Protocol
NOTA: Todos los métodos que se muestran en este protocolo han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional.
1. Preparación de la Tabla quirúrgico
- Configurar la almohada eléctrica con recirculación de agua caliente en la mesa de operaciones, bajo el microscopio de disección. Colocar la placa base de acero inoxidable en la almohadilla de calefacción. Coloque una almohadilla absorbente estéril en la placa base y el cojín de la calefacción.
- Organizar las herramientas quirúrgicas estériles sobre una almohadilla absorbente estéril adyacente. Reunir dos pares de pinzas finas con punta en ángulo, dos pares de pinzas en ángulo, tres pinzas hemostáticas, dos hilos retractores, pequeñas tijeras quirúrgicas, micro-tijeras, alambre de una angioplastia (diámetro 0,15 pulgadas) y tres segmentos de 6 pulgadas de sutura de seda 6.0 .
- Doblar el extremo redondo del cable de angioplastia para que coincida con la curvatura de la arteria femoral. Esto hará que sea más fácil para avanzar el alambre durante la cirugía.
2. Preparación deRatón de Cirugía
- Anestesiar a un ratón por inhalación continua de 2,5% de isoflurano. Asegúrese de controlar el estado de los animales durante todo el procedimiento. Realizar una prueba del pellizco del pie del ratón para confirmar que está totalmente anestesiado. Asegúrese de que el animal no se mueve cuando se administra la prueba del pellizco.
- Aplicar una pomada lubricante a los ojos del animal para evitar la desecación. Asegurar el animal en posición supina a la almohadilla absorbente utilizando cinta quirúrgica. Continuar administrando 2,5% isoflurano a través de cono de la nariz.
- El uso de una crema depilatoria, quite la piel de la pierna y el abdomen a la línea media. Enjuagar bien la piel con agua. Depilación puede realizarse un día antes de la cirugía. Tenga en cuenta que el tratamiento excesivo con la crema puede dar lugar a irritación de la piel.
- Inmediatamente antes de la cirugía, aplicar povidona yodada al área depilada con un aplicador con punta de algodón para esterilizar la piel. Enjuague la piel depilada con etanol al 70% y secacon un aplicador con punta de algodón estéril. Repetir 3 veces.
- Administrar una dosis pre-operatorio de 5 mg / kg de carprofeno a través de inyección subcutánea.
3. El aislamiento de la arteria femoral
- El uso de pequeñas tijeras quirúrgicas, hacer una incisión curva en la piel sobre la arteria femoral. Sin rodeos diseccionar y asegurar los tejidos circundantes utilizando retractores fijadores retractores magnética para localizar la arteria femoral. Humedezca los tejidos utilizando periódicamente salina para el riego Aplique solución salina utilizando un aplicador con punta de algodón estéril.
- Aislar la arteria femoral utilizando fórceps. Separar suavemente el nervio del paquete vascular utilizando pinzas de punta fina. Evite punción de la vena, y no dañar el nervio. Empuje el nervio lejos del paquete para evitar estimularla.
- Separar suavemente la vena femoral de la arteria femoral, la localización de la bifurcación femoral. La región de la bifurcación es especialmente difícil para diseccionar.
- Posterior a la bifurcación, bucle de una sutura de seda 6.0 debajo de la arteria femoral y seguro con una pinza hemostática. Esta sutura proximal se utiliza para restringir el flujo sanguíneo en la arteria.
NOTA: Hay una ligera variación en los lazos cuando se realiza el método de ligadura en comparación con el método de cauterización (ver Figura 1 y Figura 2). - Distal a la bifurcación, bucle de sutura de seda 6.0 debajo de la arteria femoral y seguro con una pinza hemostática. Este distales ayudas de sutura en el posicionamiento de la arteria.
- Loop dos suturas bajo la rama muscular de la arteria femoral, pre-atarlos y seguros con una pinza hemostática. Recuerde humedecer los tejidos con solución salina. Si la realización del método de cauterización de la lesión de alambre, sólo una sutura en bucle es necesario en la rama muscular.
4. Rendimiento de la arteria femoral Lesiones alambre
- Restringir el flujo sanguíneo en la arteria femoral, tirando del hilo de sutura proximal. Levemente tire el hemost distalen pinza hemostática y asegurar la rama para exponer el sitio de la arteriotomía. Ligar la rama muscular, atando la sutura alrededor.
NOTA: El levantamiento de la arteria hacia arriba restringirá de manera más eficaz el flujo de sangre que tirando horizontalmente solo. - Cortar la rama pequeña con el cauterio entre los dos puntos de sutura. El uso de micro-tijeras, realizar una arteriotomía en la rama lateral de la bifurcación. El uso de fórceps en equilibrio sobre un rollo de cinta quirúrgica para estabilizar los micro-tijeras.
- Confirmar la presencia de la arteriotomía usando pinzas de punta fina. Levante suavemente la apertura de la arteriotomía con las pinzas. Introducir el extremo redondeado del cable en la arteriotomía usando pinzas. Para facilitar el avance del alambre, añadir una o dos gotas de lidocaína para la región usando una jeringa.
- Cuando el cable alcanza la sutura proximal, liberar la sutura y ajustarlo de manera que no puede impedir el avance del alambre. Inserte el cable hasta que no pueda avanzar más. La punta del XXe alambre debe parar en la región del ligamento inguinal.
- Permita que el cable permanezca en la arteria femoral durante un minuto. Después de un minuto, retraer y avanzar en el alambre en un movimiento de sierra diez veces a herir y despojar el endotelio de la arteria femoral. Para una lesión de menor gravedad, disminuir el número de veces que se tira del cable dentro y fuera de la arteria o dejar el cable en la arteria por sólo 1 min.
- Retraer el cable lentamente. Cuando el extremo redondo del cable ha pasado la sutura proximal, restringir el flujo en la arteria tirando de la sutura proximal. Retraer el cable completamente.
5. ligando el Poder Muscular
- Apriete la sutura restante en la rama muscular. Esto evitará el sangrado de la arteriotomía. Flujo de retorno a la rama muscular, y confirme que la sangre no se está escapando de ella. Recorte los extremos de las suturas en la rama muscular.
6. Método alternativo: Localizada Caurización de la arteriotomía
NOTA: Un enfoque alternativo se pueden tomar para evitar la ligadura de la rama muscular y permitir el acceso vascular a través de la arteria femoral principal más grande.
- A partir de 4,1, restringir el flujo a la arteria femoral, tirando de la sutura proximal. Tire de la sutura distal y el aseguramiento de la sutura muscular de la rama ligeramente para exponer el sitio de la arteriotomía (Figura 1 y Figura 2).
- El uso de micro-tijeras, realizar una arteriotomía en el punto de la arteria femoral y la rama musculoso rama. Si la incisión se hace en el lado de la arteria, puede ser más fácil para cauterizar. El uso de fórceps en equilibrio sobre un rollo de cinta quirúrgica para estabilizar los micro-tijeras.
- Para probar el éxito de la cauterización, para restaurar el flujo de la arteria femoral aflojando la sutura proximal. Si el sangrado se produce a partir de la arteriotomía, repita el cauterio. Si el cauterio tiene éxito, el flujo de sangre será realmacenado distal a la arteriotomía.
- Introducir el cable y realizar la lesión de alambre como se describe en la sección 4.
- Continuar restringir el flujo sanguíneo en la arteria femoral. Calentar un cauterio fino con punta de al menos 6 pulgadas de distancia del ratón. Como la punta de cauterización se enfría, se aplican a la ligera lado de la arteriotomía para cerrar la incisión.
- Para probar el éxito de la cauterización, para restaurar el flujo de la arteria femoral aflojando la sutura proximal. Si el sangrado se produce a partir de la arteriotomía, repita el cauterio. Si el cauterio tiene éxito, el flujo sanguíneo se restaurará distal a la arteriotomía. Retire el proximal temporal y lazos distales.
7. Implantación de perivascular Drug Delivery Patch
- Crear un parche de drogas perivascular se puede crear como se ha descrito en estudios previos 11 o mediante el uso de métodos similares. Blunt los rincones de la región de la barrera del parche de administración de fármacos utilizando tijeras estériles
- Coloque la palmadita de administración de fármacosch en la arteria femoral lesionado con el lado de liberación de fármaco frente a la arteria. Según sea necesario, el uso de fórceps para mejorar la posición del parche.
8. cierre de la herida y Recuperación
- Cierre de la herida con una sutura interrumpida simple que consiste en nudos cuadrados. Una sutura discontinua prolonga cierre de la herida en el caso de que el animal intenta quitar la sutura.
- Apague la anestesia y retirar al animal de la puesta en marcha. Deje que el animal se recupere en la plataforma de calentamiento.
- Continúe controlando la recuperación del ratón. Revise el sitio de la incisión todos los días para asegurarse de que permanece cerrado. Para el tratamiento del dolor post-quirúrgico, administrar una inyección subcutánea de 5 mg / kg del carprofeno cada 12 hr después de la cirugía y luego cada 12 horas durante 2 días. Si el dolor continúa después de los primeros 2 días, consulte a un veterinario para obtener instrucciones sobre más medicamentos para el dolor.
9. Las arterias femorales cosecha de Histología
- A los 28 días posteriores a la cirugía, lleve a cabo la eutanasia de dióxido de carbono en el ratón.
NOTA: La velocidad de flujo adecuada de dióxido de carbono debería desplazar el 10-30% de la cámara por minuto y pueden variar dependiendo del tamaño de la cámara utilizada. El corte de diafragma y punción cardiaca debe realizarse como un método secundario de la eutanasia. - Asegure el ratón en la posición supina utilizando cinta quirúrgica. Hacer una incisión sobre la arteria femoral, donde se hizo la incisión quirúrgica inicial.
- Por tanto la arteria lesionada y no lesionada de la arteria de la pierna contralateral, sin rodeos diseccionar y asegurar los tejidos circundantes utilizando retractores y fijadores retractor magnéticas para localizar la arteria femoral. Humedezca los tejidos utilizando periódicamente salina para el riego. Aplicar solución salina utilizando un aplicador con punta de algodón estéril. Tenga cuidado de no dañar la arteria.
- Después de la arteria femoral ha sido aislado desde el sitio de la arteriotomía original a la aorta abdominal, atar un segción de sutura de seda cerca del sitio original de la arteriotomía. Esta sutura ayudará a identificar el extremo más distal de la arteria femoral y la facilidad de manipulación de la muestra.
- Con las tijeras micro-disección para extirpar la arteria femoral. Hacer una incisión distal a la sutura. Hacer que la otra incisión en el extremo opuesto de la arteria femoral, al lado de la aorta abdominal.
- Transferencia de la arteria extirpado a una placa petri de vidrio que contiene solución salina. Diseccionar la arteria posterior para eliminar el exceso de tejido conectivo o grasa. Retire suavemente la sangre desde el lumen de un enjuague con solución salina.
- Transferencia de la arteria de un vial de 10% de formalina tamponada. Guarde el vial a 4 ° C con agitación suave durante 48 horas.
- Transferencia de la arteria fijado a 70% de etanol, para almacenar hasta que se procesó para histología.
- Insertar la arteria en bloques de parafina y sección de los bloques para la tinción.
- Realizar tinción histoquímica y inmunoquímica para evaluar el alcance de la lesión y de la íntima hyperplasia.
NOTA: Para obtener los resultados representativos, utilizamos hematoxilina y eosina para visualizar los núcleos y morfología general o Pentachrome mancha de un Movat para visualizar las láminas elásticas y otros componentes arteriales.
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Representative Results
Tras la lesión de alambre, hiperplasia neointimal se desarrolla con el tiempo y se examina típicamente después de 14 a 28 días. Las técnicas descritas en este cable de trabajo a la generación robusta de la hiperplasia intimal en ratones como se muestra los resultados histológicos en la Figura 3. Una arteria femoral ileso demostrarán laminillas elástica intacto y un espesor normal y circunferencia. Una arteria femoral heridos mostrará hiperplasia de la íntima, degradado laminillas elásticas y demostrar reendotelización en momentos posteriores. Reendotelización típicamente se completa en unos 21 días, pero esto depende de la cepa de fondo de los ratones utilizados y puede evaluarse utilizando la inmunotinción para marcadores endoteliales en secciones o, preferiblemente, medidos en en los preparativos de cara utilizando colorante azul de Evans, microscopía electrónica de barrido o inmunotinción con microscopía confocal en en los preparativos de la cara de la arteria. 17,18 Para la cuantificación de la hiperplasia de la íntima queque es mejor para medir el área de la íntima o la relación de la íntima-a medios de comunicación en tres sitios a lo largo de la arteria lesionada para tener en cuenta posibles variaciones a lo largo de la longitud de la región lesionada de la arteria.
Figura 1: Las fotografías de los pasos críticos de los dos métodos para la lesión de alambre en la arteria femoral Una comparación de los pasos para el método de ligadura (parte superior) con el método de cauterización (parte inferior) para realizar lesiones de alambre.. En el método de la ligación, las dos suturas de fijación de la rama muscular son la pre-atadas de modo que puedan ser apretados para ligar la rama muscular. Cuanto más distal de las dos suturas rama musculares se aprieta. La inserción arteriotomía y cable se llevan a cabo en la rama muscular. Después se realiza la lesión, la sutura restante en la rama muscular, se aprieta y se recorta. En el método de cauterización, sólo uno suture se enlaza en la rama muscular. La arteriotomía y la inserción de cables se realizan en el punto de bifurcación de la rama musculares de la arteria femoral. Después se realiza la lesión, la incisión se cauteriza sin ligar bien la arteria femoral o rama muscular. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: fotografías de magnificación más elevada de los pasos críticos de las dos técnicas para la lesión de alambre comparación Primer plano de pasos para el método de ligadura (arriba) con el método de cauterización (abajo).. La ubicación de la arteriotomía está demarcada con la línea discontinua. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de estafigura.
Figura 3:. Resultados histológicos representativos de lesiones alambre 14 días después del procedimiento histológico de las secciones de las arterias se tiñeron con hematoxilina y eosina (arriba) y tinción pentacromo de Movat (abajo). Etiquetada en la imagen son la luz (L), íntima (I) y lámina elástica (EL).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight spring wire, 0.15” diameter | Cook | G02426 | |
| High Temperature cautery | Bovie Medical Corp. | HIT1 | |
| High-temperature fine tip for cautery | Bovie Medical Corp. | H101 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-13 | For performance of arteriotomy |
| Angled fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | For blunt dissection of vascular bundle |
| Angled forceps | Roboz | RS-5069 | For clearing tissues |
| Surgical scissors | Roboz | RS-5840 | For cutting skin |
| Retractor | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Retractor wire | Fine Science Tools | 18200-05 | Attached to retractor |
| Base plate | Fine Science Tools | 18200-03 | For use with retractor |
| Magnetic retractor fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7822 | |
| Hemostatic forceps | Biomedical Research Instruments, Inc. | 34-1000 | |
| Dissecting microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | |
| Microscope light source | Meiji Techno | FT191 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-500 | For maintaining mouse body temperature |
| Reusable heating pad | Gaymar | TP-R 22G | For maintaining mouse body temperature |
| Lidocaine | Various | ||
| 4.0 Vicryl suture with half circle needle | Ethicon | J494G | For post-surgical wound closure |
| Sterile cotton-tipped applicators | Puritan | 25-806-2WC | For application of depilatory cream and absorbing fluids |
| Depilatory cream | Nair | ||
| Isoflurane | Various | ||
| Betadine | Various | ||
| 70% ethanol | Various | ||
| 6.0 braided silk suture | Teleflex Medical | 4-S | For isolation of femoral artery during surgery |
| 0.9% sodium chloride | Various | For irrigating tissues | |
| Gel eye lubricant | Various | ||
| Glass Petri dish | Pyrex | 3160-60 | For femoral artery harvest |
| 10% buffered formalin | Various | For fixation of femoral artery | |
| 70% ethanol | Various | For fixation of femoral artery | |
| Bouin's fluid | Electron Microscopy Sciences | For Movat's Pentachrome staining | |
| Alcian blue, 1% | Electron Microscopy Sciences | 26385-01 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alkaline alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26385-02 | For Movat's Pentachrome staining |
| Orcein, 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26385-03 | For Movat's Pentachrome staining |
| Hematoxylin alcoholic, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-04 | For Movat's Pentachrome staining |
| Ferric chloride, 10% | Electron Microscopy Sciences | 26385-05 | For Movat's Pentachrome staining |
| Lugol's Iodine | Electron Microscopy Sciences | 26385-06 | For Movat's Pentachrome staining |
| Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution | Electron Microscopy Sciences | 26385-07 | For Movat's Pentachrome staining |
| Acetic acid, 0.5% | Electron Microscopy Sciences | Various | For Movat's Pentachrome staining |
| Phosphotungstic acid, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-09 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alcoholic saffron, 6% | Electron Microscopy Sciences | 26385-10 | For Movat's Pentachrome staining |
References
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