Protocol
참고 :이 프로토콜에 표시된 모든 방법은 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
외과 표 1. 준비
- 해부 현미경, 수술 테이블에 따뜻한 물을 재순환과 가열 패드를 설정합니다. 가열 패드 상 스테인리스 기판을 놓는다. 베이스 플레이트와 가열 패드에 멸균 흡수 패드를 놓습니다.
- 인접한 멸균 흡수 패드에 멸균 된 수술 도구를 정렬합니다. 각진 끝이 뾰족한 집게 두 쌍의 각도 포셉 두 쌍의 세 지혈 겸자, 두 견인기 와이어, 작은 수술 가위, 마이크로 가위, 한 혈관 성형술 와이어 (0.15 인치 직경) 6.0 실크 봉합사의 세 6 인치 세그먼트를 수집 .
- 대퇴 동맥의 곡률과 일치하도록 혈관 성형술 와이어의 원형 단부를 구부린다. 이렇게하면, 수술 중에 와이어를 전진하게된다.
2. 준비외과 마우스
- 2.5 % 이소 플루 란 흡입에 의해 연속적으로 마우스를 마취. 절차를 통해 동물의 상태를 모니터링해야합니다. 완전히 마취하는지 확인하려면 마우스의 발 핀치 테스트를 수행합니다. 핀치 테스트 투여 할 때 움직이지 않는 동물을 확인합니다.
- 탈수를 방지하기 위해 동물의 눈 연고 윤활 적용. 수술 테이프를 사용하여 흡수 패드에 앙와위에서 동물을 고정합니다. 코 콘을 통해 2.5 %의 이소 플루 란을 투여 계속합니다.
- 제모 크림을 사용하여, 중간 선에 다리와 복부에서 모피를 제거합니다. 물로 피부를 씻어. 탈모는 수술에 앞서 일일 수행 될 수있다. 피부 자극이 발생할 수 있습니다 크림과 함께 과도한 치료를합니다.
- 즉시 수술 전에 피부를 소독하기 위해 면봉으로 면도 한 지역에 포비돈 - 요오드를 적용합니다. 70 % 에탄올 건조와 면도 한 피부를 씻어멸균 면봉으로. 3 번 반복합니다.
- 피하 주사를 통해 카프로 펜의 5 ㎎ / ㎏의 수술 전 투여 량을 관리합니다.
대퇴 동맥의 3. 분리
- 작은 수술 가위를 사용하여, 대퇴 동맥 위에 피부 절개를 만곡. 퉁명스럽게 대퇴 동맥을 찾기 위해 견인기 자기 트랙터 fixators을 사용하여 주변 조직을 해부 고정합니다. 멸균 면봉을 사용하여 식염수를 적용 관개를 위해 주기적으로 생리 식염수를 사용하여 조직을 적 십니다.
- 집게를 사용하여 대퇴 동맥을 분리합니다. 부드럽게 끝이 뾰족한 집게를 사용하여 혈관 번들에서 신경을 분리합니다. 정맥을 천공하지 말고, 신경에 손상을주지 않습니다. 그것을 자극 피하려면 번들에서 신경을 밀어 넣습니다.
- 조심스럽게 대퇴 분기의 위치, 대퇴 동맥에서 대퇴 정맥을 분리합니다. 분기의 지역은 해부 특히 어렵다.
- 피osterior 분기에, 루프 지혈과 대퇴 동맥과 보안에서 6.0 실크 봉합사. 이 근위 봉합사 동맥 혈류를 제한하는 데 사용된다.
주 : 소작 방법 대 결찰 방법을 수행 할 때 관계에 다소 차이가있다 (도 1 및도 2 참조). - 분기에 원위부, 루프 6.0 실크 대퇴 동맥에서 봉합 및 지혈 고정합니다. 동맥의 위치에있는이 말단 봉합 보조.
- 대퇴 동맥의 근육 분기 아래 루프 두 봉합, 그것들을 미리 묶어 지혈 고정합니다. 식염수로 조직을 습하게해야합니다. 와이어 부상 소작 방법을 수행하면, 하나의 루프 형 봉합사 근육 지점에 필요하다.
대퇴 동맥 와이어 부상 4. 성능
- 근위 봉합사 당기는 대퇴 동맥에 혈류를 제한한다. 약간 먼 hemost 당겨지혈이 지점을 확보에서와 arteriotomy의 사이트를 노출합니다. 주위 봉합을 매서 근육 분기를 결찰.
주 : 상향 동맥 리프팅보다 효과적으로 가로 당김 형보다 혈류를 제한 할 것이다. - 두 봉합 사이의 소작으로 작은 지점을 끊다. 마이크로 가위를 사용하여 분기의 측면 지점에서 arteriotomy을 수행합니다. 마이크로 가위를 안정화 외과 테이프의 롤에 균형 집게를 사용합니다.
- 끝이 뾰족한 집게를 사용 arteriotomy의 존재를 확인합니다. 부드럽게 집게로 arteriotomy의 오프닝을 들어 올립니다. 집게를 사용 arteriotomy에 와이어의 둥근 끝을 소개합니다. 와이어의 발전을 용이하게하기 위해, 주사기를 사용하여 영역 리도카인 한두 방울을 가하여.
- 와이어 근위 봉합사 도달하면 봉합사를 해제하고 와이어의 전진을 방해 할 수 없도록하여 조정한다. 이 더 진행되지 때까지 와이어를 삽입합니다. 번째의 선단전자 와이어 사타구니 인대의 영역에서 중지해야합니다.
- 와이어가 1 분 동안 대퇴 동맥에 남아 허용합니다. 손상과 대퇴 동맥의 내피 세포를 발가 벗기다 데 10 시간을 1 분 후에, 철회 및 절단 운동에 와이어를 진행합니다. 덜 심각한 상해, 와이어 및 동맥 뽑아 횟수를 줄이거 나 단 1 분간 동맥 선을 떠난다.
- 천천히 와이어를 집어 넣으십시오. 와이어의 단부는 둥근 근위 봉합사를 경과하면, 근위 봉합사 당기는 동맥 내로 유동을 제한한다. 완전히 선을 후퇴.
5. 근육 지점을 결찰
- 근육 분기에 남아있는 봉합사를 조입니다. 이 arteriotomy에서 출혈을 방지 할 수 있습니다. 근육 분기에 흐름을 반환하고, 그 혈액이 누출되지 확인합니다. 근육 분기에 봉합에서 끝을 낸다.
6. 다른 방법 : 현지화 된 카우Arteriotomy의 terization
주 : 대안은 근육 분기의 결찰을 피하고 큰 메인 대퇴 동맥 혈관을 통해 액세스 할 수 있도록 수행 될 수있다.
- 4.1에서 시작, 근위 봉합 당겨 대퇴 동맥에 흐름을 제한 할 수 있습니다. 말단 봉합하고 arteriotomy의 사이트 (그림 1과 그림 2) 노출 약간 근육 분기를 고정 봉합을 당깁니다.
- 마이크로 가위를 사용하여, 대퇴 동맥과 근육 지점의 분기점에서 arteriotomy를 수행합니다. 절개 동맥 측 이루어진 경우, 소작하기 쉬울 수있다. 마이크로 가위를 안정화 외과 테이프의 롤에 균형 집게를 사용합니다.
- 소작의 성공을 테스트하려면, 근위 봉합을 풀어 대퇴 동맥에 흐름을 복원합니다. 출혈 arteriotomy에서 발생하면, 소작을 반복한다. 소작이 성공하면, 혈류를 다시한다arteriotomy 원위부 저장됩니다.
- 와이어를 소개하고 4 절에 설명 된대로 와이어 부상을 수행합니다.
- 대퇴 동맥으로 혈액의 흐름을 제한 계속합니다. 적어도 6인치 마우스에서 멀리 뾰족한 소작을 가열. 소작 팁이 냉각으로, 절개를 닫습니다 arteriotomy의 다른 쪽면을 가볍게 적용됩니다.
- 소작의 성공을 테스트하려면, 근위 봉합을 풀어 대퇴 동맥에 흐름을 복원합니다. 출혈 arteriotomy에서 발생하면, 소작을 반복한다. 소작이 성공하면, 혈류 arteriotomy 원위부 복원한다. 임시 근위 및 원위 관계를 제거합니다.
혈관 주위 약물 전달 패치 7. 주입
- 이전의 연구 (11)에서 또는 이와 유사한 방법을 사용하여 기술 된 바와 같이 혈관 주위 약물 패치를 생성하는 생성 될 수있다. 멸균 가위를 사용하여 약물 전달 패치의 배리어 영역의 모서리를 무디게
- 약물 전달 팻 배치동맥 대향 약물 방출면이 부상 대퇴 동맥 상 CH. 필요에 따라, 패치의 위치를 개선하는 집게를 사용한다.
8. 상처 폐쇄 및 복구
- 광장 노트로 구성된 간단한 중단 봉합 상처를 닫습니다. 불연속 봉합사 동물 봉합사를 제거하려고 할 경우에 상처 봉합을 연장.
- 마취를 끄고 설정부터 동물을 제거합니다. 동물이 온난화 패드에 복구 할 수 있습니다.
- 마우스의 회복을 모니터링하기 위해 계속합니다. 이 닫혀 있는지 확인하기 위해 매일 절개 사이트를 확인하십시오. 수술 후 통증의 치료를 위해 2 일 후 매 12 시간을 수술 후 5 ㎎ / 카프로 펜마다 12 시간의 kg의 피하 주사를 관리합니다. 통증이 초기 이일 이상 계속되면, 더 진통제에 대한 방향에 대한 수의사에게 문의하십시오.
조직학 9. 수확 대퇴 동맥
- 수술 후 이십팔일에서 마우스 이산화탄소 안락사를 수행합니다.
주 : 이산화탄소의 적절한 유량이 분당 챔버 10-30 %로 치환해야하며, 사용 된 챔버의 크기에 따라 달라진다. 다이어프램과 심장 천자의 절단은 안락사의 보조 방법으로 수행해야합니다. - 수술 테이프를 사용 누운 위치에 마우스를 고정합니다. 초기 수술 절개가되었다 대퇴 동맥을 통해 절개를합니다.
- 손상된 동맥과 반대쪽 다리에서 손상되지 않은 동맥, 모두 퉁명스럽게 해부 대퇴 동맥을 찾기 위해 견인기 및 자기 견인기 fixators을 사용하여 주변 조직에 고정합니다. 주기적으로 관개 식염수를 사용하여 조직을 적 십니다. 멸균 면봉을 사용하여 식염수를 적용합니다. 동맥을 손상하지 않도록주의하십시오.
- 대퇴 동맥 복부 대동맥에 arteriotomy 원래의 위치로부터 분리 된 후, SEG 넥타이arteriotomy의 원래 사이트 근처 실크 봉합사, 표준. 이 봉합사 대퇴 동맥의 가장 말단부를 확인하고 샘플의 처리를 완화 시키는데 도움이된다.
- 마이크로 해부 가위를 사용하면 대퇴 동맥을 절제합니다. 봉합 한 절개는 원위부합니다. 복부 대동맥 옆에, 대퇴 동맥의 반대쪽에 다른 절개를합니다.
- 식염수가 들어있는 유리 페트리 접시에 절제 동맥을 전송합니다. 초과 결합 조직이나 지방을 제거하기 위해 추가로 동맥을 해부하다. 부드럽게 식염수로 세척하여 루멘에서 혈액을 제거합니다.
- 10 % 포르말린의 유리 병에 동맥을 전송합니다. 부드러운 48 시간 동안 락을 함께 4 ° C에서 유리 병을 저장합니다.
- 가 조직학을 위해 처리 될 때까지 저장하기 위해 70 % 에탄올에 고정 동맥 전송.
- 파라핀 블록과 부분 염색에 대한 블록 동맥을 포함합니다.
- 부상과 내막 우울의 정도를 평가하기 위해 조직 화학 및 면역 화학 염색을 수행erplasia.
참고 : 대표 결과를 위해, 우리는 탄성 얇은 판과 다른 동맥의 구성 요소를 시각화하기 위해 핵 및 전반적인 형태 또는 Movat의 Pentachrome 얼룩을 시각화하기 위해 헤 마톡 실린 및 에오신을 사용했다.
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Representative Results
와이어 부상에 따라, 신생 내막의 증식은 시간이 지남에 개발하고 일반적으로 14-28일 후 검사한다. 그림의 조직 학적 결과를 그림과 같이 마우스의 내막 증식증의 강력한 세대에이 작품 리드에 설명 된 기술은 3. 손상되지 않은 대퇴 동맥은 그대로 탄성 얇은 판과 일반 두께와 둘레를 시연 할 예정이다. 부상 대퇴 동맥은 내막의 증식을 보여 탄성 얇은 판을 분해하고 나중에 지점에서 재 내피 세포를 시연 할 예정이다. 재 내피 세포 주위 이십일일 전형적 완료 그러나 이것은, 주사 전자 현미경을 사용하여 마우스의 배경 균주에 의존하며, 바람직하게, 에반 블루 염료를 사용하여 얼굴 제제 도중에 측정 내피 섹션 마커 또는 대한 면역 염색을 이용하여 평가할 수있다 또는 동맥의 얼굴 엔 준비에 공 초점 현미경으로 면역 염색. 17, 18 내막 증식증의 정량을 위해 그것은동맥의 손상 영역의 길이를 따라 잠재적 인 변동을 고려하기 위해 손상된 동맥을 따라 3 개 사이트에서 내막의 면적 또는 내막 - 투 - 미디어 비율을 측정하는 것이 가장 좋습니다.
도 1 : 대퇴 동맥 와이어 부상 두 방법의 중요한 단계들의 사진 와이어 부상을 행하는 소작 방법 (아래)에 결찰 방법 (상)에 대한 단계의 비교.. 결찰 방법에있어서, 분기를 고정 근육 봉합사 개의 미리 묶이지들은 근육 분기를 결찰하도록 강화 될 수 있도록. 두 근육 분기 봉합의 더 먼은 강화된다. arteriotomy 및 와이어 삽입은 근육 지점에서 수행됩니다. 부상이 수행 된 후, 분기에 근육 봉합사 나머지 조여 트리밍된다. 소작 방법에서는, 단지 하나의uture은 근육 분기에 반복된다. arteriotomy 및 와이어 삽입은 대퇴 동맥의 근육 가지의 분기점에서 수행됩니다. 부상이 수행 된 후, 절개 부위는 대퇴 동맥 또는 근육 가지를 결찰없이 소작. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 와이어 부상에 대한 두 가지 기술의 중요한 단계의 높은 배율 사진 소작 방법 (아래)에 결찰 방법 (위)의 단계 확대 비교.. arteriotomy의 위치는 점선으로 경계가된다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림.
그림 3 :. 십사일 동맥 섹션의 절차를 조직 학적 후 와이어 부상의 대표 조직 학적 결과는 헤 마톡 실린 및 에오신 (위)과 Movat의 pentachrome 염색 (아래)으로 염색 하였다. 이미지에 레이블은 루멘 (L), 내막 (I) 및 탄성 얇은 판 (EL)입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight spring wire, 0.15” diameter | Cook | G02426 | |
| High Temperature cautery | Bovie Medical Corp. | HIT1 | |
| High-temperature fine tip for cautery | Bovie Medical Corp. | H101 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-13 | For performance of arteriotomy |
| Angled fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | For blunt dissection of vascular bundle |
| Angled forceps | Roboz | RS-5069 | For clearing tissues |
| Surgical scissors | Roboz | RS-5840 | For cutting skin |
| Retractor | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Retractor wire | Fine Science Tools | 18200-05 | Attached to retractor |
| Base plate | Fine Science Tools | 18200-03 | For use with retractor |
| Magnetic retractor fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7822 | |
| Hemostatic forceps | Biomedical Research Instruments, Inc. | 34-1000 | |
| Dissecting microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | |
| Microscope light source | Meiji Techno | FT191 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-500 | For maintaining mouse body temperature |
| Reusable heating pad | Gaymar | TP-R 22G | For maintaining mouse body temperature |
| Lidocaine | Various | ||
| 4.0 Vicryl suture with half circle needle | Ethicon | J494G | For post-surgical wound closure |
| Sterile cotton-tipped applicators | Puritan | 25-806-2WC | For application of depilatory cream and absorbing fluids |
| Depilatory cream | Nair | ||
| Isoflurane | Various | ||
| Betadine | Various | ||
| 70% ethanol | Various | ||
| 6.0 braided silk suture | Teleflex Medical | 4-S | For isolation of femoral artery during surgery |
| 0.9% sodium chloride | Various | For irrigating tissues | |
| Gel eye lubricant | Various | ||
| Glass Petri dish | Pyrex | 3160-60 | For femoral artery harvest |
| 10% buffered formalin | Various | For fixation of femoral artery | |
| 70% ethanol | Various | For fixation of femoral artery | |
| Bouin's fluid | Electron Microscopy Sciences | For Movat's Pentachrome staining | |
| Alcian blue, 1% | Electron Microscopy Sciences | 26385-01 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alkaline alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26385-02 | For Movat's Pentachrome staining |
| Orcein, 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26385-03 | For Movat's Pentachrome staining |
| Hematoxylin alcoholic, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-04 | For Movat's Pentachrome staining |
| Ferric chloride, 10% | Electron Microscopy Sciences | 26385-05 | For Movat's Pentachrome staining |
| Lugol's Iodine | Electron Microscopy Sciences | 26385-06 | For Movat's Pentachrome staining |
| Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution | Electron Microscopy Sciences | 26385-07 | For Movat's Pentachrome staining |
| Acetic acid, 0.5% | Electron Microscopy Sciences | Various | For Movat's Pentachrome staining |
| Phosphotungstic acid, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-09 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alcoholic saffron, 6% | Electron Microscopy Sciences | 26385-10 | For Movat's Pentachrome staining |
References
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