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Medicine

एक perivascular दवा वितरण पैच का आरोपण के साथ और्विक धमनी वायर चोट की murine मॉडल

Published: February 10, 2015 doi: 10.3791/52403
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में दिखाया गया है सभी तरीकों संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।

शल्य चिकित्सा की मेज के 1. तैयारी

  1. विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे, शल्य चिकित्सा की मेज पर गर्म पानी recirculating के साथ हीटिंग पैड सेट करें। हीटिंग पैड पर स्टेनलेस स्टील बेस प्लेट रखें। बेस प्लेट और हीटिंग पैड पर एक बाँझ शोषक पैड रखें।
  2. एक बगल बाँझ शोषक पैड पर बाँझ सर्जिकल उपकरणों की व्यवस्था। कोणीय ठीक इत्तला दे दी संदंश के दो जोड़े, कोणीय संदंश के दो जोड़े, तीन hemostatic संदंश, दो retractors तार, छोटे शल्य कैंची, सूक्ष्म कैंची, एक एंजियोप्लास्टी तार (0.15 इंच व्यास) और 6.0 रेशम सीवन के तीन 6 इंच खंडों को इकट्ठा ।
  3. और्विक धमनी की वक्रता मैच के लिए एंजियोप्लास्टी के तार के दौर अंत झुको। यह आसान सर्जरी के दौरान तार अग्रिम करने के लिए कर देगा।

2. तैयारीसर्जरी के लिए माउस

  1. 2.5% isoflurane की निरंतर साँस लेना द्वारा एक माउस anesthetize। प्रक्रिया के दौरान पशु की स्थिति पर नजर रखने के लिए सुनिश्चित करें। यह पूरी तरह से anesthetized है कि पुष्टि करने के लिए माउस के पैर की एक चुटकी परीक्षण प्रदर्शन। चुटकी परीक्षण दिलाई है जब कदम नहीं करता पशु सुनिश्चित करें।
  2. सुखाना को रोकने के लिए जानवर की आँखों में एक चिकनाई मरहम लागू करें। सर्जिकल टेप का उपयोग शोषक पैड करने के लिए लापरवाह स्थिति में पशु सुरक्षित। नाक शंकु के माध्यम से 2.5% isoflurane के प्रशासन के लिए आगे बढ़ें।
  3. एक लोमनाशक क्रीम का उपयोग, मध्य लाइन के लिए पैर और पेट से फर हटा दें। पानी के साथ अच्छी तरह से त्वचा कुल्ला। Depilation सर्जरी के अग्रिम में एक दिन का प्रदर्शन किया जा सकता है। त्वचा में जलन पैदा हो सकती है क्रीम के साथ कि अत्यधिक उपचार पर ध्यान दें।
  4. तुरंत सर्जरी से पहले, त्वचा बाँझ एक कपास इत्तला दे दी applicator के साथ depilated क्षेत्र के लिए povidone आयोडीन लागू होते हैं। 70% इथेनॉल और शुष्क साथ depilated त्वचा कुल्लाएक बाँझ कपास इत्तला दे दी applicator के साथ। तीन बार दोहराएँ।
  5. चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से Carprofen की 5 मिलीग्राम / किलो के एक पूर्व ऑपरेटिव खुराक प्रशासन।

और्विक धमनी 3. अलगाव

  1. छोटे शल्य कैंची का प्रयोग, और्विक धमनी पर त्वचा में एक घुमावदार चीरा बनाते हैं। दो टूक और्विक धमनी का पता लगाने में retractors चुंबकीय प्रतिकर्षक fixators का उपयोग कर आसपास के ऊतकों टुकड़े करना और सुरक्षित है। एक बाँझ कपास इत्तला दे दी applicator का उपयोग कर खारा लागू करें सिंचाई के लिए समय-समय पर खारा का उपयोग करते हुए ऊतकों को गीला।
  2. संदंश का उपयोग और्विक धमनी पृथक। धीरे ठीक इत्तला दे दी संदंश का उपयोग संवहनी बंडल से तंत्रिका अलग। नस puncturing से बचें, और तंत्रिका क्षति नहीं है। यह उत्तेजक से बचने के लिए दूर बंडल से तंत्रिका पुश।
  3. धीरे और्विक द्विभाजन लगाने, और्विक धमनी से ऊरु नस अलग। विभाजन के क्षेत्र काटना विशेष रूप से कठिन है।
  4. पीosterior विभाजन करने के लिए, पाश एक hemostat के साथ और्विक धमनी और सुरक्षित तहत एक 6.0 रेशम सिवनी। इस समीपस्थ सीवन धमनी में रक्त के प्रवाह को सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
    नोट: दाग़ना विधि बनाम बंधाव विधि जब प्रदर्शन के संबंधों में एक मामूली बदलाव है (चित्रा 1 और चित्रा 2 देखें)।
  5. विभाजन के लिए बाहर का, पाश 6.0 रेशम और्विक धमनी के तहत सिवनी और एक hemostat के साथ सुरक्षित। धमनी की स्थिति में यह बाहर का सिवनी एड्स।
  6. और्विक धमनी की पेशी शाखा के तहत लूप दो टांके, उनमें पूर्व टाई और एक hemostat के साथ सुरक्षित है। नमक के साथ ऊतकों को गीला करने के लिए याद रखें। तार चोट का दाग़ना विधि का निष्पादन करते हैं, तो केवल एक looped सिवनी पेशी शाखा पर आवश्यक है।

और्विक धमनी वायर चोट 4. प्रदर्शन

  1. समीपस्थ सीवन खींच कर और्विक धमनी में रक्त के प्रवाह को सीमित। थोड़ा बाहर का hemost खींचhemostat के शाखा हासिल करने में और arteriotomy के लिए साइट का पर्दाफाश करने के लिए। इसके चारों ओर सीवन बांधने से पेशी शाखा ligate।
    नोट: ऊपर की ओर धमनी भारोत्तोलन और अधिक प्रभावी ढंग क्षैतिज अकेले खींच से रक्त के प्रवाह को सीमित होगा।
  2. दो टांके के बीच दाग़ना के साथ छोटे शाखा तोड़। सूक्ष्म कैंची का प्रयोग, विभाजन के पक्ष शाखा में एक arteriotomy प्रदर्शन करते हैं। सूक्ष्म कैंची को स्थिर करने के लिए शल्य चिकित्सा टेप का एक रोल पर संतुलित संदंश का प्रयोग करें।
  3. ठीक इत्तला दे दी संदंश का उपयोग arteriotomy की उपस्थिति की पुष्टि। धीरे संदंश के साथ arteriotomy के उद्घाटन उठा। संदंश का उपयोग arteriotomy में तार के गोल अंत का परिचय। तार की उन्नति को कम करने के लिए, एक सिरिंज का उपयोग कर इस क्षेत्र के लिए lidocaine के एक या दो बूँदें जोड़ें।
  4. तार समीपस्थ सीवन पहुंचता है, सीवन जारी है और यह तार की उन्नति में बाधा नहीं किया जा सकता है, ताकि इसे समायोजित। यह आगे अग्रिम नहीं कर सकता जब तक तार डालें। वें की नोकई तार वंक्षण बंधन के क्षेत्र में बंद कर देना चाहिए।
  5. तार एक मिनट के लिए और्विक धमनी में रहने की अनुमति दें। घायल और और्विक धमनी की अन्तःचूचुक उघाड़ना को दस बार एक मिनट के बाद, वापस लेना और एक काटने का कार्य गति में तार अग्रिम। कम तीव्रता का एक चोट के लिए, तार में और धमनी से बाहर खींच लिया है टाइम्स की संख्या में कमी या केवल एक मिनट के लिए धमनी में तार छोड़ दें।
  6. धीरे-धीरे तार वापस लेना। तार के दौर अंत समीपस्थ सीवन बीत चुका है, समीपस्थ सीवन खींच कर धमनी में प्रवाह को सीमित। पूरी तरह से तार वापस लेना।

5. पेशी शाखा Ligating

  1. पेशी शाखा पर शेष सीवन कसो। इस arteriotomy से खून बह रहा रोकने जाएगा। पेशी शाखा के प्रवाह पर लौटें, और कहा कि रक्त से लीक नहीं है की पुष्टि करें। पेशी शाखा पर टांके से समाप्त होता है ट्रिम।

6. वैकल्पिक विधि: स्थानीयकृत CauArteriotomy की terization

नोट: एक वैकल्पिक दृष्टिकोण पेशी शाखा के बंधाव बचने के लिए और बड़ा मुख्य और्विक धमनी के माध्यम से संवहनी उपयोग की अनुमति के लिए ले जाया जा सकता है।

  1. 4.1 से शुरू, समीपस्थ सीवन पर खींच कर और्विक धमनी के लिए प्रवाह को सीमित। बाहर का सिवनी और arteriotomy के लिए साइट (चित्रा 1 और चित्रा 2) को बेनकाब करने के लिए थोड़ा पेशी शाखा हासिल सीवन खींचो।
  2. सूक्ष्म कैंची का प्रयोग, और्विक धमनी और मांसपेशियों शाखा के शाखा बिंदु पर एक arteriotomy प्रदर्शन करते हैं। चीरा धमनी के पक्ष में किया जाता है, तो यह दाग़ना करने के लिए आसान हो सकता है। सूक्ष्म कैंची को स्थिर करने के लिए शल्य चिकित्सा टेप का एक रोल पर संतुलित संदंश का प्रयोग करें।
  3. दाग़ना की सफलता का परीक्षण करने के लिए, समीपस्थ सीवन ढीला द्वारा और्विक धमनी के लिए प्रवाह को बहाल। खून बह रहा है arteriotomy से होती है, तो दाग़ना दोहराएँ। दाग़ना सफल होता है, रक्त का प्रवाह फिर से किया जाएगाarteriotomy के लिए बाहर का संग्रहीत।
  4. तार का परिचय और धारा 4 में वर्णित के रूप में तार चोट करते हैं।
  5. और्विक धमनी में रक्त का प्रवाह सीमित जारी रखें। कम से कम 6 इंच की दूरी पर माउस से एक ठीक इत्तला दे दी दाग़ना गर्मी। दाग़ना टिप ठंडा, चीरा बंद करने के लिए arteriotomy के पक्ष इसे हल्के ढंग से लागू होते हैं।
  6. दाग़ना की सफलता का परीक्षण करने के लिए, समीपस्थ सीवन ढीला द्वारा और्विक धमनी के लिए प्रवाह को बहाल। खून बह रहा है arteriotomy से होती है, तो दाग़ना दोहराएँ। दाग़ना सफल होता है, रक्त का प्रवाह arteriotomy के लिए बाहर का बहाल हो जाएगा। अस्थायी प्रॉक्सिमल और बाहर के संबंधों को निकालें।

Perivascular दवा वितरण पैच 7. आरोपण

  1. पिछले अध्ययनों में 11 या इसी तरह के तरीकों का उपयोग कर के रूप में वर्णित एक परिवाहकीय दवा पैच बनाने के लिए बनाया जा सकता है। बाँझ कैंची का उपयोग दवा वितरण पैच की बाधा क्षेत्र के कोनों को कुंद
  2. दवा वितरण पैट रखेंधमनी का सामना करना पड़ दवा को रिहा पक्ष के साथ घायल और्विक धमनी पर चर्चा। आवश्यक के रूप में, पैच की स्थिति में सुधार करने के लिए संदंश का उपयोग करें।

8. घाव बंद और रिकवरी

  1. वर्ग समुद्री मील से मिलकर एक साधारण बाधित सीवन के साथ घाव बंद करें। एक असंतत सिवनी पशु सिवनी को दूर करने की कोशिश करता है के मामले में घाव बंद prolongs।
  2. संज्ञाहरण बंद करें और सेट अप से पशु हटा दें। पशु वार्मिंग पैड पर ठीक करने के लिए अनुमति दें।
  3. माउस की वसूली पर नजर रखने के लिए आगे बढ़ें। यह बंद रहता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक दिन चीरा साइट की जाँच करें। शल्य चिकित्सा के बाद दर्द के उपचार के लिए दो दिनों के लिए तो हर 12 घंटे की सर्जरी के बाद 5 मिलीग्राम / carprofen हर 12 घंटा का किलो का एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन प्रशासन और। दर्द प्रारंभिक दो दिनों से परे रहती है, तो आगे दर्द की दवा पर दिशाओं के लिए एक पशु चिकित्सक से परामर्श करें।

प्रोटोकॉल के लिए 9. फसल काटने ऊरु धमनियों

  1. बाद सर्जरी 28 दिनों में, माउस पर कार्बन डाइऑक्साइड इच्छामृत्यु प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: कार्बन डाइऑक्साइड का उचित प्रवाह की दर प्रति मिनट चैंबर के 10-30% विस्थापित होना चाहिए और इस्तेमाल चैंबर के आकार के आधार पर अलग अलग होंगे। डायाफ्राम और हृदय पंचर के काटने इच्छामृत्यु की एक माध्यमिक विधि के रूप में किया जाना चाहिए।
  2. सर्जिकल टेप का उपयोग लापरवाह स्थिति में माउस सुरक्षित। प्रारंभिक शल्य चीरा बनाया गया था, जहां और्विक धमनी, पर एक चीरा बनाओ।
  3. घायल धमनी और contralateral पैर से रिहाई धमनी, दोनों के लिए दो टूक काटना और और्विक धमनी का पता लगाने में retractors और चुंबकीय प्रतिकर्षक fixators का उपयोग कर आसपास के ऊतकों को सुरक्षित। समय-समय पर सिंचाई के लिए खारा का उपयोग करते हुए ऊतकों को गीला। एक बाँझ कपास इत्तला दे दी applicator का उपयोग कर खारा लागू करें। धमनी को नुकसान नहीं करने के लिए ध्यान रखना।
  4. और्विक धमनी उदर महाधमनी के लिए मूल arteriotomy की साइट से पृथक कर दिया गया है के बाद, एक SEG टाईarteriotomy के मूल स्थल के निकट रेशम सीवन के बयान। इस सिवनी और्विक धमनी के सबसे बाहर का अंत की पहचान करने और नमूना की हैंडलिंग कम करने में मदद करेगा।
  5. माइक्रो-विच्छेदन कैंची का प्रयोग और्विक धमनी आबकारी करने के लिए। सिवनी के लिए एक चीरा बाहर का बनाओ। उदर महाधमनी के बगल में, और्विक धमनी के विपरीत छोर पर अन्य चीरा बनाओ।
  6. खारा युक्त एक गिलास पेट्री डिश के लिए excised धमनी स्थानांतरण। अतिरिक्त संयोजी ऊतक या चर्बी हटाने के लिए आगे धमनी काटना। धीरे नमक के साथ rinsing द्वारा लुमेन से खून निकाल दें।
  7. 10% बफर formalin के एक शीशी धमनी स्थानांतरण। कोमल 48 घंटा के लिए कमाल के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर शीशी स्टोर।
  8. यह ऊतक विज्ञान के लिए कार्रवाई की है जब तक स्टोर करने के लिए, 70% इथेनॉल के लिए तय की धमनी स्थानांतरण।
  9. आयल ब्लॉक और खंड धुंधला के लिए ब्लॉकों में धमनी शामिल करें।
  10. चोट और intimal कमर की सीमा का आकलन करने के लिए histochemical और immunochemical धुंधला सम्पन्नerplasia।
    नोट: प्रतिनिधि परिणामों के लिए, हम लोचदार lamellae और अन्य धमनी घटकों कल्पना करने के नाभिक और समग्र आकृति विज्ञान या एक Movat के Pentachrome दाग कल्पना करने के लिए hematoxylin और eosin इस्तेमाल किया।

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Representative Results

तार की चोट के बाद, neointimal हाइपरप्लासिया समय के साथ विकसित और आम तौर पर 14-28 दिनों के बाद जांच की है। चित्रा में ऊतकीय परिणाम के रूप में दिखाया चूहों में intimal hyperplasia के मजबूत पीढ़ी को इस काम के नेतृत्व में वर्णित तकनीकों 3। एक रिहाई और्विक धमनी बरकरार लोचदार lamellae और एक सामान्य मोटाई और परिधि का प्रदर्शन करेंगे। एक घायल और्विक धमनी, intimal हाइपरप्लासिया दिखाने लोचदार lamellae अपमानित किया और बाद में समय बिंदुओं पर फिर से endothelialization प्रदर्शन करेंगे। पुनः endothelialization लगभग 21 दिनों में आम तौर पर पूरा हो गया है, लेकिन इस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इस्तेमाल चूहों की पृष्ठभूमि तनाव पर निर्भर करता है और बेहतर, इवान नीले डाई का उपयोग चेहरे की तैयारी एन पर मापा एन्दोथेलिअल वर्गों पर मार्कर या, के लिए immunostaining का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है या धमनी के चेहरे की तैयारी एन पर confocal माइक्रोस्कोपी के साथ immunostaining। 17,18 intimal हाइपरप्लासिया की मात्रा का ठहराव के लिए यहधमनी के घायल क्षेत्र की लंबाई के साथ संभावित बदलाव के लिए खाते में घायल धमनी साथ तीन स्थलों पर intimal क्षेत्र या intimal करने वाली मीडिया अनुपात को मापने के लिए सबसे अच्छा है।

चित्र 1
चित्रा 1: और्विक धमनी में तार की चोट के लिए दो तरीकों के महत्वपूर्ण कदम की फोटो तार चोट के प्रदर्शन के लिए दाग़ना विधि (नीचे) को बंधाव विधि (ऊपर) के लिए कदम की तुलना।। बंधाव विधि में पेशी शाखा हासिल करने दो टांके पूर्व बंधे हैं वे पेशी शाखा ligate को कड़ा किया जा सकता है। दो पेशी शाखा टांके का अधिक बाहर का कड़ा है। arteriotomy और तार प्रविष्टि पेशी शाखा में प्रदर्शन कर रहे हैं। चोट का प्रदर्शन किया है, के बाद पेशी शाखा पर शेष सिवनी कड़ा और छंटनी की है। दाग़ना विधि में, केवल एक ही हैuture पेशी शाखा के तहत looped है। arteriotomy और तार प्रविष्टि और्विक धमनी से पेशी शाखा के शाखा बिंदु पर प्रदर्शन कर रहे हैं। चोट का प्रदर्शन किया है, के बाद चीरा और्विक धमनी या पेशी शाखा या तो ligating बिना cauterized है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: तार चोट के लिए दो तकनीकों का महत्वपूर्ण कदम के उच्च बढ़ाई तस्वीरें दाग़ना विधि (नीचे) को बंधाव विधि (ऊपर) के लिए कदम की बंद हुआ तुलना।। arteriotomy के स्थान धराशायी लाइन के साथ सीमांकन किया गया है। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा।

चित्र तीन
चित्रा 3:। 14 दिनों धमनियों वर्गों से प्रक्रिया Histological के बाद तार चोट के प्रतिनिधि ऊतकीय परिणाम hematoxylin और eosin (ऊपर) और Movat के pentachrome धुंधला (नीचे) के साथ दाग रहे थे। छवि में लेबल लुमेन (एल), intima (आई) और लोचदार लामिना (ईएल) कर रहे हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Straight spring wire, 0.15” diameter Cook G02426
High Temperature cautery Bovie Medical Corp. HIT1
High-temperature fine tip for cautery Bovie Medical Corp. H101
Micro-scissors Fine Science Tools 15000-13 For performance of arteriotomy
Angled fine-tipped forceps Fine Science Tools 11251-35 For blunt dissection of vascular bundle
Angled forceps Roboz RS-5069 For clearing tissues
Surgical scissors Roboz RS-5840 For cutting skin
Retractor Fine Science Tools 18200-10
Retractor wire Fine Science Tools 18200-05 Attached to retractor
Base plate Fine Science Tools 18200-03 For use with retractor
Magnetic retractor fixator Fine Science Tools 18200-01
Needle Holder Roboz RS-7822
Hemostatic forceps Biomedical Research Instruments, Inc. 34-1000
Dissecting microscope Meiji Techno EMZ-5TR
Microscope light source Meiji Techno FT191
Warm water recirculator Gaymar TP-500 For maintaining mouse body temperature
Reusable heating pad Gaymar TP-R 22G For maintaining mouse body temperature
Lidocaine Various
4.0 Vicryl suture with half circle needle Ethicon J494G For post-surgical wound closure
Sterile cotton-tipped applicators Puritan 25-806-2WC For application of depilatory cream and absorbing fluids
Depilatory cream Nair
Isoflurane Various
Betadine Various
70% ethanol Various
6.0 braided silk suture Teleflex Medical 4-S For isolation of femoral artery during surgery
0.9% sodium chloride Various For irrigating tissues
Gel eye lubricant Various
Glass Petri dish Pyrex 3160-60 For femoral artery harvest
10% buffered formalin Various For fixation of femoral artery
70% ethanol Various For fixation of femoral artery
Bouin's fluid Electron Microscopy Sciences For Movat's Pentachrome staining
Alcian blue, 1% Electron Microscopy Sciences 26385-01 For Movat's Pentachrome staining
Alkaline alcohol Electron Microscopy Sciences 26385-02 For Movat's Pentachrome staining
Orcein, 0.2% Electron Microscopy Sciences 26385-03 For Movat's Pentachrome staining
Hematoxylin alcoholic, 5% Electron Microscopy Sciences 26385-04 For Movat's Pentachrome staining
Ferric chloride, 10% Electron Microscopy Sciences 26385-05 For Movat's Pentachrome staining
Lugol's Iodine Electron Microscopy Sciences 26385-06 For Movat's Pentachrome staining
Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution Electron Microscopy Sciences 26385-07 For Movat's Pentachrome staining
Acetic acid, 0.5% Electron Microscopy Sciences Various For Movat's Pentachrome staining
Phosphotungstic acid, 5% Electron Microscopy Sciences 26385-09 For Movat's Pentachrome staining
Alcoholic saffron, 6% Electron Microscopy Sciences 26385-10 For Movat's Pentachrome staining

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References

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Le, V., Johnson, C. G., Lee, J. D., Baker, A. B. Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch. J. Vis. Exp. (96), e52403, doi:10.3791/52403 (2015).

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