Protocol
הערה: כל השיטות שמוצגים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים.
1. הכנת שולחן ניתוחים
- הגדר את כרית החימום עם הסירקולציה מחודשת מים חמים על שולחן הניתוחים, תחת מיקרוסקופ לנתיחה. מניחים את צלחת בסיס נירוסטה על כרית החימום. הנח כרית סופגת סטרילית על צלחת הבסיס וכרית חימום.
- לארגן כלים כירורגיים סטרילי על משטח סופג סטרילית סמוכה. לאסוף שני זוגות מלקחיים דקים שקצהו בזווית, שני זוגות מלקחיים זווית, שלושה מלקחיים עוצר דמום, שני חוטי מפשקים, מספריים כירורגיות קטנים, מיקרו מספריים, חוט אנגיופלסטיקה אחד (בקוטר 0.15 אינץ ') ושלושה מגזרי 6 אינץ' של תפר 6.0 משי .
- תכופף את הקצה העגול של חוט אנגיופלסטיקה כדי להתאים את העקמומיות של עורק הירך. זה יעשה את זה קל יותר לקדם את החוט במהלך הניתוח.
2. הכנתעכבר לכירורגיה
- הרדימי עכבר על ידי שאיפה מתמדת של isoflurane 2.5%. הקפד לעקוב אחר מצבו של בעל החיים לאורך כל ההליך. לבצע בדיקת קמצוץ של כף הרגל של העכבר כדי לוודא שהוא הוא בהרדמה מלאה. ודא בעלי החיים אינו זז בעת מבחן קמצוץ מנוהל.
- החל משחה סיכה לעיניו של בעל החיים כדי למנוע התייבשות. אבטח את החיה במצב שכיבה לכרית סופגת באמצעות קלטת כירורגית. המשך מתן isoflurane 2.5% באמצעות חרטומו.
- שימוש בקרם מקריח, להסיר פרווה מהרגל ובבטן לקו אמצע. יש לשטוף את העור ביסודיות עם מים. אפילציה יכולה להתבצע יום אחד מראש של ניתוח. שים לב שטיפול מוגזם עם הקרם עלול להוביל לגירוי בעור.
- מייד לפני הניתוח, חל povidone- יוד לאזור המקולף עם המוליך כותנה שקצה לעקר את העור. יש לשטוף את העור המקולף עם אתנול 70% ויבשיםעם המוליך כותנה שקצה סטרילי. חזור 3 פעמים.
- שלו מנה טרום ניתוחית של 5 מ"ג / קילוגרם של carprofen באמצעות הזרקה תת עורית.
3. בידוד של עורק הירך
- בעזרת מספריים כירורגיות קטנים, לעשות חתך מעוגל בעור מעל עורק הירך. בבוטות לנתח ולאבטח את רקמות סובבות באמצעות תופסנים מפשק מגנטי מפשקים כדי לאתר את עורק הירך. להרטיב את הרקמות מעת לעת באמצעות מי מלח להשקיה החל מלוח באמצעות המוליך כותנה שקצה סטרילי.
- לבודד את עורק הירך באמצעות מלקחיים. בעדינות להפריד את העצב מחבילת כלי הדם באמצעות מלקחיים קנס שקצו. למנוע ניקוב הווריד, ולא לגרום נזק לעצב. לדחוף את העצב מהחבילה, כדי למנוע גירוי זה.
- בעדינות להפריד את וריד הירך מעורק הירך, איתור הסתעפות הירך. האזור של הסתעפות קשה במיוחד לנתח.
- Posterior להסתעפות, לולאת תפר 6.0 משי תחת עורק הירך ומאובטח עם hemostat. תפר הפרוקסימלי זה ישמש ללהגביל את זרימת דם בעורק.
הערה: קיימת שונות קלות בקשרים בעת ביצוע שיטת קשירה לעומת שיטת הצריבה (ראה איור 1 ואיור 2). - דיסטלי להסתעפות, לולאת 6.0 תפר משי תחת עורק הירך ומאובטח עם hemostat. עזרים זה דיסטלי תפר במיצוב של העורק.
- שני תפרי הלולאה תחת הענף השרירי של עורק הירך, מראש לקשור אותם ובטוחים עם hemostat. זכור כדי ללחלח את הרקמות עם מי מלח. אם ביצוע שיטת כויה של פגיעת חוט, רק אחד תפר כרך הוא הכרחי על הענף שרירי.
4. ביצועים של עורק הירך חוט פגיעה
- להגביל את זרימת דם לעורק הירך על ידי משיכת התפר הפרוקסימלי. מעט למשוך את hemost דיסטליובhemostat הבטחת הסניף לחשוף את האתר לarteriotomy. ולקשור את סניף השרירים על ידי קשירת התפר סביבו.
הערה: הרמת העורק כלפי מעלה יהיה יעילה יותר להגביל את זרימת דם מאשר מושך אופקי לבד. - לנתק את הסניף הקטן עם כויה בין שני התפרים. באמצעות מיקרו מספריים, לבצע arteriotomy בענף הצד השני של הסתעפות. שימוש במלקחיים מאוזנת בגליל של סרט כירורגית כדי לייצב את מיקרו המספריים.
- לאשר את קיומו של arteriotomy באמצעות מלקחיים קנס שקצו. רם בעדינות את פתיחת arteriotomy עם המלקחיים. להציג את הסוף המעוגל של החוט לתוך arteriotomy באמצעות מלקחיים. כדי להקל על קידום התיל, להוסיף טיפה אחת או שתיים של לידוקאין לאזור באמצעות מזרק.
- כאשר החוט מגיע התפר הפרוקסימלי, לשחרר את התפר ולהתאים אותו כך שהוא לא יכול לעכב את קידומו של החוט. הכנס את החוט עד שהוא לא יכול להתקדם עוד יותר. קצה החוט דואר צריך להפסיק באזור הרצועה מפשעתי.
- לאפשר לחוט להישאר בעורק הירך לרגע אחד. אחרי דקה אחת, לחזור בו ולקדם את החוט בתנועת ניסור עשר פעמים לפגוע ולערטל האנדותל של עורק הירך. לפציעתם של חומרה פחותה, להקטין את מספר הפעמים שהחוט נמשך ויוצא מהעורק או להשאיר את החוט בעורק דקות 1 בלבד.
- לחזור בו מהחוט לאט. כאשר בסופו של סיבוב החוט עבר את התפר הפרוקסימלי, להגביל את הזרימה לעורק על ידי משיכת התפר הפרוקסימלי. לחזור בו מהתיל לחלוטין.
5. ligating סניף השרירים
- הדק את התפר שנותר על הענף שרירי. זה ימנע דימום מarteriotomy. חזור זרימה לסניף שרירי, ולאשר דם שלא דולף ממנו. חתוך את הקצוות מהתפרים בסניף שרירי.
6. אלטרנטיבי שיטה: המותאם למקום Cauterization של Arteriotomy
הערה: ניתן לנקוט גישה חלופית כדי למנוע קשירה של סניף השרירים ולאפשר גישה של כלי דם דרך עורק הירך העיקרי הגדול יותר.
- החל מ 4.1, להגביל את הזרימה לעורק הירך על ידי משיכת התפר הפרוקסימלי. משוך את תפר דיסטלי ותפר הבטחת סניף השרירים מעט כדי לחשוף את האתר לarteriotomy (איור 1 ואיור 2).
- באמצעות מיקרו מספריים, לבצע arteriotomy בנקודת עורק הירך ושרירי הסניף הסניף. אם מבצע החתך בדופן העורק, זה יכול להיות קל יותר לצרוב. שימוש במלקחיים מאוזנת בגליל של סרט כירורגית כדי לייצב את מיקרו המספריים.
- כדי לבדוק את ההצלחה של צריבה, לשחזר את הזרימה לעורק הירך על ידי שחרור התפר הפרוקסימלי. אם דימום מתרחש מarteriotomy, לחזור על כויה. אם כויה היא מוצלחת, זרימת דם תהיה מחדשמאוחסן דיסטלי arteriotomy.
- להציג את החוט ולבצע פגיעת החוט כאמור בסעיף 4.
- המשך שמגביל את זרימת דם לעורק הירך. מחממים כויה דקה שקצהו לפחות 6 סנטימטרים מהעכבר. כעצת כויה מתקררת, להחיל אותו באורח קל בצד של arteriotomy כדי לסגור את החתך.
- כדי לבדוק את ההצלחה של צריבה, לשחזר את הזרימה לעורק הירך על ידי שחרור התפר הפרוקסימלי. אם דימום מתרחש מarteriotomy, לחזור על כויה. אם כויה היא מוצלחת, זרימת דם תשוחזר דיסטלי arteriotomy. הסר את הפרוקסימלי הזמנית וקשרי דיסטלי.
7. השרשה של perivascular החדרת תרופות תיקון
- צור תיקון תרופת perivascular ניתן ליצור כפי שתואר במחקרים קודמים 11 או בשיטות דומות. להקהות את הפינות של אזור המחסום של תיקון משלוח סמים באמצעות מספריים סטרילי
- הנח את טפיחת משלוח הסמיםch על עורק הירך הפצוע עם הצד משחרר תרופה מול העורק. במידת צורך, להשתמש במלקחיים כדי לשפר את מעמדו של התיקון.
8. פצע סגר ושחזור
- לסגור את הפצע עם תפר שהופסק פשוט המורכב של קשרים מרובעים. תפר רציף מאריך סגירת פצעים במקרה של בעלי החיים מנסים להסיר את התפר.
- כבה את ההרדמה ולהסיר את החיה מלהגדיר. לאפשר לבעלי החיים להתאושש על כרית החימום.
- תמשיך לעקוב אחר ההתאוששות של העכבר. בדוק את אתר חתך בכל יום כדי לוודא שהוא נותר סגור. לטיפול בכאב לאחר ניתוח, לנהל הזרקה תת עורית של 5 מ"ג / קילוגרם של carprofen כל 12 שעות לאחר ניתוח ולאחר מכן כל 12 שעות למשך 2 ימים. אם כאב ממשיך מעבר 2 ימים הראשונים, להתייעץ עם וטרינר לכיוונים במשככי כאבים נוספים.
9. עורקי קציר עצם הירך להיסטולוגיה
- בגיל 28 ימים שלאחר ניתוח, לבצע המתת חסד פחמן דו חמצני בעכבר.
הערה: קצב הזרימה המתאים של פחמן דו חמצני צריך לעקור 10-30% של החדר לדקה וישתנה בהתאם לגודלו של התא בשימוש. חיתוך של הסרעפת ולנקב לב צריכה להתבצע כשיטת משנית של המתת חסד. - לאבטח את העכבר במצב שכיבה באמצעות קלטת כירורגית. עושה חתך לאורך עורק הירך, שבו החתך הניתוחי הראשוני נעשה.
- לשניהם את העורק נפצע ועורק וללא כל הפגע מהרגל הנגדית, בבוטות לנתח ולהבטיח שמסביב רקמות באמצעות כלי כתיבה ותופסנים מפשק מגנטיים כדי לאתר את עורק הירך. להרטיב את הרקמות מעת לעת באמצעות מי מלח להשקיה. החל מלוח באמצעות המוליך כותנה שקצה סטרילי. הקפד שלא לפגוע בעורק.
- לאחר עורק הירך כבר מבודד מהאתר של arteriotomy המקורי לאב העורקים בבטן, לקשור SEGment של תפר משי בסמוך לאתר המקורי של arteriotomy. תפר זה יעזור לזהות את הקצה הדיסטלי ביותר של עורק הירך ולהקל טיפול במדגם.
- בעזרת המספריים מיקרו לנתיחה שיחתוך את עורק הירך. לעשות חתך אחד דיסטלי לתפר. הפוך את החתך האחר בקצה השני של עורק הירך, ליד אב העורקים בבטן.
- העבר את העורק נכרת לצלחת פטרי זכוכית המכילה תמיסת מלח. לנתח את העורק נוסף כדי להסיר את רקמת חיבור עודפת או שומן. להסיר בעדינות את דם מלומן על ידי שטיפה עם מי מלח.
- העבר את העורק לבקבוקון של 10% שנאגרו פורמלין. אחסן את הבקבוקון על 4 מעלות צלזיוס עם הנדנדה עדינה במשך 48 שעות.
- העבר את העורק הקבוע עד 70% אתנול, לאחסן עד שהוא מעובד להיסטולוגיה.
- להטביע את העורק בלוקים וסעיף בלוקים עבור מכתים פרפין.
- לבצע צביעת histochemical וimmunochemical להעריך את מידת הפגיעה HYP וintimalerplasia.
הערה: לקבלת תוצאות הנציג, השתמשנו Hematoxylin ו Eosin לדמיין את הגרעינים ומורפולוגיה כללית או כתם Pentachrome של Movat לדמיין lamellae אלסטי ורכיבי עורקים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות פציעת חוט, היפרפלזיה neointimal מתפתחת לאורך זמן ונבחנה בדרך כלל לאחר 14 עד 28 ימים. הטכניקות מתוארות בעבודה זו תוביל לדור חזק של היפרפלזיה intimal בעכברים, כפי שמוצגים תוצאות היסטולוגית באיור 3. עורק הירך וללא כל פגע ידגימו lamellae שלם אלסטי ועובי רגיל והיקף. עורק הירך נפצע יציג היפרפלזיה intimal, מושפל lamellae אלסטי ולהפגין מחדש endothelialization בנקודות זמן מאוחר יותר. Re-endothelialization הוא בדרך כלל מלא בסביבות 21 ימים, אבל זה תלוי בזן הרקע של העכברים המשמשים וניתן להעריך באמצעות immunostaining עבור סמנים האנדותל בסעיפים או, עדיף, שנמדדו בen הכנות פנים באמצעות הצבע הכחול של אוון, במיקרוסקופ אלקטרונים סורק או immunostaining עם מיקרוסקופיה confocal בen הכנות פנים של העורק. 17,18 לכימות של היפרפלזיה intimal זההדרך טובה ביותר הוא למדוד את שטח intimal או יחס intimal לתקשורת בשלושה אתרים לאורך העורק הפגוע כדי לפצות על סטיות פוטנציאליות לאורכו של האזור שנפגע בעורק.
איור 1: תמונות של השלבים הקריטיים של שתי שיטות לפגיעה חוט בעורק הירך השוואה של הצעדים לשיטת קשירה (למעלה) לשיטת כויה (למטה) לביצוע פציעת חוט.. בשיטת קשירה, שני תפרי הבטחת סניף השרירים הם מראש קשורים כך שניתן יהיה להדק ולקשור את הסניף שרירי. יותר הדיסטלי של שני תפרי סניף השרירים מתהדק. הכנסת arteriotomy והחוט מבוצעת בסניף שרירי. אחרי הפציעה מתבצעת, התפר שנותר בסניף השרירים מתהדק וגזוז. בשיטת כויה, אחד של רקuture סובב תחת ענף השרירים. Arteriotomy והחדרת תיל מבוצעים בנקודת הסניף של סניף השרירים מעורק הירך. אחרי הפציעה מתבצעת, חתך חטא ללא ligating או עורק הירך או סניף שרירי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תמונות בהגדלה גבוהות יותר של השלבים הקריטיים של שתי טכניקות לפגיעה חוט השוואת תקריב של צעדים לשיטת קשירה (למעלה) לשיטת כויה (למטה).. המיקום של arteriotomy הוא נתחם עם הקו המקווקו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זהדמות.
איור 3:. תוצאות היסטולוגית נציג של פגיעת חוט 14 ימים לאחר ההליך היסטולוגית מסעיפי העורקים הוכתמו Hematoxylin ו Eosin (למעלה) והצביעה של Movat pentachrome (למטה). כותרת בתמונה היא לומן (L), אינטימה (I) וlamina אלסטי (EL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight spring wire, 0.15” diameter | Cook | G02426 | |
| High Temperature cautery | Bovie Medical Corp. | HIT1 | |
| High-temperature fine tip for cautery | Bovie Medical Corp. | H101 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-13 | For performance of arteriotomy |
| Angled fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | For blunt dissection of vascular bundle |
| Angled forceps | Roboz | RS-5069 | For clearing tissues |
| Surgical scissors | Roboz | RS-5840 | For cutting skin |
| Retractor | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Retractor wire | Fine Science Tools | 18200-05 | Attached to retractor |
| Base plate | Fine Science Tools | 18200-03 | For use with retractor |
| Magnetic retractor fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7822 | |
| Hemostatic forceps | Biomedical Research Instruments, Inc. | 34-1000 | |
| Dissecting microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | |
| Microscope light source | Meiji Techno | FT191 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-500 | For maintaining mouse body temperature |
| Reusable heating pad | Gaymar | TP-R 22G | For maintaining mouse body temperature |
| Lidocaine | Various | ||
| 4.0 Vicryl suture with half circle needle | Ethicon | J494G | For post-surgical wound closure |
| Sterile cotton-tipped applicators | Puritan | 25-806-2WC | For application of depilatory cream and absorbing fluids |
| Depilatory cream | Nair | ||
| Isoflurane | Various | ||
| Betadine | Various | ||
| 70% ethanol | Various | ||
| 6.0 braided silk suture | Teleflex Medical | 4-S | For isolation of femoral artery during surgery |
| 0.9% sodium chloride | Various | For irrigating tissues | |
| Gel eye lubricant | Various | ||
| Glass Petri dish | Pyrex | 3160-60 | For femoral artery harvest |
| 10% buffered formalin | Various | For fixation of femoral artery | |
| 70% ethanol | Various | For fixation of femoral artery | |
| Bouin's fluid | Electron Microscopy Sciences | For Movat's Pentachrome staining | |
| Alcian blue, 1% | Electron Microscopy Sciences | 26385-01 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alkaline alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26385-02 | For Movat's Pentachrome staining |
| Orcein, 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26385-03 | For Movat's Pentachrome staining |
| Hematoxylin alcoholic, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-04 | For Movat's Pentachrome staining |
| Ferric chloride, 10% | Electron Microscopy Sciences | 26385-05 | For Movat's Pentachrome staining |
| Lugol's Iodine | Electron Microscopy Sciences | 26385-06 | For Movat's Pentachrome staining |
| Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution | Electron Microscopy Sciences | 26385-07 | For Movat's Pentachrome staining |
| Acetic acid, 0.5% | Electron Microscopy Sciences | Various | For Movat's Pentachrome staining |
| Phosphotungstic acid, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-09 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alcoholic saffron, 6% | Electron Microscopy Sciences | 26385-10 | For Movat's Pentachrome staining |
References
- Hoffmann, R., Mintz, G. S. Coronary in-stent restenosis - predictors, treatment and prevention. Eur Heart J. 21 (21), 1739-1749 (2000).
- Erbel, R., et al. Coronary-artery stenting compared with balloon angioplasty for restenosis after initial balloon angioplasty. Restenosis Stent Study Group. N Engl J Med. 339 (23), 1672-1678 (1998).
- Farooq, V., Gogas, B. D., Serruys, P. W. Restenosis: delineating the numerous causes of drug-eluting stent restenosis. Circ Cardiovasc Interv. 4 (2), 195-205 (2011).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. Br Med Bull. 106, 193-211 (2013).
- Garg, S., Serruys, P. W. Coronary stents: current status. J Am Coll Cardiol. 56 (10 Suppl), S1-S42 (2010).
- Park, S. J., Kim, Y. H. Current status of percutaneous coronary intervention with drug-eluting stents in Asia. Circulation. 118 (25), 2730-2737 (2008).
- Alfonso, F. Treatment of drug-eluting stent restenosis the new pilgrimage: quo vadis. J Am Coll Cardiol. 55 (24), 2717-2720 (2010).
- Dake, M. D., et al. Paclitaxel-eluting stents show superiority to balloon angioplasty and bare metal stents in femoropopliteal disease: twelve-month Zilver PTX randomized study results. Circ Cardiovasc Interv. 4 (5), 495-504 (2011).
- Bosiers, M., et al. Results of the Protege EverFlex 200-mm-long nitinol stent (ev3) in TASC C and D femoropopliteal lesions. J Vasc Surg. 54 (4), 1042-1050 (2011).
- Duda, S. H., et al. Drug-eluting and bare nitinol stents for the treatment of atherosclerotic lesions in the superficial femoral artery: long-term results from the SIROCCO trial. J Endovasc Ther. 13 (6), 701-710 (2006).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17 (10), 2238-2244 (1997).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Roque, M., et al. Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20 (2), 335-342 (2000).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. Mouse model of arterial injury. Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).
- Edelman, E. R., Adams, D. H., Karnovsky, M. J. Effect of controlled adventitial heparin delivery on smooth muscle cell proliferation following endothelial injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (10), 3773-3777 (1990).
- Stemerman, M. B., Ross, R. Experimental arteriosclerosis. I. Fibrous plaque formation in primates, an electron microscope study. J Exp Med. 136 (4), 769-789 (1972).
- Brouchet, L., et al. Estradiol accelerates reendothelialization in mouse carotid artery through estrogen receptor-alpha but not estrogen receptor-beta. Circulation. 103 (3), 423-428 (2001).
- Filipe, C., et al. Estradiol accelerates endothelial healing through the retrograde commitment of uninjured endothelium. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2822-H2830 (2008).
- Feuls, R., et al. Microvascular denudation of the femoral artery of the mouse as a model for restenosis. Rofo. 175 (7), 952-957 (2003).
- Holt, A. W., Tulis, D. A. Experimental Rat and Mouse Carotid Artery Surgery: Injury & Remodeling Studies. ISRN Minim Invasive Surg. 2013, (2013).
- Iafrati, M. D., et al. Estrogen inhibits the vascular injury response in estrogen receptor alpha-deficient mice. Nat Med. 3 (5), 545-548 (1997).
- Sullivan, T. R., et al. Estrogen inhibits the response-to-injury in a mouse carotid artery model. J Clin Invest. 96 (5), 2482-2488 (1995).
- Yin, Y., Zhao, X., Fang, Y., Huang, L. Carotid artery wire injury mouse model with a nonmicrosurgical procedure. Vascular. 18 (4), 221-226 (2010).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. J Vis Exp. (40), (2010).
- Kuhlmann, M. T., et al. Implantation of a carotid cuff for triggering shear-stress induced atherosclerosis in mice. J Vis Exp. (59), (2012).
- Carmeliet, P., et al. Vascular wound healing and neointima formation induced by perivascular electric injury in mice. Am J Pathol. 150 (2), 761-776 (1997).
