Protocol
MERK: Alle metoder som er vist i denne protokollen er godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Utarbeidelse av kirurgisk Table
- Satt opp varmeputen med resirkulere varmt vann på den kirurgiske bordet, under disseksjon mikroskop. Plasser rustfritt stål bunnplate på varmeputen. Plasser en steril absorberende puten på bunnplaten og varmepute.
- Ordne sterile kirurgiske verktøy på en tilstøtende steril absorberende pute. Samle to par av vinklede spiss tang, to par skråstilte tang, tre hemostatiske tang, to retraktorer ledninger, små kirurgiske sakser, mikro-saks, en angioplastikk tråd (0,15 mm diameter) og tre 6-tommers segmenter av 6,0 silkesutur .
- Bøyes rundt enden av det angioplastiske ledningen for å passe krumning av lårarterien. Dette vil gjøre det lettere å fremme ledning under operasjonen.
2. Utarbeidelse avMus for kirurgi
- Bedøve en mus ved kontinuerlig innånding av 2,5% isofluran. Sørg for å overvåke status dyrets gjennom hele prosedyren. Utfør en klype test av musens foten for å bekrefte at det er fullt bedøvet. Sikre at dyret ikke beveger seg når den klype test administreres.
- Påfør en smør salve til dyrets øyne for å hindre uttørking. Sikre dyret i liggende stilling til den absorberende puten ved hjelp av kirurgisk tape. Fortsett å administrere 2,5% isofluran via nesen membran.
- Ved hjelp av en Hårfjerningskrem, fjerne pels fra benet og magen til midtlinjen. Skyll huden grundig med vann. Hårfjerning kan utføres en dag i forkant av operasjonen. Legg merke til at overdreven behandling med krem kan føre til hudirritasjon.
- Umiddelbart før operasjonen, gjelder povidon-jod til depilated område med en bomullsspisset applikator å sterilisere hud. Skyll depilated huden med 70% etanol og tørrmed en steril bomull-tipped applikator. Dette gjentas 3 ganger.
- Administrere en preoperativ dose på 5 mg / kg av karprofen via subkutan injeksjon.
3. Isolering av lårarterie
- Ved hjelp av små kirurgiske sakser, få en buet innsnitt i huden over lårarterien. Omsvøp dissekere og sikre omkringliggende vev ved hjelp retraktorer magnetisk Retractor fixators å finne lårarterie. Fukt vev jevne bruker saltvann for vanning Apply saltvann ved hjelp av en steril bomull-tipped applikator.
- Isolere lårarterie med tang. Forsiktig skille nerve fra det vaskulære bunt hjelp tynn tang. Unngå punktering venen, og ikke skade nerve. Skyv nerve unna bunt for å unngå å stimulere den.
- Forsiktig skille lårvenen fra lårarterien, å finne den femorale bifurkasjon. Regionen forgreningen er spesielt vanskelig å dissekere.
- Posterior til forgreningen, loop en 6,0 silke sutur under lårarterie og sikre med en hemostat. Denne proksimale suturen skal brukes til å begrense blodstrømmen i arterien.
MERK: det er en liten variasjon i båndene ved utførelse av ligeringsmetoden versus kauteriseringen metoden (se figur 1 og figur 2). - Distal til forgreningen, loop 6,0 silke sutur under lårarterie og sikre med en hemostat. Denne distale sutur hjelpemidler i posisjoneringen av arterien.
- Loop to sting under muskuløs grenen av lårarterie, pre-tie dem og sikre med en hemostat. Husk å fukte vevet med saltvann. Hvis du utfører kirurgi metode for ledningen skade, er bare ett loopet sutur nødvendig på den muskuløse gren.
4. Utførelse av femoralis Wire Injury
- Begrense blodstrømmen i lårarterien ved å trekke den proksimale sutur. Litt trekk distal Hemostpå og hemostat sikre grenen å eksponere området for arteriotomi. Ligate den muskuløse gren ved å knytte den sutur rundt det.
MERK: Løfte arterie oppover vil mer effektivt begrense blodstrøm enn å trekke horisontalt alene. - Kutte liten gren med kirurgi mellom de to sting. Ved hjelp av mikro-saks, utføre en arteriotomi i sidegren av forgreningen. Bruk pinsett balansert på en rull med kirurgisk tape for å stabilisere mikro saks.
- Bekrefte tilstedeværelse av arteriotomi bruker tynn tang. Løft forsiktig åpning av arteriotomi med pinsett. Introdusere den avrundede enden av ledningen inn i arteriotomi med tang. For å lette fremføringen av tråden, legge en eller to dråper av lidokain til området ved hjelp av en sprøyte.
- Når tråden når den proksimale sutur, slipper sutur og justere den slik at den ikke kan hindre fremføring av tråden. Sett ledningen inntil det ikke kan komme videre. Tuppen av the ledning skal slutte i regionen av lyskeligament.
- At tråden skal forbli i den femorale arterien i ett minutt. Etter ett minutt, trekke tilbake og avansere ledningen i en saging bevegelse ti ganger for å skade og denude endotelet av femoral arterien. For en skade av mindre alvorlighetsgrad, redusere antall ganger ledningen trekkes inn og ut av arterien eller la ledningen i arterien i 1 min bare.
- Trekke ledningen sakte. Når den runde ende av ledningen har passert den proksimale sutur, begrense strømningen inn i arterien ved å trekke den proksimale sutur. Trekke ledningen helt.
5. ligere Muskel Branch
- Stram de rester sutur på den muskuløse gren. Dette vil hindre blødning fra arteriotomi. Returledning i muskel gren, og bekrefter at blod er ikke lekker fra den. Trim endene fra sting på den muskuløse gren.
6. Alternativ metode: Lokalisert Cauterization av arteriotomi
MERK: En alternativ tilnærming kan tas for å unngå ligation av den muskuløse gren og la vaskulær tilgang gjennom større hoved lårarterie.
- Å starte fra 4,1, begrense strømning i den femorale arterien ved å trekke i den proksimale sutur. Trekk distale sutur og suturen sikre muskulær gren litt for å eksponere stedet for arteriotomi (figur 1 og figur 2).
- Ved hjelp av mikro-saks, utføre en arteriotomi ved avdelings punktet i femoralarterie og muskuløs gren. Dersom snittet er gjort i siden av arterien, kan det være enklere å etse. Bruk pinsett balansert på en rull med kirurgisk tape for å stabilisere mikro saks.
- For å teste effekten av kauterisering, gjenopprette strømmen til femoralarterie ved å løsne den proksimale sutur. Hvis blødningen oppstår fra arteriotomi, gjenta kirurgi. Hvis kirurgi er vellykket, vil blodstrømmen bli relagret distalt for arteriotomi.
- Introdusere ledningen og utføre ledningen skade som beskrevet i kapittel 4.
- Fortsett å begrense blodstrøm i lårarterien. Varm en tynn Kirurgi minst seks inches bort fra musen. Som kirurgi spissen kjøler, gjelder det lett siden av arteriotomi å lukke såret.
- For å teste effekten av kauterisering, gjenopprette strømmen til femoralarterie ved å løsne den proksimale sutur. Hvis blødningen oppstår fra arteriotomi, gjenta kirurgi. Hvis kirurgi er vellykket, vil blodstrømmen bli gjenopprettet distal til arteriotomi. Fjerne den midlertidige proksimale og distale bånd.
7. Implantasjon av perivaskulære Drug Delivery Patch
- Lag en perivaskulær narkotika patch kan opprettes som beskrevet i tidligere studier 11 eller ved å bruke lignende metoder. Sløv hjørnene av barriereområdet av medikamentavgivelsesplaster ved hjelp av steril saks
- Plasser stoffet levering klapplm på den skadde lårarterie med narkotika-frigjørende siden som vender mot arterien. Som nødvendig, bruk tang for å forbedre plasseringen av plasteret.
8. lukking av sår og gjenoppretting
- Lukke såret med en enkel avbrutt sutur som består av kvadratiske knop. En diskontinuerlig sutur forlenger lukking av sår i tilfelle dyret forsøker å fjerne sutur.
- Slå av anestesi og fjerne dyret fra settet opp. At dyret kan komme seg på oppvarmingen pad.
- Fortsette å overvåke musens utvinning. Sjekk snittet området hver dag for å sikre at det forblir lukket. For behandling av post-operativ smerte, administrere en subkutan injeksjon av 5 mg / kg av karprofen hver 12. time etter kirurgi og deretter hver 12. time i 2 dager. Hvis smertene vedvarer utover de første to dagene, oppsøke veterinær for retninger på ytterligere smertestillende medikamenter.
9. Høsting Lårarterier for histologi
- På 28 dager etter kirurgi, utfører karbondioksid dødshjelp på musen.
MERK: Den passende strømningshastighet for karbondioksyd skal fortrenge 10 til 30% av kammeret per minutt, og vil variere avhengig av størrelsen av kammeret benyttes. Kutting av diafragma og hjerte punktering bør utføres som en sekundær metode for aktiv dødshjelp. - Fest musen i liggende stilling ved hjelp av kirurgisk tape. Lage et snitt over femoralarterie, der den første kirurgiske innsnitt ble gjort.
- For både den skadde arterien og uskadde arterie fra motsatt ben, uten omsvøp dissekere og sikre omkringliggende vev ved hjelp Saker og magnetiske Retractor fixators å finne lårarterie. Fukt vev jevne bruker saltvann for vanning. Påfør saltvann ved hjelp av en steril bomull-tipped applikator. Pass på å ikke skade arterien.
- Etter lårarterie har vært isolert fra stedet til den opprinnelige arteriotomi i hovedpulsåren, knyt en SEGling av silke sutur nær det opprinnelige området av arteriotomi. Denne sutur vil bidra til å identifisere den mest fjerntliggende ende av lårarterien og lette håndtering av prøven.
- Bruke mikro-disseksjon saks for å kutte ut lårarterie. Gjør ett snitt distal til sutur. Gjøre den andre innsnitt på den motsatte ende av den femorale arterie, ved siden av den abdominale aorta.
- Overfør det utskårede arterien til en glass petriskål med salt. Dissekere arterie ytterligere for å fjerne overflødig bindevev eller fett. Forsiktig fjerne blod fra lumen ved skylling med saltvann.
- Overfør arterien til en ampulle med 10% bufret formalin. Oppbevare ampullen ved 4 ° C med forsiktig risting i 48 timer.
- Overfør den faste arterie til 70% etanol, for å lagre inntil den er behandlet for histologi.
- Embed arterien i parafinblokker og seksjon blokkene for farging.
- Utføre histokjemisk og immunokjemisk flekker å vurdere omfanget av skaden og intimal HYPerplasia.
MERK: For de representative resultater, brukte vi Hematoxylin og eosin å visualisere kjernen og generell morfologi eller en Movat sin Pentachrome flekken for å visualisere elastisk lameller og andre arterielle komponenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter trådskade, utvikler neointimal hyperplasi over tid og blir vanligvis undersøkt etter 14 til 28 dager. De teknikker som er beskrevet i dette arbeid gir robust generering av intimal hyperplasi hos mus som vist histologiske resultater i figur 3. En uninjured lårarterie vil demonstrere intakt elastiske lameller, og en normal tykkelse og omkrets. En skadet lårarterie vil vise intimal hyperplasi, degradert elastisk lameller og demonstrere re-endotelialisering på senere tidspunkter. Re-endotelialisering er vanligvis ferdig på rundt 21 dager, men dette avhenger av bakgrunnen stamme av musene som brukes og kan vurderes ved hjelp farging for endotelceller markører på seksjoner eller fortrinnsvis målt på eget ansikt forberedelser ved hjelp av Evans blått fargestoff, scanning elektronmikroskopi eller farging med konfokalmikroskopi på eget ansikt preparater av arterien. 17,18 For kvantifisering av intimal hyperplasia deter best å måle intimal området eller intima-to-media-forhold på tre steder langs den skadede arterie å ta hensyn til mulige variasjoner langs lengden av den skadede delen av arterien.
Figur 1: Fotografier av de kritiske trinnene av de to metodene for ledning skade i lårarterieområdet En sammenligning av trinnene for ligation metoden (øverst) til kirurgi metoden (nederst) for å utføre ledning skade.. I ligeringsmetoden, de to sting som fester muskulær gren er pre-bundet slik at de kan strammes for å ligere den muskulære gren. Jo mer distale av de to muskulære gren suturer strammes. Den arteriotomi og wire innsetting utføres i muskel gren. Etter skaden er utført, blir gjenværende sutur på den muskuløse gren strammet og trimmet. I kirurgi metoden, bare ett suture sløyfes under muskuløs gren. Den arteriotomi og wire innsetting utføres ved avdelings poenget med den muskuløse gren fra lårarterie. Etter skaden er utført, er snittet cauterized uten å ligere enten lårarterie eller muskuløs gren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Høyere forstørrelse fotografier av de kritiske trinn av de to teknikkene for ledning skade nærbilde sammenligning av fremgangsmåten for ligeringsmetode (top) til den kirurgi metoden (nederst).. Plasseringen av arteriotomi er avgrenset med stiplet linje. Klikk her for å se en større versjon av dettefigur.
Figur 3:. Representative histologiske resultater av wire skade 14 dager etter inngrepet Histologisk fra arterier seksjonene ble farget med Hematoxylin og eosin (øverst) og Movat sin pentachrome flekker (nederst). Merket i bildet er det lumen (L), intima (I) og elastisk lamina (EL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight spring wire, 0.15” diameter | Cook | G02426 | |
| High Temperature cautery | Bovie Medical Corp. | HIT1 | |
| High-temperature fine tip for cautery | Bovie Medical Corp. | H101 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-13 | For performance of arteriotomy |
| Angled fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | For blunt dissection of vascular bundle |
| Angled forceps | Roboz | RS-5069 | For clearing tissues |
| Surgical scissors | Roboz | RS-5840 | For cutting skin |
| Retractor | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Retractor wire | Fine Science Tools | 18200-05 | Attached to retractor |
| Base plate | Fine Science Tools | 18200-03 | For use with retractor |
| Magnetic retractor fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7822 | |
| Hemostatic forceps | Biomedical Research Instruments, Inc. | 34-1000 | |
| Dissecting microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | |
| Microscope light source | Meiji Techno | FT191 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-500 | For maintaining mouse body temperature |
| Reusable heating pad | Gaymar | TP-R 22G | For maintaining mouse body temperature |
| Lidocaine | Various | ||
| 4.0 Vicryl suture with half circle needle | Ethicon | J494G | For post-surgical wound closure |
| Sterile cotton-tipped applicators | Puritan | 25-806-2WC | For application of depilatory cream and absorbing fluids |
| Depilatory cream | Nair | ||
| Isoflurane | Various | ||
| Betadine | Various | ||
| 70% ethanol | Various | ||
| 6.0 braided silk suture | Teleflex Medical | 4-S | For isolation of femoral artery during surgery |
| 0.9% sodium chloride | Various | For irrigating tissues | |
| Gel eye lubricant | Various | ||
| Glass Petri dish | Pyrex | 3160-60 | For femoral artery harvest |
| 10% buffered formalin | Various | For fixation of femoral artery | |
| 70% ethanol | Various | For fixation of femoral artery | |
| Bouin's fluid | Electron Microscopy Sciences | For Movat's Pentachrome staining | |
| Alcian blue, 1% | Electron Microscopy Sciences | 26385-01 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alkaline alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26385-02 | For Movat's Pentachrome staining |
| Orcein, 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26385-03 | For Movat's Pentachrome staining |
| Hematoxylin alcoholic, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-04 | For Movat's Pentachrome staining |
| Ferric chloride, 10% | Electron Microscopy Sciences | 26385-05 | For Movat's Pentachrome staining |
| Lugol's Iodine | Electron Microscopy Sciences | 26385-06 | For Movat's Pentachrome staining |
| Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution | Electron Microscopy Sciences | 26385-07 | For Movat's Pentachrome staining |
| Acetic acid, 0.5% | Electron Microscopy Sciences | Various | For Movat's Pentachrome staining |
| Phosphotungstic acid, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-09 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alcoholic saffron, 6% | Electron Microscopy Sciences | 26385-10 | For Movat's Pentachrome staining |
References
- Hoffmann, R., Mintz, G. S. Coronary in-stent restenosis - predictors, treatment and prevention. Eur Heart J. 21 (21), 1739-1749 (2000).
- Erbel, R., et al. Coronary-artery stenting compared with balloon angioplasty for restenosis after initial balloon angioplasty. Restenosis Stent Study Group. N Engl J Med. 339 (23), 1672-1678 (1998).
- Farooq, V., Gogas, B. D., Serruys, P. W. Restenosis: delineating the numerous causes of drug-eluting stent restenosis. Circ Cardiovasc Interv. 4 (2), 195-205 (2011).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. Br Med Bull. 106, 193-211 (2013).
- Garg, S., Serruys, P. W. Coronary stents: current status. J Am Coll Cardiol. 56 (10 Suppl), S1-S42 (2010).
- Park, S. J., Kim, Y. H. Current status of percutaneous coronary intervention with drug-eluting stents in Asia. Circulation. 118 (25), 2730-2737 (2008).
- Alfonso, F. Treatment of drug-eluting stent restenosis the new pilgrimage: quo vadis. J Am Coll Cardiol. 55 (24), 2717-2720 (2010).
- Dake, M. D., et al. Paclitaxel-eluting stents show superiority to balloon angioplasty and bare metal stents in femoropopliteal disease: twelve-month Zilver PTX randomized study results. Circ Cardiovasc Interv. 4 (5), 495-504 (2011).
- Bosiers, M., et al. Results of the Protege EverFlex 200-mm-long nitinol stent (ev3) in TASC C and D femoropopliteal lesions. J Vasc Surg. 54 (4), 1042-1050 (2011).
- Duda, S. H., et al. Drug-eluting and bare nitinol stents for the treatment of atherosclerotic lesions in the superficial femoral artery: long-term results from the SIROCCO trial. J Endovasc Ther. 13 (6), 701-710 (2006).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17 (10), 2238-2244 (1997).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Roque, M., et al. Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20 (2), 335-342 (2000).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. Mouse model of arterial injury. Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).
- Edelman, E. R., Adams, D. H., Karnovsky, M. J. Effect of controlled adventitial heparin delivery on smooth muscle cell proliferation following endothelial injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (10), 3773-3777 (1990).
- Stemerman, M. B., Ross, R. Experimental arteriosclerosis. I. Fibrous plaque formation in primates, an electron microscope study. J Exp Med. 136 (4), 769-789 (1972).
- Brouchet, L., et al. Estradiol accelerates reendothelialization in mouse carotid artery through estrogen receptor-alpha but not estrogen receptor-beta. Circulation. 103 (3), 423-428 (2001).
- Filipe, C., et al. Estradiol accelerates endothelial healing through the retrograde commitment of uninjured endothelium. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2822-H2830 (2008).
- Feuls, R., et al. Microvascular denudation of the femoral artery of the mouse as a model for restenosis. Rofo. 175 (7), 952-957 (2003).
- Holt, A. W., Tulis, D. A. Experimental Rat and Mouse Carotid Artery Surgery: Injury & Remodeling Studies. ISRN Minim Invasive Surg. 2013, (2013).
- Iafrati, M. D., et al. Estrogen inhibits the vascular injury response in estrogen receptor alpha-deficient mice. Nat Med. 3 (5), 545-548 (1997).
- Sullivan, T. R., et al. Estrogen inhibits the response-to-injury in a mouse carotid artery model. J Clin Invest. 96 (5), 2482-2488 (1995).
- Yin, Y., Zhao, X., Fang, Y., Huang, L. Carotid artery wire injury mouse model with a nonmicrosurgical procedure. Vascular. 18 (4), 221-226 (2010).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. J Vis Exp. (40), (2010).
- Kuhlmann, M. T., et al. Implantation of a carotid cuff for triggering shear-stress induced atherosclerosis in mice. J Vis Exp. (59), (2012).
- Carmeliet, P., et al. Vascular wound healing and neointima formation induced by perivascular electric injury in mice. Am J Pathol. 150 (2), 761-776 (1997).
