Protocol
NOT: Bu protokolde gösterilen tüm yöntemler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
Cerrahi Tablo 1. Hazırlık
- Diseksiyon mikroskobu altında, cerrahi masada sıcak su sirkülasyon ısıtma pedi ayarlayın. Isıtma pedi üzerine paslanmaz çelik taban plakası yerleştirin. Taban plakası ve ısıtma yastığı steril emici ped yerleştirin.
- Bir komşu steril emici ped üzerine steril cerrahi aletler düzenleyin. Açılı ince uçlu forseps iki çift açılı forseps iki çift, üç hemostatik forseps, iki Retraktörler teller, küçük cerrahi makas, mikro-makas, bir anjiyoplasti tel (0.15 inç çap) ve 6.0 ipek sütür üç 6-inç segmentleri toplayın .
- Femoral arter eğrilik maç anjiyoplasti tel yuvarlak ucunu bükün. Bu daha kolay ameliyat sırasında tel ilerletmek için yapacak.
2. HazırlıkCerrahi Fare
- % 2.5 izofluran sürekli inhalasyon yoluyla bir fare anestezisi. Prosedür boyunca hayvanın durumunu izlemek için emin olun. Tam anestezi olduğunu doğrulamak için fare ayak bir tutam testi yapın. Tutam testi uygulandığında hareket etmiyor hayvan sağlayın.
- Kurumayı önlemek için hayvanın gözlerine bir yağlama merhem sürün. Cerrahi bant kullanarak emici ped ile yatar pozisyonda hayvan sabitleyin. Burun konisi üzerinden% 2.5 izofluran uygulanmasını devam edin.
- Bir tüy dökücü krem kullanmak, orta hattına bacak ve karın kürk çıkarın. Su ile iyice durulayın cildi. Depilasyon cerrahi bir gün önceden gerçekleştirilebilir. Cilt tahrişe yol açabilir krem ile bu aşırı tedavi unutmayın.
- Hemen ameliyat öncesi, cildi sterilize etmek için bir pamuk uçlu bir aplikatör ile tüy dökücü krem alana povidon-iyot uygulayın. % 70 etanol ve kurutulur cımbız çiftleri cilt durulayınsteril pamuk uçlu bir aplikatör ile. 3 kez tekrarlayın.
- Deri altına enjeksiyon ile karprofen 5 mg / kg'lık bir ameliyat öncesi dozu uygulayın.
Femoral Arter 3. İzolasyonu
- Küçük cerrahi makas kullanarak, femoral arter üzerinde deride kavisli bir kesi yapmak. Açık açık femoral artere bulmak için retraktörler manyetik retraktör fiksatörler kullanarak çevredeki dokuları incelemek ve güvenli. Steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanılarak tuzlu uygulayın sulama için periyodik serum fizyolojik ile dokuları nemlendirin.
- Forseps kullanarak femoral arter izole edin. Yavaşça ince uçlu forseps kullanılarak damar paket gelen sinir ayrı. Ven delinmesiyle kaçının ve sinir zarar vermez. Bunu önlemek için uyarıcı uzakta paket gelen sinir itin.
- Yavaşça femur çatallanma yerini, femoral arter femoral ven ayrı. çatallanma bölgesi incelemek için özellikle zordur.
- Posterior çatallanma, döngü hemostatla femoral arter ve güvenli altında 6.0 ipek sütür. Bu proksimal sütür arter kan akışını kısıtlamak için kullanılır.
NOT: dağlama yöntemiyle karşı ligasyonu yöntemi yaparken bağları hafif bir varyasyon vardır (Şekil 1 ve Şekil 2). - Bifürkasyonun distalinde, döngü 6.0 ipek femoral arter altında dikiş ve hemostatla güvenli. Arter konumlandırma Bu uzak sütür yardımcıları.
- Femoral arter kas dalı altında Döngü iki dikiş, onları ön-kravat ve bir hemostatla sabitleyin. Tuzlu su ile dokuları nemlendirmek için unutmayın. Tel yaralanma koter yöntemi gerçekleştirmek ise, yalnızca bir ilmekli dikiş kas şube gereklidir.
Femoral Arter Tel Yaralanma 4. Performans
- Proksimal sütür çekerek femoral artere kan akışını kısıtlamak. Biraz uzak Memost çekinhemostat şube güvence altına ve arteriotomi için site ortaya çıkarmak. Etrafında dikiş bağlayarak kas şube Arter.
NOT: yukarı arteri Kaldırma daha etkili yatay yalnız çekerek daha kan akışını kısıtlamak olur. - İki sütür arasındaki koter ile küçük şube Sever. Mikro-makas kullanarak, çatallanma yan dalında bir arteriyotomi gerçekleştirin. Mikro-makas stabilize etmek için cerrahi bant rulo üzerinde dengeli forseps kullanın.
- Ince uçlu forseps kullanarak arteriotomi varlığını onaylayın. Yavaşça forseps Arteriyotomi açılmasını kaldırın. Forseps kullanarak arteriotomi içine tel yuvarlak ucunu tanıtın. Telin ilerlemesini kolaylaştırmak için, bir şırınga kullanılarak bölgeye lidokain, bir veya iki damla ekleyin.
- Tel proksimal sütür ulaştığında, dikiş bırakın ve tel ilerleme engel olamaz ki ayarlayın. Daha da ileri edemez kadar tel yerleştirin. th ucue tel inguinal ligament bölgede durması gerekir.
- Tel, bir dakika için femoral arter içine kalmasına izin verir. Zarar ve femoral arter endoteli denude için on kez bir dakika sonra, geri ve bir testere hareket tel ilerlemek. Daha az şiddette bir yaralanma için, tel ve arterin dışarı çekilir sayısını azaltmak veya sadece 1 dakika arterde tel bırakın.
- Yavaş yavaş teli geri çekin. Tel yuvarlak ucu proksimal sütür geçtiğinde, proksimal sütür çekerek artere akışını kısıtlamak. Tamamen teli geri çekin.
5. Musküler Şubesi bağlanması
- Kas şube kalan dikiş sıkın. Bu arteriotomi kanamayı önlemek olacaktır. Kas şube akışını dönün ve bu kan ondan sızıntı değil onaylayın. Kas dalı üzerinde dikişler gelen uçlarını kesin.
6. Alternatif Yöntem: Lokalize Cauarteriyotomi yon
NOT: Alternatif bir yaklaşım kas şube bağlanmasını önlemek ve daha büyük ana femoral arter yoluyla damar erişime izin vermek için alınabilir.
- 4.1 itibaren, proksimal sütür çekerek femoral artere akışını kısıtlamak. Distal sütür ve arteriotomi için site (Şekil 1 ve Şekil 2) ortaya çıkarmak için hafifçe kas şube güvence dikiş çekin.
- Mikro-makas kullanarak, femoral arter ve kas şube şube noktada bir arteriyotomi gerçekleştirin. Kesi arter tarafında yapılır, bu dağlamak daha kolay olabilir. Mikro-makas stabilize etmek için cerrahi bant rulo üzerinde dengeli forseps kullanın.
- Dağlama başarısını test etmek için, proksimal sütür gevşeterek femoral artere akışını geri. Kanama arteriotomi gelen oluşursa, koter tekrarlayın. Koter başarılı olursa, kan akışı yeniden edilecekarteriotomi distalinde saklı.
- Tel tanıtılması ve bölüm 4'te tarif edildiği gibi tel yaralanma yerine getirir.
- Femoral artere kan akışını kısıtlayan devam edin. En az 6 inç uzakta fare ince uçlu koter ısıtın. Koter ucu soğudukça, kesi kapatmak için arteriotomi yan hafifçe uygulayın.
- Dağlama başarısını test etmek için, proksimal sütür gevşeterek femoral artere akışını geri. Kanama arteriotomi gelen oluşursa, koter tekrarlayın. Koter başarılı olursa, kan akışı arteriotomi distalinde restore edilecek. Geçici yakın ve uzak bağları çıkarın.
Perivasküler İlaç Dağıtım Patch 7. implantasyonu
- Daha önceki çalışmalarda 11 veya benzer yöntemler kullanılarak tarif edildiği gibi bir perivasküler ilaç yama oluşturma oluşturulabilir. Steril makaslar kullanılarak İlaç sağlama yaması hücresinden köşelerini kör
- Ilaç dağıtım pat yerleştirinarter bakan ilaç salan tarafı yaralı femoral arter üzerine ch. Gerekirse, yama konumunu iyileştirmek için forseps kullanabilir.
8. Yara Kapatma ve Kurtarma
- Kare knot oluşan basit bir kesintiye dikiş ile yarayı kapatın. Bir süreksiz sütür hayvan dikiş kaldırmak için çalışır durumda yara kapanmasını uzatır.
- Anestezi kapatın ve set up hayvan çıkarın. Hayvan ısınma pad üzerinde kurtarmak için izin verin.
- Farenin kurtarma izlemeye devam edin. O kapalı kalmasını sağlamak için her gün kesi sitesini kontrol edin. Ameliyat sonrası ağrının tedavi edilmesi için, 2 gün sonra, her 12 saat cerrahi sonrası 5 mg / karprofen, her 12 saat kg deri altı enjeksiyon vermek ve. Ağrı ilk 2 gün ötesine devam ederse, daha fazla ağrı ilaç tarifini bir veteriner danışın.
Histoloji 9. Hasat Femoral Arter
- Ameliyat sonrası 28 gün sonra, fare karbondioksit ötenazi yapmak.
NOT: karbon dioksit uygun akış hızı, dakikada odasının% 10-30 yerinden olmalı ve kullanılan oda büyüklüğüne bağlı olarak değişecektir. Diyafram ve kalp ponksiyonu kesme ötenazi ikincil yöntem olarak yapılmalıdır. - Cerrahi bant kullanarak yatar pozisyonda fare sabitleyin. İlk cerrahi kesi yapıldı femoral arter üzerinde bir kesi yapmak.
- Yaralı arter ve karşı bacak yaralanmamış arter, her ikisi için de açık açık incelemek ve femoral arter bulmak için Ekartörleri ve manyetik retraktör fiksatörler kullanarak dokuları çevreleyen sabitleyin. Periyodik sulama için tuzlu su kullanılarak dokuların nemlendirin. Steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanılarak tuzlu su uygulayın. Arterin zarar değil dikkat edin.
- Femoral arter abdominal aorta orijinal arteriotomi site izole edildikten sonra, bir segmen kravatarteriotomi orijinal sitenin yakınında ipek sütür ment. Bu dikiş femoral arter en uzak ucunu tanımlamak ve örnek işleme kolaylığı yardımcı olacaktır.
- Mikro-diseksiyon makas kullanarak femoral arter çıkarılması için. Dikiş bir kesi uzak olun. Abdominal aorta yanında, femoral arter ters ucunda diğer kesi yapmak.
- Tuzlu su içeren bir cam petri eksize arter aktarın. Aşırı bağ dokusu veya yağ çıkarmak için daha fazla arter disseke. Yavaşça serum fizyolojik ile durulayarak lümeninin kan çıkarın.
- % 10 tamponlu formalin bir şişeye arter aktarın. Yumuşak 48 saat için sallanarak 4 ° C'de şişe saklayın.
- Bu histoloji için işlenene kadar saklamak için,% 70 etanol ile sabitlenmiş arter aktarın.
- Parafin blok ve bölüm boyama için bloklar halinde arteri gömün.
- Yaralanma ve intimal HYP boyutunu değerlendirmek için histokimyasal ve immunokimyasal boyama yapınerplasia.
NOT: temsilcisi sonuçları için, biz elastik lameller ve diğer arter bileşenleri görselleştirmek için çekirdek ve genel morfoloji veya Movat en pentakrom leke görselleştirmek için hematoksilen ve eozin kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tel yaralanma sonrasında, neointimal hiperplazi zamanla gelişir ve tipik olarak 14 ile 28 gün sonra incelenir. Şekil histolojik sonuçlar gösterildiği gibi farelerde intimal hiperplazi sağlam nesil bu iş kurşun açıklanan teknikler 3. Bir yaralanmamış femoral arter sağlam elastik lameller ve normal kalınlık ve çevresini gösterecek. Bir yaralı femoral arter intimal hiperplazi göstermek elastik lameller bozulmuş ve daha sonra zaman noktalarında yeniden endotelizasyon gösterecektir. Yeniden endotelizasyon yaklaşık 21 gün, tipik olarak tamamlanır, ancak bu, taramalı elektron mikroskobu kullanılan farelerin arka suşuna bağlıdır ve tercihen Evan mavisi ile yüz preparasyonlar en ölçülen endotel bölümlerinde işaret ya da, için immün kullanılarak değerlendirilebilir veya arterin yüz hazırlıkları tr üzerinde konfokal mikroskobu ile immün. 17,18 intimal hiperplazi ölçümü için oarterin yaralı bölgenin uzunluğu boyunca potansiyel farklılıkları hesaba yaralı arter boyunca üç bölgede intimal alanı veya intimal-to-medya oranını ölçmek için en iyisidir.
Şekil 1: femoral arter tel yaralanma için iki yöntem kritik adımlar fotoğrafları tel yaralanması gerçekleştirmek için koter yöntemiyle (alt) ligasyon yönteminin (üst) için adımlar karşılaştırılması.. Ligasyon yönteminde, kas şube sabitleyen iki dikiş önceden bağlı onlar kas şube bağlanmalarını sıkılır böylece. İki kas şube dikişlerin daha uzak sıkılır. Arteriyotomi ve tel ekleme kas dalında yapılmaktadır. Yaralanma gerçekleştirildikten sonra, kas şube kalan dikiş sıkılır ve kesilmiş. Dağlama yöntemi, sadece bir suture kas dalı altında döngü. Arteriyotomi ve tel ekleme femoral arter kas şube şube noktasında gerçekleştirilir. Yaralanma gerçekleştirildikten sonra, kesi femoral arter veya kas şube ya bağlanarak olmadan koterize edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: telli yaralanma iki tekniklerin kritik adımlardan yüksek büyütme fotoğrafları koter yöntemiyle (alt) ligasyon yönteminin (üst) için adımlar Close-up karşılaştırılması.. arteriotomi yeri kesik çizgi ile tahdit edilmiştir. Bu büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınızrakam.
Şekil 3:. 14 gün arterler bölümlerden prosedür histolojik sonra tel yaralanma Örnek histolojik sonuçlar, Hematoksilin ve Eosin (üst) ve Movat pentakrom boyaması en (alt) ile boyanmıştır. Resimde Etiketli lümen (L), intima (I) ve elastik lamina (EL) bulunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight spring wire, 0.15” diameter | Cook | G02426 | |
| High Temperature cautery | Bovie Medical Corp. | HIT1 | |
| High-temperature fine tip for cautery | Bovie Medical Corp. | H101 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-13 | For performance of arteriotomy |
| Angled fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | For blunt dissection of vascular bundle |
| Angled forceps | Roboz | RS-5069 | For clearing tissues |
| Surgical scissors | Roboz | RS-5840 | For cutting skin |
| Retractor | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Retractor wire | Fine Science Tools | 18200-05 | Attached to retractor |
| Base plate | Fine Science Tools | 18200-03 | For use with retractor |
| Magnetic retractor fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7822 | |
| Hemostatic forceps | Biomedical Research Instruments, Inc. | 34-1000 | |
| Dissecting microscope | Meiji Techno | EMZ-5TR | |
| Microscope light source | Meiji Techno | FT191 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-500 | For maintaining mouse body temperature |
| Reusable heating pad | Gaymar | TP-R 22G | For maintaining mouse body temperature |
| Lidocaine | Various | ||
| 4.0 Vicryl suture with half circle needle | Ethicon | J494G | For post-surgical wound closure |
| Sterile cotton-tipped applicators | Puritan | 25-806-2WC | For application of depilatory cream and absorbing fluids |
| Depilatory cream | Nair | ||
| Isoflurane | Various | ||
| Betadine | Various | ||
| 70% ethanol | Various | ||
| 6.0 braided silk suture | Teleflex Medical | 4-S | For isolation of femoral artery during surgery |
| 0.9% sodium chloride | Various | For irrigating tissues | |
| Gel eye lubricant | Various | ||
| Glass Petri dish | Pyrex | 3160-60 | For femoral artery harvest |
| 10% buffered formalin | Various | For fixation of femoral artery | |
| 70% ethanol | Various | For fixation of femoral artery | |
| Bouin's fluid | Electron Microscopy Sciences | For Movat's Pentachrome staining | |
| Alcian blue, 1% | Electron Microscopy Sciences | 26385-01 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alkaline alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26385-02 | For Movat's Pentachrome staining |
| Orcein, 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26385-03 | For Movat's Pentachrome staining |
| Hematoxylin alcoholic, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-04 | For Movat's Pentachrome staining |
| Ferric chloride, 10% | Electron Microscopy Sciences | 26385-05 | For Movat's Pentachrome staining |
| Lugol's Iodine | Electron Microscopy Sciences | 26385-06 | For Movat's Pentachrome staining |
| Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution | Electron Microscopy Sciences | 26385-07 | For Movat's Pentachrome staining |
| Acetic acid, 0.5% | Electron Microscopy Sciences | Various | For Movat's Pentachrome staining |
| Phosphotungstic acid, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26385-09 | For Movat's Pentachrome staining |
| Alcoholic saffron, 6% | Electron Microscopy Sciences | 26385-10 | For Movat's Pentachrome staining |
References
- Hoffmann, R., Mintz, G. S. Coronary in-stent restenosis - predictors, treatment and prevention. Eur Heart J. 21 (21), 1739-1749 (2000).
- Erbel, R., et al. Coronary-artery stenting compared with balloon angioplasty for restenosis after initial balloon angioplasty. Restenosis Stent Study Group. N Engl J Med. 339 (23), 1672-1678 (1998).
- Farooq, V., Gogas, B. D., Serruys, P. W. Restenosis: delineating the numerous causes of drug-eluting stent restenosis. Circ Cardiovasc Interv. 4 (2), 195-205 (2011).
- Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. Br Med Bull. 106, 193-211 (2013).
- Garg, S., Serruys, P. W. Coronary stents: current status. J Am Coll Cardiol. 56 (10 Suppl), S1-S42 (2010).
- Park, S. J., Kim, Y. H. Current status of percutaneous coronary intervention with drug-eluting stents in Asia. Circulation. 118 (25), 2730-2737 (2008).
- Alfonso, F. Treatment of drug-eluting stent restenosis the new pilgrimage: quo vadis. J Am Coll Cardiol. 55 (24), 2717-2720 (2010).
- Dake, M. D., et al. Paclitaxel-eluting stents show superiority to balloon angioplasty and bare metal stents in femoropopliteal disease: twelve-month Zilver PTX randomized study results. Circ Cardiovasc Interv. 4 (5), 495-504 (2011).
- Bosiers, M., et al. Results of the Protege EverFlex 200-mm-long nitinol stent (ev3) in TASC C and D femoropopliteal lesions. J Vasc Surg. 54 (4), 1042-1050 (2011).
- Duda, S. H., et al. Drug-eluting and bare nitinol stents for the treatment of atherosclerotic lesions in the superficial femoral artery: long-term results from the SIROCCO trial. J Endovasc Ther. 13 (6), 701-710 (2006).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17 (10), 2238-2244 (1997).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Roque, M., et al. Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20 (2), 335-342 (2000).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. Mouse model of arterial injury. Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).
- Edelman, E. R., Adams, D. H., Karnovsky, M. J. Effect of controlled adventitial heparin delivery on smooth muscle cell proliferation following endothelial injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (10), 3773-3777 (1990).
- Stemerman, M. B., Ross, R. Experimental arteriosclerosis. I. Fibrous plaque formation in primates, an electron microscope study. J Exp Med. 136 (4), 769-789 (1972).
- Brouchet, L., et al. Estradiol accelerates reendothelialization in mouse carotid artery through estrogen receptor-alpha but not estrogen receptor-beta. Circulation. 103 (3), 423-428 (2001).
- Filipe, C., et al. Estradiol accelerates endothelial healing through the retrograde commitment of uninjured endothelium. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2822-H2830 (2008).
- Feuls, R., et al. Microvascular denudation of the femoral artery of the mouse as a model for restenosis. Rofo. 175 (7), 952-957 (2003).
- Holt, A. W., Tulis, D. A. Experimental Rat and Mouse Carotid Artery Surgery: Injury & Remodeling Studies. ISRN Minim Invasive Surg. 2013, (2013).
- Iafrati, M. D., et al. Estrogen inhibits the vascular injury response in estrogen receptor alpha-deficient mice. Nat Med. 3 (5), 545-548 (1997).
- Sullivan, T. R., et al. Estrogen inhibits the response-to-injury in a mouse carotid artery model. J Clin Invest. 96 (5), 2482-2488 (1995).
- Yin, Y., Zhao, X., Fang, Y., Huang, L. Carotid artery wire injury mouse model with a nonmicrosurgical procedure. Vascular. 18 (4), 221-226 (2010).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
- Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. J Vis Exp. (40), (2010).
- Kuhlmann, M. T., et al. Implantation of a carotid cuff for triggering shear-stress induced atherosclerosis in mice. J Vis Exp. (59), (2012).
- Carmeliet, P., et al. Vascular wound healing and neointima formation induced by perivascular electric injury in mice. Am J Pathol. 150 (2), 761-776 (1997).
