Abstract
Analytisk ultracentrifugering (AUC) kan användas för att studera reversibla interaktioner mellan makromolekyler över ett brett område av interaktions styrkor och under fysiologiska betingelser. Detta gör AUC en metod för val att kvantitativt bedöma stökiometri och termodynamik homo- och hetero förening som är övergående och reversibla i biokemiska processer. I modaliteten av sedimente jämvikt (SE), en balans mellan diffusion och sedimentation ger en profil som en funktion av radiellt avstånd som är beroende av en specifik förening modell. Häri är ett detalj SE protokoll som beskrivs för att bestämma storleken och monomer-monomer association energi av en liten membranprotein oligomer använder en analytisk ultracentrifug. AUC-ES är etikettfritt, endast bygger på fysikaliska principer, och kan användas på både vattenlösliga och membranproteiner. Ett exempel visas av den senare, den lilla hydrofoba (SH) protein i humant respiratoriskt syncytialvirus (HRSV), En 65-aminosyrapolypeptid med en enda α-helixtrans (TM) domän som bildar penta jonkanaler. NMR-baserade strukturell data visar att SH proteinet har två protonatable His-rester i dess transmembrandomän som är orienterade som vetter mot lumen av kanalen. SE experiment har utformats för att bestämma hur pH-värdet påverkar associationskonstant och den oligomera storlek SH-protein. Medan den pentamera formen bevarades i samtliga fall, var dess associationskonstant minskas vid lågt pH. Dessa data överensstämmer med en liknande pH beroende observerats för SH kanalaktivitet, förenligt med en lumen orientering av de två His rester i SH-protein. Det senare kan uppleva elektrostatisk repulsion och minskad oligomer stabilitet vid lågt pH. Sammanfattningsvis är detta förfarande tillämpligt när kvantitativ information om subtila protein-proteinassociations förändringar i fysiologiska betingelser måste mätas.
Introduction
Analytisk ultracentrifuge 1-5 är en av de viktigaste metoderna för att studera interaktioner mellan makromolekyler under fysiologiska förhållanden, vara tillgänglig för både svaga och starka växelverkan. Metoden är märkningsfri och använder Ijusabsorption eller störningar, och även fluorescens optiska system kan användas för att få tillgång till koncentrationsintervall över flera tiopotenser 6.
Denna metod är särskilt användbar eftersom de flesta biokemiska processer är beroende av reversibla interaktioner. Stökiometri och styrka dessa interaktioner måste kvantitativt att förstå biologiska processer, och ett antal metoder finns för detta ändamål 7, 8. Men transienta interaktioner är svårt att studera 9.
Valet av en metod för att karaktärisera makromolekylära interaktioner beror på dess statiska eller dynamiska karaktär. I det första fallet, sedim Utformning hastighet (SV) används, där andelen radiella transporter mäts och komplex fraktion utifrån skillnader i flytande massa och form.
Däremot dynamiska föreningar som är reversibla på tidsskalan för försöket inte kan separeras fysiskt. I detta fall, själv- eller hetero interaktioner som leder till icke-kovalenta interaktioner är i en jämvikt som beror på den totala proteinkoncentrationen. Dessa dynamiska interaktioner kan studeras genom både sedimente jämvikt (SE) och sedimentehastighet (SV) 10. Emellertid är den första metoden enklare att utföra och beskrivs här. I SE är centrifuge utförs vid en tillräckligt låg hastighet så att en jämvikt nås mellan diffusion och sedimentation. Vid denna punkt, jämviktsprofilen hos en optisk signal (UV-VIS) som en funktion av radiellt avstånd, kan analyseras med användning av förinställda termodynamiska modeller för föreningar 11.
ve_content "> I föreliggande papper, är en sedimenteringsjämvikt studie presenterades av självassociering av ett viralt membranprotein som bildar jonkanaler. På grund av sin hydrofobicitet, är experimentet körs i närvaro av detergent, och i detta fall densiteten för lösningsmedel måste matchas till den hos tvättmedel. Emellertid, det protokoll som beskrivits skulle identiska i fallet med ett vattenlösligt protein, med undantag av att inget lösningsmedel densitetsmatchning skulle krävas.Proteinet används är kodad i RSV (HRSV), ett hölje pneumovirus i Paramyxoviridae familjen som orsakar nedre luftvägsinfektioner hos spädbarn, äldre och nedsatt immunförsvar befolkningar i världen 12. Upp till 64 miljoner rapporterade fall av HRSV-infektion och 160.000 dödsfall inträffar varje år.
HRSV genomet transkriberar 11 proteiner, inklusive de tre membranproteiner F, G, och små hydrofoba (SH). SH-protein är inblandati patogenesen av RSV-infektion. RSV saknar SH-genen (RSVΔSH) var lönsamt, orsakade bildning av syncytia och växte liksom vildtypen (WT) virus 13-16. Emellertid RSVΔSH viruset replik 10-faldigt mindre effektivt än WT i de övre luftvägarna 15, 16. Dessutom var RSVΔSH virus dämpas i in vivo mus och schimpans modellerna 13, 17.
SH-proteinet är en 64 (RSV subgrupp A) eller 65 (RSV subgrupp B) aminosyror lång typ II integralt membranprotein som ackumuleras mestadels på membranen i Golgi-facket 18. SH-protein har en enda förutspådde en-helixtrans (TM) domän 19 som är mycket bevarad 20,21. C- och N-terminala extramembrane domänerna är orienterade lumenally / extracellulärt och cytoplasmatiskt, respektive.
Både syntetiska TM domän (rester 18-43) Och full längd SH protein har visat sig bilda homopentamers i en mängd olika rengöringsmedel. Den homopentameric formen är ansvarig för kanalaktivitet i plana lipiddubbelskikt 22,23. Den korrekta orienteringen av TM monomerer i lipiddubbelskiktet bestämdes först med användning av platsspecifik infraröd dikroism 23, som visade His-22 att vara i en lumen, nära inter spiralformig, orientering. Samma TM domän orientering bekräftades genom NMR-studier som rekonstruerade den pentamera a-helix bunt av fullängdsprotein i dodecylphosphocholine (DPC) miceller 22. I denna "micell" modell, var ett enda a- spiralformad TM-domänen flankerad N-terminalt av en a-helix, och C-terminalt av en utökad B-hårnål. De två protonatable rester av SH-protein, His-22 och His-51, är belägna i TM-domänen (lumenally orienterad), och vid spetsen av den extramembrane C-terminala β hårnål (långt från kanal por), respektive. I en bicellar Environment emellertid förlänger TM α-helix upp till His-51, och båda His-rester är tillgängliga för lumen i kanalen 24. Kanalen strukturen antar en trattliknande arkitektur 22, där den smalare regionen (Ser-29 till Cys-45) 22 är fodrad med hydrofoba sidokedjor (Ile-32, Ile-36, Ile-40 och Leu-44), och Ile-36 definierar den smalaste punkten i kanal lumen. His-22 ligger vid den största öppningen av denna tratt, medan His-51 är vid spetsen på den minsta öppningen.
I föreliggande dokument, har analytisk centrifugering i en sedimentejämviktsläge använts för att avgöra om hans protonisering påverkar stabiliteten i SH protein pentameren. I detta fall var SH protein löses i C14-betaindetergent, som har använts tidigare för att visa att SH proteinformer penta oligomerer 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll är baserad på följande resurser, som skall anges för mer information och särskilda överväganden 3, 25-28.
1. Densitet matchning av detergentmiceller med 2 H2O
Obs: Densiteten hos buffertlösningen måste matchas till densiteten hos de detergentmiceller. Vanliga densitetsjusterande medel inkluderar 2 H2O, H 2 18 O, 2 H 2 18 O, glycerol och sackaros 29. H 2 18 O har samma densitet som 2 H2O och kan vara ett bättre val om deuteration av utbytbara protoner i proteinet inte är önskvärt. I denna procedur, tätheten av 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) -propanesulfonate (C14SB) detergent i 50 mM Tris pH 7,3, 100 mM NaCl kommer att matchas med 2 H2O Som ett första gissning följande koncentrationer av2 H 2 O kommer att användas: 10, 30, och 50% volym / volym.
1,1. Provberedning
- Bered följande stamlösningar och filtersterilisera genom ett 0,2 | im sprutfilter: 50 ml 500 mM Tris, pH 7,3 och 1 M NaCl (10X buffertlösning); 1 ml 250 mM C14SB (50X rengöringsmedel).
- Bered 200 | il provlösning genom blandning av 20 | il 10 X buffertlösning, 4 pl 50X detergentlösning, 20 ^ il 2 H2O (99,9%), och 156 | il avjoniserat H2O Förbered också 200 | il av referenslösning genom att blanda 20 | il 10 X buffertlösning, 20 ^ il 2 H2O (99,9%), och 160 | il avjoniserat H2O
- Upprepa steg 1.1.2 för de andra 2 H 2 O koncentrationer, dvs 30% och 50%, justera 2 H 2 O och H 2 O mängder lämpligt.
1.2. Montering av 6-kanals AUC celler och provladdning in i cellerna.
OBS: Det finns två typer av AUC cell beroende på provladdningsmetoden. Celler utan extern fyllningen har att lastas före försegling cellen, medan extern fylla cellerna kan laddas efter cellerna är förseglade. Montering av en extern-fyll AUC cell har beskrivits tidigare tre. I detta protokoll, är monteringen av en 6-kanals AUC cell utan extern fyllning beskrivs. Den största skillnaden är att den har skruvringar på båda sidor som måste skärpas för sig, och det behöver inte bostads pluggar (fig. 1). Skillnaden i monteringssteg är markerade nedan.
Figur 1. Sprängskiss av en 6-kanals AUC cell utan extern fyllning. Denna siffra har modifierats Beckman Coulter An-50 Ti och An-60 Ti Analytical Rotor, Celler och motvikts bruksanvisning.
- Förbered två fönsteraggregat för varje AUC cell med safirfönster istället för kvartsfönster (Fig. 2). Placera fönstret packningen i fönstret hållaren. Något böja fönsterfodret och placera den i fönstret hållaren så att gapet bildas mitt emot fönstret hållaren kilspår. Placera safirfönstret innanför fönstret liner, rikta märket med fönsterhållare kilspår.
Anm:. Kvartsfönstret är komprimerbar och därmed kommer att producera mer ljusbrytning i hög hastighet 28, 30 därför för störningsmätningar över 30000 rpm, såsom i denna densitet matchningsexperiment, är safirfönster används. Ett safirfönster är tyngre än kvartsfönster och har ett "X" etsade på dess sida.
Figur 2. Spräng of fönsterenheten. Denna siffra har modifierats Beckman Coulter An-50 Ti och An-60 Ti Analytisk Rotor, Celler och motvikts bruksanvisning
- Placera cellhuset med delnumret upp och ned. Med kilspår i linje med huset nyckel, glida in i cellen huset först en 6-sektor mitt med avfasade sidan nedåt, följt av ett fönster montering med fönstret nedåt (fig. 1, vänster).
- Lätt belägga skruv ringen gängor och skruvring bricka med spinkote. Placera en skruvring bricka ovanpå fönsteraggregatet. Montera skruven ringen i fönstret huset med ordet "OUT" vänd utanför. Dra åt skruven ringen med hjälp av cellinriktningsverktyget.
- Med hjälp av momentnyckel, dra åt skruven ringen till endast 60 tum-pounds.
- Placera cellen med delnummer upprätt och placeras vid 12-kl. Load 120 pl hänvisning i vänster rader och 110 ul provet i rätt rader. Se till att varje prov och referens är korrekt parade.
Obs: Exakt provvolym är inte kritisk, men hänvisningen måste ha något mer volym än provet (5-10 l), så att provet menisken blir tydlig. - Försiktigt glider in i cellen huset ett fönster montering med fönstret nedåt (fig. 1 till höger). Se till att inte störa cellen drivet och spiller innehållet.
- Upprepa steg 1.2. 3 och 1,2. 4, dra åt andra skruvringen till 120 tum-pounds. Vänd cellen och dra åt den första skruven ringen till 120 tum-pounds.
- Ladda cellerna i rotorn, installera rotorn in i centrifugen och installera monokroma enligt tillverkarens anvisningar 28.
Obs: Detaljer om denna step kan också hittas i denna referens 3.
1.3. Ställa in störningsmätning
- Starta användargränssnittet programvara för AUC instrumentet och utför laser setup och radial kalibrering för varje cell vid 3000 rpm, enligt tillverkarens instruktioner, som kommer att kortfattat sammanfattas i följande steg.
- 1.3.1.1 Efter tillräckligt vakuum har uppnåtts (<100 mikrometer), kör centrifugera vid 3000 rpm. Förhandsinterferensmönstret i användargränssnittet programvara och justera laserparametrar för att få den högsta kontrasten.
- Skapa en ny inrättat fil (Arkiv | Ny fil) specificerar "Equilibrium" och "Interference" mätning. Sätt upp en sedimentejämviktsmetod ("Method" knappen) för att köra på 45000 rpm eller den högsta hastighet väntat för proteinprover, beroende på vilket som är högre, med körning temperatur vid 20 ° C och samla 1 scan var 15 minut. Monitor jämvikts framsteg genom att öppna datafiler i HeteroAnalysis och välja "Match" funktion efter minst 12 timmar (ungefär natten, Fig. 3).
Obs: en liknande funktion finns även i SEDFIT (Alternativ | Laddar Alternativ | Test metoden till Equilibrium).
Figur 3. Resultat från HeteroAnalysis Match funktionen. The Match-funktionen kan användas för att övervaka jämvikts framsteg genom att jämföra RMSD mellan successiva skannar och den senaste genomsökningen. Detta exempel visar uppnåendet av jämvikt efter 8 h såsom indikeras genom RMSD värden asymptotiska till X-axeln.
1.4. Dataanalys
- För varje uppsättning sampel, plotta lutningen hos den radiella fördelningsprofil mot 2 H 2 O koncentration.
Obs: Fördelningen kommer att bli ett mycket grunt exponentiell att apvinklar linjäritet. X-axeln skärnings motsvarar matchande 2 H2O koncentration. - För mer exakta resultat, utför experiment i flera replikat. Alternativt, upprepa experimentet med ett smalare utbud av 2 H2O koncentration.
2. Sedimente jämvikt SH i C14SB miceller
2.1. Kör parametrar
- Beräkna buffert densitet och viskositet, protein partiell specifik volym och centrifuge hastigheten med SEDNTERP. För att beräkna buffert densitet och viskositet, välj Compute i avsnittet "Buffert Data Select" och ange buffertkomponenter i enlighet därmed, inklusive D 2 O koncentration.
- 2.1.1.1 För att beräkna protein partiell specifik volym, välj Compute i avsnittet "V-bar" och ange proteinaminosyrasekvens. Ange den högsta förväntade oligomeriska storlek i "Gör en oligomer från denna monomer: N ="område, i det här fallet N = 5. Beräkna hastigheten genom att ange värden i RPM fältet i huvudfönstret tills σ ≈ 1; detta är en tumregel att säkerställa en god exponentiell form av den radiella profilen fördelningen 25.
OBS: De beräknade värdena för detta experiment var följande: ρ = 1,03839 g / ml, η = 1,0267 cP = 0,7569 ml / g, ω 1 = 16000 rpm. - Beräkna efterföljande hastigheter att följa för att säkerställa tillräcklig skillnad mellan fördelningsprofilen vid en hastighet och nästa 25.
Obs: Detta kan också göras från funktionen "Uppskatta jämvikts rotor hastigheter funktion" i SEDFIT, som tar hänsyn till lösningen kolumnen (fyllning volym).
2.2. Exempel preparat
- Bered 1 ml referenslösning med 5 mM C14SB och 32,3% 2 H2O bestämt från densitetsmatchningsexperiment (avsnitt 1), genom att blanda 100 ^ 10X buffert Solution (steg 1.1.1), 20 pl 50X rengöringsmedel (steg 1.1.1), 323 pl 2 H2O (99,9%) och 527 pl avjoniserat H2O
- Lös lyofiliserad, HPLC-renade SH-peptider (expression och rening beskrivits tidigare 31) i lämpligt lösningsmedel såsom metanol eller 50% volym / volym vattenhaltig acetonitril. Mät A280 av de lösta peptider i en mikroliter-skala UV / Vis spektrofotometer och delprov i tre prover för att ge A 280, 12mm = 0,3, 0,5 och 0,8 (A 280, 10mm = 0,25, 0,417, och 0,67) var när utspädd till 130 | il. Lyofilisera proverna över natten och återsuspendera i 130 | il referenslösningen (steg 2.2.1) för att ge provlösning.
Obs: SH protein kan detekteras från UV / Vis absorbans vid 280 nm eftersom den innehåller Trp och Tyr-rester. Proteiner utan aromatiska rester kan detekteras genom att märka dem med en lämplig kromofor, med användning av en Trp-innehållande mutanten, eller genom att använda störans mätningar i stället för absorbans. - Följ stegen i avsnitt 1.2 för att montera en 6-kanals AUC cell med kvartsfönster. Ladda den högsta provkoncentrationen (A 280, 12mm = 0,8) i kanalen närmast rotorns centrum och prov lägsta koncentrationen (A 280, 12mm = 0,3) längst bort från rotorcentrum.
2.3. Ställa in absorbansmätningar
- Skapa en ny inrättat fil (Arkiv | Ny fil) specificerar "Equilibrium" och "Absorbans" mätning. Ange 280 nm som detektorns våglängd.
- Utför radiell kalibrering vid 3000 rpm genom att markera "Radial kalibrering före första scan" i Skanningsalternativ, ange datainsamling med låg upplösning, till exempel med Radial steg size = 0,01 cm, Replikat = 3 (låg upplösning, snabb), och köra en scan . När sökningen är klar, avmarkera alternativet.
- Sätt upp en sedimentejämviktsmetod ("metod "-knappen) för att köra på den första hastigheten beräknas i steg 2.1.3, vid 20 ° C, och samla 1 scan var 30 minuter. I varje cellernas "Detail", specificera datainsamling på låg upplösning som i steg 2.3.2. Övervaka jämvikts framsteg genom att öppna datafiler i HeteroAnalysis och välja "Match" funktion efter minst 18 timmar (ungefär natten, fig. 4).
Notera: uppnå jämvikt kan ta betydligt längre tid för den första hastigheten, medan efterföljande hastigheter tar mindre tid.
Figur 4. Resultat från HeteroAnalysis Match funktionen. Den första och andra hastigheter (överst till vänster och höger) verkar ha nått jämvikt, men det är bättre att vänta några fler timmar för att vara säker. I jämförelse har den tredje och fjärde hastigheter (längst ner till vänster och höger) tydligt nått jämviktpå kortare tid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- När jämvikt har uppnåtts, samla en scan med hög upplösning, t.ex. med Radial steg size = 0.001 cm, Replikat = 10 (hög upplösning, långsam).
- När sökningen är klar, upprepa steg 2.3.3 och 2.3.4 för nästa hastighet.
- Eventuellt då den tid som krävs för att uppnå jämvikt för varje hastighet är känd (beräknat eller från erfarenhet), ställa in sedimentejämviktsmetod scan för att inkludera alla de hastigheter som beräknats i steg 2.1.3 och att samla in 1 scan efter jämviktstiden för varje hastighet. I det här fallet, ange samling högupplösta data i varje cellernas "Detail".
2.4. Analysuppgifter i SEDFIT och SEDPHAT
Obs: För ytterligare information och frågor med dataanalys hänvisas läsaren to följande webbplats: www.analyticalultracentrifugation.com.
- Öppna högupplösta skannar i SEDFIT (Data | lastsedimentejämviktsdata) och dela upp data i 3 kanaler (dessa motsvarar olika koncentrationer för varje prov, Alternativ | Laddar Alternativ | Spara 6-kanals Rådata i 3 Subsets).
- Åter öppna datafiler som tillhör samma prov och samma koncentration men olika hastigheter i SEDFIT. Justera menisken (vertikal röd linje), cell botten (vertikal blå linje) och montage gränser (vertikala gröna linjer), och exportera data för användning i SEDPHAT (Data | Exportera data till SEDPHAT). Mata de parametrar som beräknades i steg 2.1.1, liksom rotortypen och mitt typ som begärts. Upprepa detta steg för varje prov och koncentration.
- Öppna alla data från samma prov (alla koncentrationer och hastigheter) i SEDPHAT och fyll i Experiment Parametrar; ett exempel visas i Fig. 5.
Obs: när D 2 O läggs i bufferten, deut ration utbytbara protoner kunde signifikant ändra molekylvikten för proteinet, särskilt för vattenlösliga proteiner. Membranproteiner, särskilt små uppstickare som SH protein, är mindre påverkade eftersom membran inbäddade regioner skyddas från börsen. För att korrigera detta, mata in "buffert D mol fraktion".
OBS: I detta steg är det rekommenderat att spara den redigerade dataset separat genom att välja menyn Data | Copy All data och Spara som New Config. - Välj en modell och fyll i Global Parametrar för den modellen.
Anmärkning: Som ett exempel, är den "Monomer-n-Mer självassociation" modell och dess parametrar visas i fig. 6.
Figur 5. Ett exempel på hur du fyller i Experimentella parametrar.
filer / ftp_upload / 52404 / 52404fig6.jpg "/>
Figur 6. Ett exempel på hur du fyller i Global Parametrar för monomer-n-Mer Själv Association modellen.
- Kör en global Fit genom att välja meny Fit | Global Fit och vänta tills de passar konvergerar. Anteckna (eller ta en skärmdump av) pass resultat, särskilt den globala reducerade chi-square och log K a värden. Utdrag andra data såsom passnings data och montering rester från menyn Kopiera och Display | Display termodynamiska uppgifter.
- Återgå till Global Parametrar och kolla M (1) för att passa monomeren molekylvikt och upprepa steg 2.4.5. Anteckna monterad molekylvikt och global reducerade chi-square.
- Upprepa steg 2.4.3 till 2.4.6 för varje modell som skall testas och jämföra passform kvaliteten på varje modell genom att jämföra minskad global chi-värde samt monterings rester.
Obs: Små och slump montering rester betyder i allmänhet en bra passform, och den modell som passar bäst skullehar den minsta globala reducerade chi-square. Den monterade monomer molekylvikt och dess chi-värdet bör inte avvika väsentligt från den fasta (teoretiskt) molekylvikt. - Beräkna konfidensintervallet för de erhållna log Ka i värde genom att först välja Statistik | Kritisk chi-square för misstag ytprojektionerna och mata önskat konfidensintervall. Gå sedan till statistik | Generera 1-dimensionell felyta projektion och avmarkera log Ka i dialogrutan Globala Parametrar att erhålla chi-square värden för log Ka.
Obs: läsarna uppmanas att konsultera följande källor (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ sedphat / statistics.htm) för mer information om metoden 32 samt illustration av denna metod 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den radiella fördelningen profil C14SB detergentmiceller i 50 mM Tris, 100 mM NaCl pH 7.3 bildar ett mycket grunt exponentiell som skulle monteras på en linjär modell (figur 7A). Lutningen för denna distribution är omvänt korrelerad till D2O koncentration (Figur 7B). Den punkt där lutningen är noll, dvs, den matchande D2O koncentration, befanns vara 32,3%.
Se figur 7 nedan.
Samma experiment upprepades för olika buffertar: 50 mM natriumfosfat, 100 mM NaCl, pH 5,5 och 50 mM fosfat-citrat, 100 mM NaCl, pH 3 för att erhålla matchande D2O koncentrationer av 30,3% och 41,0%, respektive.
Prover av SH vildtyp (wt) i tvättmedel utsattes för pH 3, 5.5 och 7.3 (totalt 6 prover), följt av centrifugering vid 15.000, 19.000, 23.000, 28.000, 34.000 och 42.000 rpm. Data erhålls vid lägre hastighet inte kunde tillförlitligt monterad, möjligen på grund jämvikt inte hade uppnåtts, alltså data som erhållits från de fyra högre hastigheter användes. Vid pH 7,3, var SH WT fann att bilda pentamererna (figur 8 och tabell 1) med uppenbar log K a = 21,35 (tabell 2). Föreningen konstant förändrades inte vid pH 5,5, men det var signifikant reducerad vid pH 3. Detta är i överensstämmelse med tidigare rapporter 24, som rapporterade en minskning av ledningsförmågan vid lägre pH, med ett pK av 4,5.
Se figur 8 nedan.
Se tabell 1 nedan.
Figur 7. Densitet matchning av C14SB med D 2 O. (A) Radiell distribution profilen bildas av C14SB detergentmiceller i 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,3 med 25, 30, och 35% D 2 O. De data separat monterad på en linjär modell (svart). (B) Backarna plottades mot D 2 O koncentration (svarta fyrkanter) och monteras på en linjär modell (röd linje). Den matchande D 2 O koncentration indikeras (röd pil).
Figur 8. Montering av SH i C14SB till monomer-pentamer modell. Radiell fördelningsprofil av SH i C14SB vid pH 7 (öppna cirklar) befanns passa bäst till monomeren-pentameren självassociering modell (svart heldragen linje). Montering rest visas nedan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Modell (n-mer) | Chi-square (fast MW) | Chi-square (monterad MW) | Utrustat MW |
| 3 | 15,444 | 1,0492 | 13477 Da |
| 4 | 3,8094 | 1,0469 | 9889 Da |
| 5 | 1,0499 | 1,0497 | 7822 Da |
| 6 | 2,5994 | 1,547 | 6504 Da |
| 7 | 6,1667 | 1,2112 | 5743 Da |
Tabell 1. Jämförelse av globala reducerade chi-kvadrat-värden av olika monomer-n-mer-modeller.
| pH | Undre gräns (163;) | Log Ka | Övre gräns (1σ) |
| 3 | 17,432 | 17,576 | 17,737 |
| 5,5 | 20,064 | 20,419 | 20,839 |
| 7,3 | 20,687 | 21,052 | 21,492 |
Tabell 2. Jämförelse av skenbar log K a värden vid olika pH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna uppsats ger en experimentell protokoll för beredning och analys av oligomerisering av en liten membranprotein i tvättmedel använder jämviktssedimenteprov. Protokollet som beskrivs är lika giltiga -och simpler- för lösliga proteiner, som densiteten matchningssteget inte krävs. Faktum är att systemet utgörs av en blandning av detergent och protein. För att genomföra sedimente studier måste tvättmedels vara osynlig för gravitationsfältet så att det inte bidrar till partikel flotation. Sålunda har den densitet av tvättmedel som skall noggrant matchas genom tillsats av D2O till bufferten, med den begränsningen att om det tvättmedel som används är för tät, t ex., SDS, inte ens 100% D2O kan matcha det. Densiteten matchande steget är inte nödvändigt när man arbetar med ett vattenlösligt protein, eftersom det prov inte har diskmedel.
I vår ansökan, en liten virusprotein som bildar jon kanaliels har använts. Liksom alla viroporins har SH protein en α-helixtransmembrandomän, och därför måste studeras i ett rengöringsmedel som inte kommer att störa dess infödda oligomerisk storlek.
Före dessa studier därför lämpliga detergenter måste skärmas. Till exempel i tidigare SE studerar SH protein bildas penta oligomerer i DPC, C8E5 och C14-betain och pentamererna observerades också under elektrofores i milt rengöringsmedel PFO 22. Alla dessa medel är lämpliga för SE, eftersom deras densitet kan matchas genom tillsats av D 2 O. Prover bör också testas genom sedimentehastighet (SV), som ger det minsta antalet arter som finns 34.
Dessutom kommer olämpliga rengöringsmedel producera flera arter i SV, och flera band i PFO elektrofores, tyder på multipel ospecifik förening. Användbar information från SE erhålls när den dominerande antalet arter pre sänds i systemet inte är högre än två; i fallet med SH-proteinet, den data som monteras på en jämvikt mellan monomerer och pentamerer.
Det är viktigt att notera att den modell som valts för att passa SE uppgifterna, även bör vara så enkel som möjligt, det vill säga., Bör en enda art av okänd molekylvikt prövas först, följt av reversibla jämvikter mellan monomer och oligomerer av ökande storlek. Fler komplexa modeller har associerat en högre tvetydighet. Dessutom kan små populationer av andra mindre eller större oligomerer inte detekteras, och modellen kommer bara ange vilka är de dominerande arterna. I fallet med viroporins, detta är särskilt tydligt eftersom oligomera förändringar storlek beroende på subtila experimentella förhållanden, t.ex. tvättmedel som används, pH, proteinkoncentration, centrifuge hastighet eller mutationer, t.ex. i hepatit C-virus p7 35, influensa A M2 36 eller SH protein 24.
jove_content "> De erhållna resultaten för WT SH protein visar tydligt att föreningen konstant pentameren reduceras vid pH 3. Dessa resultat match kanalaktivitetsmätningar som erhållits med SH-protein i syntetisk lipidbiskikten där konduktans var markant minskade vid pH 3 (pK ~ 4,5), medan den förblev konstant mellan pH 7 och 5 24. Baserat på dessa resultat, kan det vara möjligt att SH kanalaktivitet är något regleras av lägre pH vid närvaro i infödda biologiska membran. Även i Golgi lumen pH är bara en enhet under den för cytoplasman, droppar intravesikulär pH längs endocytiska vägen från pH 6,0-6,5 i tidiga endosomer till pH 4,5-5,5 i slutet endosomer och lysosomer 37. I den infekterade cellen, kan pK för konduktans ändringar eller pentamert stabilitet vara högre än de erhållna in vitro häri och tidigare 24, alltså pH kunde verkligen spela en roll i att modulera kanalaktivitet under livscykelnav viruset. Mutation av protonatable His-rester i samband med den infekterade cellen är en intressant väg för framtida experiment 38.Slutligen studiet av SH-protein underlättas genom närvaron av Trp i sin ordning, vilket underlättar UV-absorption mätningar. Emellertid kan kunskap om strukturen av oligomeren möjliggöra införandet av Trp i okänsliga platser, t.ex., lipid -eller lösningsmedels vetter delar av proteinet i membranet - eller soluble- proteiner. Alternativt proteinet kan märkas med en synlig absorberande eller fluorescerande etikett.
Sammanfattningsvis detta protokoll beskriver tillämpningen av SE att bestämma oligomeriska storlek och associationskonstanter i en definierad viral kanal, när experimentella parametrar ändras. I det här fallet har pH varierats för att studera effekten på stabiliteten i hans protone, men många andra hypotes kan testas, till exempel effekter av mutationer på strukturellintegritet av dessa oligomerer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate | Sigma | T0807 | |
| Deuterium oxide 99.8% | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8 | |
| An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place | Beckman Coulter | 361964 | |
| Cell housing | Beckman Coulter | 334784 | |
| 12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled | Beckman Coulter | 331376 | |
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | |
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | |
| Sapphire window | Beckman Coulter | 307177 | |
| Quartz window | Beckman Coulter | 301730 | |
| Screw-ring washer | Beckman Coulter | 362328 | |
| Screw ring | Beckman Coulter | 301922 | |
| Spinkote | Beckman Coulter | 306812 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | |
| SEDNTERP | http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page | ||
| HeteroAnalysis | http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp | ||
| SEDFIT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm |
||
| SEDPHAT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm |
References
- Laue, T. M., Stafford, W. F. 3rd Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530 (2009).
- Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
- MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge. Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-Protein Interactions - Methods for Detection and Analysis. Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).
- Alexandrov, A. A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs. Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).
- Ebel, C. Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins. Methods. 54, 56-66 (2011).
- Minton, A. P. Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction. Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).
- Dowell, S. F. Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults. J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).
- Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse. J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).
- Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein. J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).
- Jin, H. Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo. Virology. 273, 210-218 (2000).
- Karron, R. A. Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).
- Whitehead, S. S. Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees. J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).
- Rixon, H. W. The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection. J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).
- Collins, P. L., Mottet, G. Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus. J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).
- Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B. J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).
- Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene. J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).
- Gan, S. W. The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein Sci. 17, 813-820 (2008).
- Li, Y. Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment. J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).
- Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity. Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).
- Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium. Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).
- Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).
- An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , Beckman Coulter, Inc. Available from: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/techdocs?docname=LXLA-TB-003 (2005).
- Mayer, G. Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching. Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).
- Laue, T. Ch. 20.3. Current Protocols in Protein Science. 20, John Wiley & Sons, Inc. 20.23.21-20.23.13 (2001).
- Gan, S. W. The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Bevington, P. R., Robinson, D. K. Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, McGraw-Hill. New York. (1969).
- Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1. Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).
- Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins. Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).
- Montserret, R. NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus). J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).
- Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions. Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).
- Sorkin, A., von Zastrow, M. Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).
- Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).
