Protocol
OBS: Alla metoder som visas i detta protokoll har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Beredning av operationsbord
- Ställ in värmedynan med recirkulerande varmt vatten på operationsbordet, under dissektion mikroskop. Placera rostfri bordsplattan på värmedyna. Placera en steril absorberande dyna på basplattan och värmedyna.
- Ordna sterila kirurgiska verktyg på en intilliggande steril absorberande dyna. Samla två par vinklade fin spets pincett, två par vinklade pincett, tre hemostatiska pincett, två upprullningsdon trådar, små kirurgiska saxar, mikro-sax, en angioplastik tråd (0,15 tums diameter) och tre 6-tums segment av 6,0 silkesutur .
- Böj den runda änden av angioplastik tråd för att matcha böjningen hos den femorala artären. Detta kommer att göra det lättare att föra fram tråden under operationen.
2. Beredning avMusen för kirurgi
- Bedöva en mus genom kontinuerlig inandning av 2,5% isofluran. Var noga med att följa djurets status under hela förfarandet. Utför en nypa test av musens foten för att bekräfta att det är helt sövd. Se till att djuret inte rör sig när nypa testet administreras.
- Applicera en smörj salva till djurets ögon att förhindra uttorkning. Säkra djuret i ryggläge till den absorberande dynan med användning av kirurgtejp. Fortsätt att administrera 2,5% isofluran via noskon.
- Med hjälp av en hårborttagningskräm, avlägsna päls från benet och buken till mittlinjen. Skölj huden noga med vatten. Depilation kan utföras en dag i förväg för kirurgi. Observera att överdriven behandling med grädden kan leda till hudirritation.
- Omedelbart före operation, tillämpa povidon-jod till avhårade området med en bomullspinne för att sterilisera huden. Skölj avhårades huden med 70% etanol och torkamed en steril bomullspinne. Upprepa 3 gånger.
- Administrera en preoperativ dos av 5 mg / kg av karprofen via subkutan injektion.
3. Isolering av femoralartären
- Med små kirurgiska saxar, göra en krökt snitt i huden över den femorala artären. Rakt på sak dissekera och säkra omgivande vävnader med hjälp av upprullningsdon magnetiska upprullningsdon fixturer att lokalisera lårbensartären. Fukta vävnaderna regelbundet använder saltlösning för bevattning Tillämpa saltlösning med en steril bomullspinne.
- Isolera lårbensartären med pincett. Separera försiktigt nerven från kärl bunt med hjälp spetsig pincett. Undvik att punktera venen, och inte skadar nerven. Skjut bort från bunten mage att undvika att stimulera den.
- Separera försiktigt lårbensvenen från lårbensartären, lokalisera lårbens bifurkation. Regionen bifurkationen är särskilt svårt att dissekera.
- Posterior till bifurkation, slingan 6,0 silkesutur under lårbensartären och säker med en hemostat. Denna proximala sutur kommer att användas för att begränsa blodflödet i artären.
OBS: Det finns en liten variation i banden när du utför ligering metoden kontra cauterization metoden (se Figur 1 och Figur 2). - Distalt bifurkation, slingan 6,0 silkesutur under lårbensartären och säker med en hemostat. Denna distala sutur hjälper till vid positioneringen av artären.
- Loop två suturer under muskel grenen av lårbensartären, pre-binda dem och säkra med en hemostat. Kom ihåg att fukta vävnaderna med saltlösning. Om utför diatermi metoden trådskada, är nödvändigt på muskel grenen enda loopas sutur.
4. Utförande av lårbensartären Wire Skada
- Hindra blodflödet i lårbensartären genom att dra den proximala sutur. Något dra distala Hemostvid och hemostat säkra grenen att exponera webbplatsen för arteriotomin. Ligate muskel grenen genom att knyta suturen runt den.
OBS: Lyfta artären uppåt kommer mer effektivt begränsar blodflödet än att dra vågrätt ensam. - Sever den lilla grenen med diatermi mellan de två suturer. Använda mikro-sax, utföra en arteriotomi i sidogren bifurkationen. Använd pincett balanserade på en rulle kirurgtejp för att stabilisera mikro sax.
- Bekräfta förekomsten av arteriotomin använder spetsig pincett. Lyft försiktigt öppningen av arteriotomin med pincett. Införa rundade änden av kabeln i arteriotomin använder pincett. För att underlätta frammatning av tråden, lägga en eller två droppar av lidokain till regionen med hjälp av en spruta.
- När tråden når den proximala sutur, släpp suturen och justera den så att den inte kan hindra frammatningen av tråden. För in kabeln tills den inte kan gå vidare. Spetsen på the tråd ska stanna i regionen inguinal ligamentet.
- Låt tråden att förbli i den femorala artären för en minut. Efter en minut, dra och flytta tråden i en sågning rörelse tio gånger för att skada och beröva endotelet i lårbensartären. För en skada av mindre svårighetsgrad, minska antalet gånger tråden dras in och ut i artären eller lämna viran i artären för endast en minut.
- Dra tillbaka tråden långsamt. När den runda änden av tråden har passerat den proximala sutur, begränsar flödet in i artären genom att dra den proximala sutur. Dra tillbaka tråden helt.
5. ligera Muskulös Branch
- Dra den återstående sutur på muskel grenen. Detta kommer att förhindra blödning från arteriotomin. Återgå flöde till muskel grenen, och bekräfta att blodet inte läcker ut från det. Trimma ändarna från suturerna på muskel grenen.
6. Alternativ metod: Localized Cauterization av arteriotomin
OBS: kan tas Ett alternativt tillvägagångssätt för att undvika ligering av muskel grenen och tillåta vaskulär åtkomst via större huvudlårbensartären.
- Utgående från 4,1, begränsar flödet till den femorala artären genom att dra på den proximala sutur. Dra distala suturen och suturen säkra muskel grenen något att exponera webbplatsen för arteriotomin (Figur 1 och Figur 2).
- Använda mikro-sax, utföra en arteriotomi vid förgreningspunkten för lårbensartären och muskel grenen. Om snitt görs i sidan av artären, kan det vara lättare att bränna. Använd pincett balanserade på en rulle kirurgtejp för att stabilisera mikro sax.
- För att testa framgång cauterization, återställa flödet till lårbensartären genom att lossa den proximala sutur. Om blödning uppstår från arteriotomin, upprepa diatermi. Om diatermi är framgångsrik, kommer blodflödet återlagras distalt arteriotomin.
- Presentera tråden och utföra trådskada som beskrivs i avsnitt 4.
- Fortsätt att begränsa blodflödet i lårbensartären. Värm en spetsig cautery minst 6 inches bort från musen. Som diatermi spetsen svalnar, tillämpa den lätt sidan av arteriotomy att stänga snittet.
- För att testa framgång cauterization, återställa flödet till lårbensartären genom att lossa den proximala sutur. Om blödning uppstår från arteriotomin, upprepa diatermi. Om diatermi är framgångsrik, kommer blodflödet återställas distalt arteriotomin. Avlägsna den tillfälliga proximala och distala ties.
7. Implantation av perivaskulär Drug Delivery Patch
- Skapa en perivaskulär läkemedelsplåster kan skapas såsom beskrivs i tidigare studier 11 eller genom att använda liknande metoder. Trubbiga hörnen av barriärområdet av läkemedelsleveranskorrigeringsfilen med steril sax
- Placera läkemedelsavgivning patch på den skadade lårbensartären med drogen frigör sida som vetter mot artären. Vid behov, använd pincett för att förbättra situationen för plåstret.
8. sårtillslutning och återställning
- Stäng såret med en enkel avbruten sutur bestående av kvadrat knop. En diskontinuerlig sutur förlänger sårtillslutning ifall djuret försöker att ta bort suturen.
- Stäng av anestesi och ta bort djuret från uppsättningen upp. Låt djuret att återhämta sig på uppvärmningen pad.
- Fortsätta att övervaka musen återhämtning. Kontrollera snittet webbplatsen varje dag för att se till att det förblir stängd. För behandling av postoperativ smärta, administrera en subkutan injektion av 5 mg / kg av karprofen varje 12 h efter kirurgi och sedan varje 12 h under 2 dagar. Om smärtan fortsätter efter de första två dagarna, konsultera en veterinär för anvisningar om ytterligare smärtstillande.
9. Skörd lårbensartärerna för histologi
- Vid 28 dagar efter operation, utför koldioxid dödshjälp på musen.
OBS: Den lämpliga flödeshastigheten för koldioxid bör förskjuta 10-30% av kammaren per minut och kommer att variera beroende på storleken av kammaren som används. Kapning av membranet och hjärtpunktur bör utföras som en sekundär metod för eutanasi. - Säkra musen i ryggläge med hjälp kirurgtejp. Gör ett snitt över lårbensartären, där den ursprungliga kirurgiska snitt gjordes.
- För både den skadade artären och oskadade artär från kontralaterala benet, rakt på sak dissekera och säkra omgivande vävnader med hjälp av upprullningsdon och magnetiska upprullningsdon fixturer att lokalisera lårbensartären. Fukta vävnaderna regelbundet använder saltlösning för bevattning. Applicera saltlösning med en steril bomullspinne. Var noga med att inte skada artären.
- Efter lårbensartären har isolerats från platsen för den ursprungliga arteriotomy till bukaorta, knyt en seglingen av silkessutur nära den ursprungliga platsen för arteriotomin. Denna sutur kommer hjälpa till att identifiera den mest distala änden av lårbensartären och lätthet hantering av provet.
- Använda mikro dissektion sax för att skära lårbensartären. Gör ett snitt distalt om suturen. Gör den andra snitt på den motsatta änden av lårbensartären, bredvid bukaortan.
- Överför utskurna artären till en glaspetriskål med saltlösning. Dissekera artären ytterligare för att avlägsna överskott av bindväv eller fett. Ta försiktigt bort blodet från lumen genom att skölja med saltlösning.
- Överför artären till en flaska med 10% formalin. Förvara flaskan vid 4 ° C med försiktig skakning under 48 h.
- Överför fast artären till 70% etanol, för att lagra tills det bearbetas för histologi.
- Bädda artären i paraffinblock och avsnittet blocken för färgning.
- Utför histokemisk och immunfärgning för att bedöma omfattningen av skadan och intima hyperplasia.
OBS: För de representativa resultat använde vi hematoxylin och eosin att visualisera kärnor och övergripande morfologi eller en Movat s Pentachrome fläcken att visualisera den elastiska lameller och andra arteriella komponenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter trådskada, utvecklar neointimal hyperplasi över tiden och är oftast undersöktes efter 14 till 28 dagar. De tekniker som beskrivs i detta arbete leder till robust generation av intimal hyperplasi hos möss som visas de histologiska resultaten i figur 3. En oskadad lårbensartären kommer att visa intakt elastisk lameller och en normal tjocklek och omkrets. En skadad femoralartären visar intimal hyperplasi, degraderas elastiska lameller och demonstrera återendotelisation vid senare tidpunkter. Återendotelisation är typiskt fullständig vid omkring 21 dagar, men detta beror på bakgrunds stam av mössen som används och kan bedömas med hjälp av immunfärgning för endotelceller markörer på sektioner eller, helst, mätt på en ansiktspreparat använder Evans blått färgämne, svepelektronmikroskop eller immunfärgning med konfokalmikroskopi på en face beredningar av artären. 17,18 För kvantifiering av intimahyperplasi detär bäst att mäta den intimala området eller intimala-till-media-förhållandet vid tre ställen längs den skadade artären att redovisa potentiella variationer utmed längden av den skadade regionen av artären.
Figur 1: Fotografier av de kritiska stegen i de två metoder för trådskada i lårbensartären En jämförelse av stegen för tion metoden (överst) till diatermi metoden (botten) för att utföra trådskada.. I ligation metoden, de två suturer fäster muskel grenen är pre-bundna så att de kan dras åt för att underbinda muskel grenen. Ju mer distala av de två muskelgren suturer dras åt. Arteriotomin och trådinför utförs i muskel grenen. Efter skadan sker, är den återstående sutur på muskel grenen åtdragna och trimmas. I diatermi metoden, endast en sRAMTIDA loopas under muskel grenen. Arteriotomin och trådinför utförs vid förgreningspunkten för muskel gren från lårbensartären. Efter skadan sker, är snittet flamberats utan ligering antingen lårbensartären eller muskel gren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Högre förstoring fotografier av de kritiska stegen i de två tekniker för trådskada Närbild jämförelse av stegen för tion metoden (överst) till diatermi metoden (nederst).. Placeringen av arteriotomy avgränsas med den streckade linjen. Klicka här för att se en större version av dennafigur.
Figur 3:. Representativa histologiska resultaten av trådskada 14 dagar efter ingreppet Histologisk från artärerna sektioner färgades med hematoxylin och eosin (överst) och Movat s pentachrome färgning (underst). Märkt i bilden är lumen (L), intima (I) och elastisk lamina (EL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight spring wire, 0.15” diameter | Cook | G02426 | |
| High Temperature cautery | Bovie Medical Corp. | HIT1 | |
| High-temperature fine tip for cautery | Bovie Medical Corp. | H101 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-13 | For performance of arteriotomy |
| Angled fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | For blunt dissection of vascular bundle |
| Angled forceps | Roboz | RS-5069 | For clearing tissues |
| Surgical scissors | Roboz | RS-5840 | For cutting skin |
| Retractor | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Retractor wire | Fine Science Tools | 18200-05 | Attached to retractor |
| Base plate | Fine Science Tools | 18200-03 | For use with retractor |
| Magnetic retractor fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7822 | |
| Hemostatic forceps | Biomedical Research Instruments, Inc. | 34-1000 | |
| Dissecting microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | |
| Microscope light source | Meiji Techno | FT191 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-500 | For maintaining mouse body temperature |
| Reusable heating pad | Gaymar | TP-R 22G | For maintaining mouse body temperature |
| Lidocaine | Various | ||
| 4.0 Vicryl suture with half circle needle | Ethicon | J494G | For post-surgical wound closure |
| Sterile cotton-tipped applicators | Puritan | 25-806-2WC | For application of depilatory cream and absorbing fluids |
| Depilatory cream | Nair | ||
| Isoflurane | Various | ||
| Betadine | Various | ||
| 70% ethanol | Various | ||
| 6.0 braided silk suture | Teleflex Medical | 4-S | For isolation of femoral artery during surgery |
| 0.9% sodium chloride | Various | For irrigating tissues | |
| Gel eye lubricant | Various | ||
| Glass Petri dish | Pyrex | 3160-60 | For femoral artery harvest |
| 10% buffered formalin | Various | For fixation of femoral artery | |
| 70% ethanol | Various | For fixation of femoral artery | |
| Bouin's fluid | Electron Microscopy Sciences | For Movat's Pentachrome staining | |
| Alcian blue, 1% | Electron Microscopy Sciences | 26385-01 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alkaline alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26385-02 | For Movat's Pentachrome staining |
| Orcein, 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26385-03 | For Movat's Pentachrome staining |
| Hematoxylin alcoholic, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-04 | For Movat's Pentachrome staining |
| Ferric chloride, 10% | Electron Microscopy Sciences | 26385-05 | For Movat's Pentachrome staining |
| Lugol's Iodine | Electron Microscopy Sciences | 26385-06 | For Movat's Pentachrome staining |
| Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution | Electron Microscopy Sciences | 26385-07 | For Movat's Pentachrome staining |
| Acetic acid, 0.5% | Electron Microscopy Sciences | Various | For Movat's Pentachrome staining |
| Phosphotungstic acid, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-09 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alcoholic saffron, 6% | Electron Microscopy Sciences | 26385-10 | For Movat's Pentachrome staining |
References
- Hoffmann, R., Mintz, G. S. Coronary in-stent restenosis - predictors, treatment and prevention. Eur Heart J. 21 (21), 1739-1749 (2000).
- Erbel, R., et al. Coronary-artery stenting compared with balloon angioplasty for restenosis after initial balloon angioplasty. Restenosis Stent Study Group. N Engl J Med. 339 (23), 1672-1678 (1998).
- Farooq, V., Gogas, B. D., Serruys, P. W. Restenosis: delineating the numerous causes of drug-eluting stent restenosis. Circ Cardiovasc Interv. 4 (2), 195-205 (2011).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. Br Med Bull. 106, 193-211 (2013).
- Garg, S., Serruys, P. W. Coronary stents: current status. J Am Coll Cardiol. 56 (10 Suppl), S1-S42 (2010).
- Park, S. J., Kim, Y. H. Current status of percutaneous coronary intervention with drug-eluting stents in Asia. Circulation. 118 (25), 2730-2737 (2008).
- Alfonso, F. Treatment of drug-eluting stent restenosis the new pilgrimage: quo vadis. J Am Coll Cardiol. 55 (24), 2717-2720 (2010).
- Dake, M. D., et al. Paclitaxel-eluting stents show superiority to balloon angioplasty and bare metal stents in femoropopliteal disease: twelve-month Zilver PTX randomized study results. Circ Cardiovasc Interv. 4 (5), 495-504 (2011).
- Bosiers, M., et al. Results of the Protege EverFlex 200-mm-long nitinol stent (ev3) in TASC C and D femoropopliteal lesions. J Vasc Surg. 54 (4), 1042-1050 (2011).
- Duda, S. H., et al. Drug-eluting and bare nitinol stents for the treatment of atherosclerotic lesions in the superficial femoral artery: long-term results from the SIROCCO trial. J Endovasc Ther. 13 (6), 701-710 (2006).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17 (10), 2238-2244 (1997).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Roque, M., et al. Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20 (2), 335-342 (2000).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. Mouse model of arterial injury. Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).
- Edelman, E. R., Adams, D. H., Karnovsky, M. J. Effect of controlled adventitial heparin delivery on smooth muscle cell proliferation following endothelial injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (10), 3773-3777 (1990).
- Stemerman, M. B., Ross, R. Experimental arteriosclerosis. I. Fibrous plaque formation in primates, an electron microscope study. J Exp Med. 136 (4), 769-789 (1972).
- Brouchet, L., et al. Estradiol accelerates reendothelialization in mouse carotid artery through estrogen receptor-alpha but not estrogen receptor-beta. Circulation. 103 (3), 423-428 (2001).
- Filipe, C., et al. Estradiol accelerates endothelial healing through the retrograde commitment of uninjured endothelium. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2822-H2830 (2008).
- Feuls, R., et al. Microvascular denudation of the femoral artery of the mouse as a model for restenosis. Rofo. 175 (7), 952-957 (2003).
- Holt, A. W., Tulis, D. A. Experimental Rat and Mouse Carotid Artery Surgery: Injury & Remodeling Studies. ISRN Minim Invasive Surg. 2013, (2013).
- Iafrati, M. D., et al. Estrogen inhibits the vascular injury response in estrogen receptor alpha-deficient mice. Nat Med. 3 (5), 545-548 (1997).
- Sullivan, T. R., et al. Estrogen inhibits the response-to-injury in a mouse carotid artery model. J Clin Invest. 96 (5), 2482-2488 (1995).
- Yin, Y., Zhao, X., Fang, Y., Huang, L. Carotid artery wire injury mouse model with a nonmicrosurgical procedure. Vascular. 18 (4), 221-226 (2010).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. J Vis Exp. (40), (2010).
- Kuhlmann, M. T., et al. Implantation of a carotid cuff for triggering shear-stress induced atherosclerosis in mice. J Vis Exp. (59), (2012).
- Carmeliet, P., et al. Vascular wound healing and neointima formation induced by perivascular electric injury in mice. Am J Pathol. 150 (2), 761-776 (1997).
