenkelarterie.
- Ausgehend von 4,1, beschränken Fluss zur Oberschenkelarterie durch Ziehen am proximalen Nahtmaterial. Ziehen Sie den distalen Naht und die Befestigung von Nahtmaterial die Muskelzweig leicht auf die Seite für die Arteriotomie (Abbildung 1 und Abbildung 2) aus.
- Mit Mikro-Schere, führen Sie eine Arteriotomie am Verzweigungspunkt der Oberschenkelarterie und der Muskel Branche. Wenn der Einschnitt in der Seite der Arterie, es leichter zu ätzen sein können. Verwenden einer Pinzette auf eine Rolle von chirurgischem Band ausgewogen, um die Mikroscheren stabilisieren.
- Um den Erfolg der Kauterisation zu testen, wiederherzustellen Fluss zur Oberschenkelarterie durch das Lösen der proximalen Nahtmaterial. Wenn die Blutung aus der Arteriotomie auftritt, wiederholen Sie den Brenneisen. Wenn die Brenneisen erfolgreich ist, wird der Blutfluss wieder werdengespeichert distal der Arteriotomie.
- Führen Sie den Draht, und führen Sie den Draht Verletzungen, wie in Kapitel 4 beschrieben.
- Weiter Einschränkung des Blutflusses in die Oberschenkelarterie. Erhitzen Sie mit einem spitzen Kauter mindestens 6 Zentimeter entfernt von der Maus. Da die Brenneisen Spitze abkühlt, gelten sie leicht Seite des Arteriotomie, um den Einschnitt zu schließen.
- Um den Erfolg der Kauterisation zu testen, wiederherzustellen Fluss zur Oberschenkelarterie durch das Lösen der proximalen Nahtmaterial. Wenn die Blutung aus der Arteriotomie auftritt, wiederholen Sie den Brenneisen. Wenn die Brenneisen erfolgreich ist, wird der Blutfluss distal der Arteriotomie wiederhergestellt werden. Entfernen Sie die temporären proximalen und distalen Krawatten.
7. Implantation Perivaskuläre Drug Delivery-Patch
- Erstellung einer perivaskulären Medikamentenpflaster nach früheren Studien 11 oder durch Verwendung ähnlicher Verfahren beschrieben erzeugt werden. Blunt die Ecken der Sperrbereich der Arzneimittel-Einführungspflasters mit einer sterilen Schere
- Legen Sie die Medikamentenabgabe patch auf die verletzten Oberschenkelarterie mit Blick auf die Arterie der Arzneimittel freisetzenden Seite. Nutzen Sie gegebenenfalls Pinzette, um die Position des Patches zu verbessern.
8. Wundverschluss und Wiederherstellung
- Schließen Sie die Wunde mit einem einfachen Knopfnaht, die aus quadratischen Knoten. Eine diskontinuierliche Naht verlängert Wundverschluss bei dem Tier versucht, um die Naht zu entfernen.
- Schalten Sie die Anästhesie und entfernen Sie das Tier aus der Einrichtung. Lassen Sie das Tier auf die Erwärmung pad erholen.
- Weiterhin der Maus die Erholung zu überwachen. Überprüfen Sie die Inzisionsstelle jeden Tag, um sicherzustellen, dass es geschlossen bleibt. Für die Behandlung von postoperativen Schmerzen, verwalten eine subkutane Injektion von 5 mg / kg von Carprofen jeder 12 Stunden nach der Operation und dann alle 12 Stunden für 2 Tage. Wenn der Schmerz geht weiter über die ersten 2 Tage, konsultieren Sie einen Tierarzt nach dem Weg zu weiteren Schmerzmittel.
9. Ernten Femoralarterien für die Histologie
- 28 Tage nach der Operation, führen Kohlendioxid Euthanasie auf der Maus.
HINWEIS: Die entsprechende Strömungsgeschwindigkeit des Kohlendioxids sollte 10-30% des Kammer pro Minute zu verdrängen und in Abhängigkeit von der Größe der verwendeten Kammer variieren. Schneiden der Membran und Herzpunktion als sekundäre Verfahren Euthanasie durchgeführt werden. - Sichern Sie die Maus in Rückenlage mit chirurgischen Band. Einen Einschnitt in die Femoralarterie, wo die ersten chirurgischen Eingriff vorgenommen wurde.
- Sowohl für die verletzte Arterie und der unverletzten Arterie aus dem kontralateralen Bein, unverblümt zu sezieren und zu sichern umgebenden Gewebe mit Retraktoren und magnetische Aufroller Fixatoren die Oberschenkelschlagader zu finden. Befeuchten Sie regelmäßig mit Kochsalzlösung für die Bewässerung der Gewebe. Übernehmen mit einer sterilen Kochsalzlösung Wattestäbchen. Achten Sie darauf, um die Arterie nicht beschädigen.
- Nachdem die Oberschenkelarterie wurde von der Stelle des ursprünglichen Arteriotomie in die Bauchaorta isoliert, binden eine segment der Seidenfaden in der Nähe von der Original-Website der Arteriotomie. Dieser Faden wird dazu beitragen, die meisten distale Ende des Oberschenkelarterie und einfache Handhabung der Probe.
- Mit Hilfe der Mikro-Schere Dissektion der Arteria femoralis zu herauszuschneiden. Stellen Sie eine Inzision distal der Naht. Machen die anderen Einschnitt auf der gegenüberliegenden Seite des Oberschenkelarterie, neben der Bauchaorta.
- Übertragen Sie die ausgeschnittene Arterie zu einer Glas-Petrischale Kochsalzlösung. Präparieren Sie die Arterie weiter, um überschüssiges Bindegewebe oder Fett zu entfernen. Blut Entfernen Sie vorsichtig von den Lumen durch Spülen mit Kochsalzlösung.
- Übertragen Sie die Arterie in eine Ampulle von 10% gepuffertem Formalin. Lagern Sie die Fläschchen bei 4 ° C unter leichtem Schütteln für 48 Stunden.
- Übertragen der Festader zu 70% Ethanol, zu speichern, bis sie für die Histologie verarbeitet.
- Betten Sie die Arterie in die Paraffinblocks und Abschnitt die Blöcke für die Färbung.
- Führen histochemische und immunochemischen Färbung, um das Ausmaß der Schädigung und der Intima hyp beurteilenerplasia.
HINWEIS: Für die repräsentative Ergebnisse, Hämatoxylin und Eosin verwendet wir, um die Kerne und die allgemeine Morphologie oder eine Movat des Penta Fleck sichtbar, um den elastischen Lamellen und andere arterielle Komponenten sichtbar zu machen.
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Representative Results
Nach Drahtverletzung entwickelt Neointimahyperplasie im Laufe der Zeit und wird in der Regel nach 14 bis 28 Tagen untersucht. Die in dieser Arbeit führen zu robusten Generation von Intimahyperplasie bei Mäusen, wie dargestellt die histologischen Ergebnisse in Abbildung 3 beschriebenen Techniken. Ein unverletzt Femoralarterie intakt elastischen Lamellen und eine normale Dicke und Umfang demonstrieren. Ein verletzter Femoralarterie wird Intimahyperplasie zeigen, abgebaut elastischen Lamellen und zeigen Reendothelialisierung zu späteren Zeitpunkten. Reendothelialisierung liegt typischerweise bei etwa 21 Tage schließen, aber dies hängt von der Hintergrundstamm der verwendeten Mäuse und können mit Immunfärbung auf endothelialen Marker auf Teile oder, vorzugsweise, auf gemessenen en face Zubereitungen unter Verwendung des Evans-Blau-Farbstoff untersucht werden, Rasterelektronenmikroskopie oder Immunfärbung mit der konfokalen Mikroskopie auf en face Vorbereitungen der Arterie. 17,18 Zur Quantifizierung der Intimahyperplasie esAm besten ist die Intima-Bereich oder Intima-zu-Medien-Verhältnis an drei Standorten entlang der verletzten Arterie zu messen, um mögliche Variationen entlang der Länge des verletzten Bereich der Arterie zu berücksichtigen.
Abbildung 1: Fotografien der kritischen Schritte der beiden Verfahren für Draht Verletzung in die Femoralarterie ein Vergleich der Schritte für die Ligationsverfahren (oben) zur Kauterisation Verfahren (unten) zur Durchführung einer Draht Verletzung.. Im Ligationsmethode, sind die beiden Nähte Sicherung der Muskelzweig vorgebunden, so dass sie fest angezogen, um die Muskelzweig ligieren werden. Je mehr distale der beiden Muskelzweig Nähte festgezogen wird. Die Arteriotomie und Drahteinführung werden in der Muskulatur Niederlassung durchgeführt. Nach der Verletzung durchgeführt wird, wird der verbleibende Faden am Muskelast gezogen und beschnitten. Im Kauter Verfahren, nur eine sukunft wird unter dem Muskelzweig eingeschleift. Arteriotomie und Drahteinsetz werden an dem Verzweigungspunkt des Muskelast aus der Oberschenkelarterie durchgeführt. Nach der Verletzung durchgeführt wird, wird der Schnitt ohne Ligation entweder die Oberschenkelarterie oder Muskelzweig kauterisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2: Stärkere Vergrößerung Fotografien der kritischen Schritte der beiden Techniken für die Draht Verletzung Nahaufnahme Vergleich der Schritte für die Ligationsmethode (oben) auf das Brenneisen Verfahren (unten).. Die Lage des Arteriotomie ist mit der gestrichelten Linie markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehenFigur.
Abb. 3: Vertreter histologischen Ergebnisse der Draht Verletzung 14 Tage nach dem Eingriff von den Arterien histologische Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (oben) und Penta Färbung Movat ist (unten) gefärbt. In dem Bild markiert sind, wobei das Lumen (L), Intima (I) und elastische Lamina (EL).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight spring wire, 0.15” diameter | Cook | G02426 | |
| High Temperature cautery | Bovie Medical Corp. | HIT1 | |
| High-temperature fine tip for cautery | Bovie Medical Corp. | H101 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-13 | For performance of arteriotomy |
| Angled fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | For blunt dissection of vascular bundle |
| Angled forceps | Roboz | RS-5069 | For clearing tissues |
| Surgical scissors | Roboz | RS-5840 | For cutting skin |
| Retractor | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Retractor wire | Fine Science Tools | 18200-05 | Attached to retractor |
| Base plate | Fine Science Tools | 18200-03 | For use with retractor |
| Magnetic retractor fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7822 | |
| Hemostatic forceps | Biomedical Research Instruments, Inc. | 34-1000 | |
| Dissecting microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | |
| Microscope light source | Meiji Techno | FT191 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-500 | For maintaining mouse body temperature |
| Reusable heating pad | Gaymar | TP-R 22G | For maintaining mouse body temperature |
| Lidocaine | Various | ||
| 4.0 Vicryl suture with half circle needle | Ethicon | J494G | For post-surgical wound closure |
| Sterile cotton-tipped applicators | Puritan | 25-806-2WC | For application of depilatory cream and absorbing fluids |
| Depilatory cream | Nair | ||
| Isoflurane | Various | ||
| Betadine | Various | ||
| 70% ethanol | Various | ||
| 6.0 braided silk suture | Teleflex Medical | 4-S | For isolation of femoral artery during surgery |
| 0.9% sodium chloride | Various | For irrigating tissues | |
| Gel eye lubricant | Various | ||
| Glass Petri dish | Pyrex | 3160-60 | For femoral artery harvest |
| 10% buffered formalin | Various | For fixation of femoral artery | |
| 70% ethanol | Various | For fixation of femoral artery | |
| Bouin's fluid | Electron Microscopy Sciences | For Movat's Pentachrome staining | |
| Alcian blue, 1% | Electron Microscopy Sciences | 26385-01 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alkaline alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26385-02 | For Movat's Pentachrome staining |
| Orcein, 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26385-03 | For Movat's Pentachrome staining |
| Hematoxylin alcoholic, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-04 | For Movat's Pentachrome staining |
| Ferric chloride, 10% | Electron Microscopy Sciences | 26385-05 | For Movat's Pentachrome staining |
| Lugol's Iodine | Electron Microscopy Sciences | 26385-06 | For Movat's Pentachrome staining |
| Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution | Electron Microscopy Sciences | 26385-07 | For Movat's Pentachrome staining |
| Acetic acid, 0.5% | Electron Microscopy Sciences | Various | For Movat's Pentachrome staining |
| Phosphotungstic acid, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-09 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alcoholic saffron, 6% | Electron Microscopy Sciences | 26385-10 | For Movat's Pentachrome staining |
References
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