Abstract
Analytisk ultracentrifugering (AUC) kan bruges til at studere reversible vekselvirkninger mellem makromolekyler over et bredt område af interaktion styrker og under fysiologiske betingelser. Dette gør AUC et foretrukne metode til kvantitativ vurdering støkiometri og termodynamik homo- og hetero-forening, der er forbigående og reversible i biokemiske processer. I modalitet af sedimentation ligevægt (SE), en balance mellem diffusion og sedimentation giver en profil som funktion af radial afstand, der afhænger af en specifik association model. Heri er en detaljeret SE beskrevne protokol til at bestemme størrelsen og monomer-monomer association energi af en lille membranprotein oligomer ved hjælp af en analytisk ultracentrifuge. AUC-ES er label-fri, kun er baseret på fysiske principper, og kan bruges på begge vandopløselige og membranproteiner. Et eksempel er vist på sidstnævnte, den lille hydrofob (SH) protein i humant respiratorisk syncytialvirus (HRSV), En 65-aminosyre polypeptid med en enkelt α-helical transmembrane (TM) domæne, som danner pentamere ionkanaler. NMR-baserede strukturelle data viser, at SH protein har to protonerbar His-rester i dens transmembrane domæne, der er orienteret overfor lumen af kanalen. SE eksperimenter er designet til at bestemme, hvordan pH påvirker associationskonstant og oligomere størrelse SH protein. Mens den pentamere form, blev bevaret i alle tilfælde var dens forening konstant reduceret ved lav pH. Disse data er i overensstemmelse med en lignende pH-afhængighed observeret for SH-kanal aktivitet i overensstemmelse med en lumenale orientering af de to Hans rester i SH protein. Sidstnævnte kan opleve elektrostatiske frastødning og reduceret oligomer stabilitet ved lav pH. Sammenfattende denne metode anvendes, når kvantitative oplysninger om subtile protein-protein forening ændringer i fysiologiske betingelser skal måles.
Introduction
Analytisk ultracentrifugering 1-5 er en af de vigtigste metoder til at studere interaktioner af makromolekyler under fysiologiske betingelser, at være tilgængelige for både svage og stærke vekselvirkninger. Metoden er mærket-fri og bruger lys absorption eller indblanding, og selv fluorescens optiske systemer kan bruges til at få adgang koncentrationsintervaller over flere størrelsesordener 6.
Denne metode er især nyttig, da de fleste biokemiske processer afhænger vendbare interaktioner. Støkiometrien og styrken af disse interaktioner skal kvantitativt at forstå biologiske processer, og en række metoder til at dette formål 7, 8. Det er imidlertid vanskeligt at studere 9 forbigående interaktioner.
Valget af en metode til at karakterisere makromolekylære interaktioner afhænger af dens statisk eller dynamisk karakter. I det første tilfælde sedim entation hastighed (SV) anvendes, hvor hastigheden af radial transport måles og komplekser fraktioneret på baggrund af forskelle i stigende masse og form.
I modsætning hertil dynamiske forbund, som er reversibel på tidsskalaen af eksperimentet ikke kan adskilles fysisk. I dette tilfælde, selv- eller hetero-interaktioner, der fører til ikke-kovalente interaktioner i en ligevægt, der afhænger af den totale proteinkoncentration. Disse dynamiske vekselvirkninger kan studeres både sedimentation ligevægt (SE) og sedimentation hastighed (SV) 10. Men den første metode er enklere at udføre og er beskrevet her. I SE er centrifugering udføres ved en tilstrækkelig lav hastighed, så en ligevægt mellem diffusion og sedimentation. På dette tidspunkt ligevægt profil af et optisk signal (UV-VIS) som en funktion af radial afstand, kan analyseres ved anvendelse af forudindstillede termodynamiske modeller for foreninger 11.
ve_content "> I det foreliggende papir, en sedimentation ligevægt undersøgelse præsenteres i association af et viralt membranprotein, der danner ionkanaler. På grund af dets hydrofobicitet, er forsøget køre i nærvær af detergent, og i dette tilfælde densitet Opløsningsmidlet skal matches med den detergent. Men protokollen beskrevet ville identisk i tilfælde af et vandopløseligt protein, bortset fra, at ingen tilsvarende tæthed opløsningsmiddel ville være påkrævet.Det anvendte protein er kodet i human respiratorisk syncytialvirus (HRSV), et kappebærende pneumovirus i Paramyxoviridae-familien, der forårsager nedre luftveje hos spædbørn, ældre og immunkompromitterede populationer verdensplan 12. Op til 64 millioner rapporterede tilfælde af HRSV-infektion og 160.000 dødsfald hvert år.
HRSV genomet transkriberer 11 proteiner, herunder de tre membranproteiner F, G og små hydrofobe (SH). SH protein er involvereti patogenesen af RSV-infektion. RSV mangler SH genet (RSVΔSH) var levedygtige, forårsagede dannelsen af syncytia og voksede samt vildtype (WT) virus 13-16. RSVΔSH virus replikerede imidlertid 10 gange mindre effektivt end WT i de øvre luftveje 15, 16. Også blev RSVΔSH virus svækket i in vivo mus og chimpanse modeller 13, 17.
SH-proteinet er en 64 (RSV undergruppe A) eller 65 (RSV undergruppe B) aminosyrer lange type II integreret membranprotein, der akkumulerer hovedsagelig på membraner i Golgi kammer 18. SH protein har en enkelt forudsagt a-spiralformet transmembran (TM) domæne 19, som er stærkt bevaret 20,21. C- og N-terminale extramembrane domæner er orienteret lumenally / ekstracellulært og cytoplasmatisk hhv.
Både syntetiske TM domæne (resterne 18-43) Og fuld længde SH protein har vist sig at danne homopentamers i en række forskellige detergenter. Den homopentameric formular er ansvarlig for kanal aktivitet i plane lipiddobbeltlag 22,23. Den korrekte orientering af TM monomerer i lipiddobbeltlaget blev først bestemt ved hjælp af stedspecifik infrarød dichroisme 23, som viste His-22 for at være i en luminale tæt på inter-spiralformet orientering. Den samme TM domæne orientering blev bekræftet ved NMR-undersøgelser, der rekonstrueret pentamere a-spiralformet bundt af fuld-længde protein i dodecylphosphocholine (DPC) miceller 22. I denne "micelle" model, blev en enkelt a- spiralformet TM domæne flankeret N-terminalt af en a-helix, og C-terminalt af en udvidet b-hårnål. De to protonerbar rester af SH protein, His-22 og His-51, er placeret i TM-domænet (lumenally orienteret) og ved spidsen af extramembrane C-terminal β hårnål (langt fra kanalen pore) hhv. I en bicellar environment imidlertid TM α-helix strækker sig op til His-51, og begge His-rester er tilgængelige for lumen kanal 24. Kanalen struktur vedtager en tragt-lignende arkitektur 22, hvor det smallere område (Ser-29 til Cys-45) 22 er foret med hydrofobe sidekæder (Ile-32, Ile-36, Ile-40 og Leu-44), og Ile-36 definerer det smalleste sted i kanalen lumen. His-22 er placeret på den største åbning af denne tragt, hvorimod His-51 på spidsen af den mindste åbning.
I det foreliggende papir, er analytisk centrifugering i en sedimentation ligevægt tilstand blevet anvendt til at afgøre, om hans protonering påvirker stabiliteten af SH protein pentamer. I dette tilfælde blev SH protein opløst i C14-betain detergent, som er blevet anvendt tidligere for at vise, at SH protein former pentamere oligomerer 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol er baseret på følgende ressourcer, som skal henvist for flere detaljer og særlige overvejelser 3, 25-28.
1. Density matchning af vaskemiddel miceller med 2 H 2 O
Bemærk: Densiteten af pufferopløsningen skal modsvares til densiteten af detergent-miceller. Fælles density-justerende midler indbefatter 2 H 2 O, H 2 18 O, 2 H 2 18 O, glycerol og sucrose 29. H 2 18 O har samme densitet som 2 H2O og kan være et bedre valg, hvis deuterering af udskiftelige protoner i proteinet ikke er ønsket. I denne procedure, tætheden af 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) -propanesulfonate (C14SB) vaskemiddel i 50 mM Tris pH 7,3, 100 mM NaCl vil blive matchet med 2 H 2 O. Som et indledende gæt følgende koncentrationer af2 H 2 O vil blive anvendt: 10, 30, og 50% v / v.
1.1. Forberedelse af prøver
- Forbered følgende stamopløsninger og Filtersteriliser gennem et 0,2 um sprøjtefilter: 50 ml 500 mM Tris pH 7,3 og 1 M NaCl (10X buffer opløsning); 1 ml 250 mM C14SB (50X rengøringsmiddel).
- Forbered 200 pi prøveopløsning ved at blande 20 pi 10X buffer-opløsning, 4 pi 50X rengøringsmiddel, 20 pi 2 H2O (99,9%), og 156 pi deioniseret H2O Forbered også 200 pi referenceopløsning ved at blande 20 pi 10X buffer-opløsning, 20 pi 2 H2O (99,9%), og 160 pi deioniseret H2O
- Gentag trin 1.1.2 for de andre 2 H2O koncentrationer, dvs. 30% og 50%, at justere de 2 H 2 O og H 2 O beløb korrekt.
1.2. Montering af 6-kanal AUC celler og prøve lastning i cellerne.
Bemærk: Der er to typer af AUC celle afhængigt af prøven loading metoden. Celler uden ekstern fyld skal lastes forud for forsegling af cellen, mens ekstern-fill celler kan indlæses efter at cellerne er forseglede. Montering af en ekstern position AUC celle er blevet beskrevet tidligere 3. I denne protokol, er samlingen af en 6-kanals AUC celle uden ekstern fyld beskrevet. Den væsentligste forskel er, at det har øjeskruer på begge sider, der skal strammes separat, og det behøver ikke boliger stik (fig. 1). Forskellen i monteringstrin er fremhævet nedenfor.
Figur 1. eksploderet billede af en 6-kanals AUC celle uden ekstern fyld. Dette tal er blevet ændret fra Beckman Coulter An-50 Ti og An-60 Ti Analytical Rotor, Celler, og Frontlæsser brugsanvisning.
- Forbered to vinduespartier for hver AUC celle med safir vindue i stedet for kvarts vindue (fig. 2). Placer vinduet pakning i vinduet holderen. Lidt bøje vinduet liner og læg den ind i vinduet holderen, således at mellemrummet dannes modsat vinduet holder noten. Placer safir vinduet inde i vinduet liner, tilpasse mærket med vinduet holder noten.
Bemærk:. Den kvartsvindue er sammentrykkelig og derfor vil producere mere lysbrydning ved høj hastighed 28, 30 derfor for målinger forstyrrelser over 30000 rpm, såsom i denne tæthed matching eksperiment safir vinduer anvendes. En safir vindue er tungere end kvarts vindue og har et "X" ætset på siden.
Figur 2. Eksplosionstegning of vinduet forsamling. Dette tal er blevet ændret fra Beckman Coulter An-50 Ti og An-60 Ti Analytisk Rotor, Celler, og Frontlæsser brugermanual
- Placer celle hus med varenummeret på hovedet. Med notgange på linie med husets nøgle, glide ind i cellen huset første en 6-sektor omdrejningspunktet med skrå nedad efterfulgt af ét vindue samling med vinduet nedad (fig. 1, venstre).
- Let pels skrueringen tråde og skrue ring skive med spinkote. Placer en skrue ring skive på toppen af vinduet forsamling. Montér skruen ringen i vinduet hus med ordet "OUT" vender udenfor. Spænd skruen ring ved hjælp af celle justering værktøj.
- Ved hjælp af momentnøglen, stramme skruen ring til kun 60 tommer-pounds.
- Anbring cellen med delnummer opretstående og placeret ved 12 middag. LOAD 120 pi henvisning i den venstre rækker og 110 pi prøve i de rigtige rækker. Sørg for, at hver prøve og reference er parret korrekt.
Bemærk: Præcis prøvevolumen er ikke kritisk, men henvisningen skal have lidt mere volumen end prøven (5-10 pi), således at prøven menisken bliver tydelig. - Forsigtigt glide ind i cellen huset ét vindue forsamling med vinduet nedad (fig. 1, til højre). Pas på ikke at forstyrre cellen overdrevent og spilde indholdet.
- Gentag trin 1.2. 3 og 1,2. 4, stramme den anden skrue ring til 120 inch-pounds. Vend cellen og spænd den første skrue ring til 120 tommer-pounds.
- Læg cellerne ind i rotoren, installere rotoren i centrifugen og installere monokromator i overensstemmelse med producentens anvisninger 28.
Bemærk: Oplysninger om denne step kan også findes i denne reference 3.
1.3. Opsætning måling indblanding
- Start brugergrænsefladen software til AUC instrument og udføre laser opsætning og radial kalibrering for hver celle ved 3000 rpm, i henhold til producentens instruktioner, som kort vil blive opsummeret i det følgende trin.
- 1.3.1.1 Efter tilstrækkelig vakuum er nået (<100 mikron), køre centrifugen ved 3000 rpm. Vis eksempel interferensmønstret i brugergrænsefladen software og justere laser parametre for at opnå den højeste kontrast.
- Opret en ny oprettet fil (Filer | Ny fil) angivelse "Equilibrium" og "Interferens" måling. Opsætning af en sedimentation ligevægtsmetode ("Method" knappen) for at køre på 45000 rpm eller den højeste hastighed forventes for proteinprøver, hvis denne er højere, med run temperatur ved 20 ° C og indsamle 1 scanning hver 15 minutter. Monitor ligevægt fremskridt ved at åbne datafilerne i HeteroAnalysis og vælge funktionen "Match" efter mindst 12 timer (ca. natten over, fig. 3).
Bemærk: en lignende funktion er også tilgængelig i SEDFIT (Valg | Loading Indstillinger | Test metode til ligevægt).
Figur 3. Resultat af HeteroAnalysis Match funktionen. Den Match funktionen kan bruges til at overvåge ligevægt fremskridt ved at sammenligne RMSD mellem successive scanninger og den sidste scanning. Dette eksempel viser opnåelsen af ligevægt efter 8 timer som angivet ved RMSD værdier asymptotiske til X-aksen.
1.4. Dataanalyse
- For hvert sæt af prøver, plotte hældningen af den radiale fordeling profil mod 2 H 2 O koncentration.
Bemærk: Fordelingen vil være en meget lavvandet eksponentiel at APtilgange linearitet. X-aksen skæringspunkt svarer til matchende 2 H 2 O koncentration. - For mere præcise resultater, udføre eksperimentet i flere gentagelser. Alternativt gentage eksperimentet med en smallere vifte af 2 H 2 O-koncentration.
2. Sedimentation ligevægt SH i C14SB miceller
2.1. Kør parametre
- Beregn buffer massefylde og viskositet, protein delvis specifikt volumen og centrifugering hastighed ved hjælp SEDNTERP. For at beregne buffer massefylde og viskositet, vælg Compute "Buffer data Select" i og indtast bufferkomponenter overensstemmelse hermed, herunder D2O koncentration.
- 2.1.1.1 For at beregne protein delvis specifikt volumen, skal du vælge Compute "V-bar" i og indtast protein aminosyresekvens. Angiv den højeste forventede oligomere størrelse i "Gør en oligomer fra denne monomer: N ="område, i dette tilfælde N = 5. Beregn hastigheden ved at indtaste værdier i RPM område i hovedvinduet indtil σ ≈ 1; dette er en tommelfingerregel for at sikre en god eksponentiel form af den radiale fordeling profilen 25.
Bemærk: Værdierne er beregnet for dette forsøg var som følger: ρ = 1,03839 g / ml, η = 1,0267 cP = 0,7569 ml / g, ω 1 = 16000 rpm. - Beregn efterfølgende hastigheder for at følge for at sikre en tilstrækkelig forskel på fordelingen profil på én hastighed og den næste 25.
BEMÆRK: Denne kan også gøres fra funktionen "Skøn ligevægt rotor hastigheder funktionen" i SEDFIT, der tager hensyn til den løsning, kolonne (påfyldning volumen).
2.2. Sample præparater
- Forbered 1 ml henvisning løsning med 5 mM C14SB og 32,3% 2 H 2 O som bestemt ud fra densitet matching eksperiment (afsnit 1), ved at blande 100 pi 10X buffer opklaringn (trin 1.1.1), 20 pi 50X detergentopløsning (trin 1.1.1), 323 pi 2 H2O (99,9%) og 527 pi deioniseret H2O
- Opløs frysetørret, HPLC-oprenset SH peptider (ekspression og oprensning tidligere 31 beskrevet) i egnet opløsningsmiddel, såsom methanol eller 50% vol / vol vandig acetonitril. Mål A280 af de opløste peptider i en mikroliter-skala UV / Vis spektrofotometer og prøve for tre prøver for at give en 280, 12mm = 0,3, 0,5, og 0,8 (A 280, 10mm = 0,25, 0,417 og 0,67) hver, når fortyndet til 130 pi. Lyofilisere prøverne natten over og resuspender i 130 pi referenceopløsning (trin 2.2.1) for at give testopløsningen.
Bemærk: SH protein kan detekteres fra UV / Vis-absorbans ved 280 nm, fordi det indeholder Trp og Tyr-rester. Proteiner uden aromatiske rester kan detekteres ved at mærke dem med en egnet kromofor ved hjælp af en Trp-indeholdende mutant eller ved hjælp blandeIOU målinger i stedet for absorbans. - Følg trinene i afsnit 1.2 for at samle en 6-kanals AUC celle med kvarts vinduer. Læg den højeste koncentration prøve (A 280, 12mm = 0,8) i kanalen nærmest rotoren center og laveste koncentration prøve (A 280, 12mm = 0,3) længst væk fra rotoren centrum.
2.3. Opsætning af absorbansmålinger
- Opret en ny oprettet fil (Filer | Ny fil) angivelse "Equilibrium" og "Absorbans" måling. Angiv 280 nm som detektoren bølgelængde.
- Udfør radial kalibrering ved 3000 rpm ved at kontrollere "Radial kalibrering før første scanning" i Scanningsindstillinger angivelse dataindsamling ved lav opløsning, f.eks med Radial trin size = 0,01 cm, Replikater = 3 (lav opløsning, hurtig), og udfører en enkelt scanning . Når scanningen er fuldført, skal du fjerne markeringen af indstillingen.
- Opsætning af en sedimentation ligevægtsmetode ("Method knappen ") til at køre ved den første hastighed, der beregnes i trin 2.1.3, ved 20 ° C, og indsamle 1 scanning hver 30 minutter. I hver cellernes "Detail", angiv dataindsamlingen ved lav opløsning som i trin 2.3.2. Overvåg ligevægt fremskridt ved at åbne datafilerne i HeteroAnalysis og vælge funktionen "Match" efter i mindst 18 timer (ca. natten over, fig. 4).
Bemærk: opnåelse af ligevægt kan tage væsentligt længere tid for den første hastighed, mens de efterfølgende hastigheder vil tage mindre tid.
Figur 4. Resultater fra HeteroAnalysis Match-funktionen. Den første og anden hastigheder (øverst til venstre og højre) synes at have nået ligevægt, men det er bedre at vente et par timer mere for at være sikker. Til sammenligning har den tredje og fjerde hastigheder (nederst til venstre og højre) klart nået ligevægtpå kortere tid. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
- Når ligevægt er nået, indsamle en enkelt scanning ved høj opløsning, f.eks med Radial trin size = 0.001 cm, Replikater = 10 (høj opløsning, langsom).
- Når scanningen er fuldført, skal du gentage trin 2.3.3 og 2.3.4 for den næste hastighed.
- Eventuelt når den nødvendige tid til at nå ligevægt for hver hastighed er kendt (beregnet eller af erfaring), der er nedsat af sedimentation ligevægtsmetoden scanning til at omfatte alle de hastigheder beregnet i trin 2.1.3 og til at indsamle 1 Scan efter ligevægtstidspunktet for hver hastighed. I dette tilfælde skal du angive indsamlingen høj opløsning data i hver cellernes "Detail".
2.4. Dataanalyse i SEDFIT og SEDPHAT
Bemærk: For yderligere oplysninger og overvejelser i dataanalyse læseren henvises to følgende websted: www.analyticalultracentrifugation.com.
- Åbne scanninger i høj opløsning i SEDFIT (Data | load sedimentation ligevægt data) og opdele data i 3 kanaler (de svarer til forskellige koncentrationer for hver prøve; Indstillinger | Loading Indstillinger | Husk 6-kanals rå data i 3 Delmængder).
- Genåbne datafiler, der hører til den samme prøve og samme koncentration, men forskellige hastigheder i SEDFIT. Juster menisk (lodret rød linje), celle bund (lodret blå linje) og montering grænser (lodrette grønne linjer), og eksportere data til brug i SEDPHAT (Data | eksportere data til SEDPHAT). Input parametre beregnet i trin 2.1.1, samt rotortype og omdrejningspunktet typen som anmodet. Gentag dette trin for hver prøve og koncentration.
- Åbn alle data fra den samme prøve (alle koncentrationer og hastigheder) i SEDPHAT og udfyld eksperimentparametre; et eksempel er vist i fig. 5.
Bemærk: når D 2 O tilsættes i bufferen, Deut bejde af udskiftelige protoner kan i væsentlig grad ændre molekylvægten af proteinet, især for vandopløselige proteiner. Membranproteiner, især små som SH protein, er mindre påvirket, fordi membran-embedded regioner er beskyttet mod udveksling. For at rette dette, indtaste "buffer D mol fraktion".
Bemærk: På dette trin, anbefales det at gemme den redigerede datasæt særskilt ved at vælge menuen Data | Kopiér alle data og Gem som New Config. - Vælg en model, og udfyld Globale parametre for denne model.
Bemærk: Som et eksempel, er det "Monomer-n-Mer Self-Association" model og dens parametre er vist i fig. 6.
Figur 5. Et eksempel på, hvordan man kan udfylde eksperimentelle parametre.
filer / ftp_upload / 52404 / 52404fig6.jpg "/>
Figur 6. Et eksempel på, hvordan man udfylder Globale parametre for monomer-n-Mer selvassociering model.
- Kør en global Fit ved at vælge menu Fit | Global Fit og vente, indtil fit konvergerer. Bemærk ned (eller tage et screenshot af) de montering resultater, især den globale reducerede chi-square og log K-værdier. Uddrag andre data såsom fit data og montering restprodukter fra menuen Kopier og Display | Display termodynamiske oplysninger.
- Retur til Global Parametre og tjek M (1) til at passe monomeren molekylvægt og gentag trin 2.4.5. Bemærk ned monteret molekylvægt og global reducerede chi-kvadrat.
- Gentag trin 2.4.3 til 2.4.6 for hver model, der skal testes og sammenligne fit kvaliteten af hver model ved at sammenligne den reducerede globale chi-square værdi samt montering residualer.
Bemærk: Små og tilfældige montering rester indikerer generelt en god pasform, og den model, der passer bedst villehar den mindste globale reducerede chi-kvadrat. Den udstyret monomer molekylvægt og dens chi-square værdi ikke adskiller sig væsentligt fra det faste (teoretisk) molekylvægt. - Beregn konfidensintervallet for den opnåede log Ka i værdi ved først at vælge Statistik | Kritisk chi-kvadrat til fejl overflade fremskrivninger og indtaste den ønskede konfidensinterval. Gå derefter til Statistik | Generer 1-dimensional fejl overflade projektion og fravælge log Ka i dialogboksen Globale parametre for at opnå de chi-square værdier for log Ka.
Bemærk: læsere rådes til at konsultere følgende kilder (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ sedphat / statistics.htm) for flere detaljer om den metode 32 samt illustration af denne metode 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den radiale fordeling profil C14SB detergent miceller i 50 mM Tris, 100 mM NaCI pH 7,3 danner en meget overfladisk eksponentielle der kan monteres på en lineær model (figur 7A). Hældningen af denne fordeling er omvendt korreleret til D2O koncentration (figur 7B). Det punkt, hvor hældningen er nul, dvs. matching D2O koncentration blev fundet at være 32,3%.
Se figur 7 nedenfor.
Det samme eksperiment blev gentaget for de forskellige buffere: 50 mM natriumphosphat, 100 mM NaCl, pH 5,5 og 50 mM phosphat-citrat, 100 mM NaCl, pH 3 for at opnå matchende D2O koncentrationer på 30,3% og 41,0%, henholdsvis.
Prøver af SH vildtype (wt) i detergent blev udsat for pH 3, 5,5 og 7,3 (i alt 6 prøver), efterfulgt af centrifugering ved 15.000, 19.000, 23.000, 28.000, 34.000 og 42.000 rpm. Data opnås ved lavere hastighed ikke kunne pålideligt monteret, muligvis fordi ligevægt ikke var blevet nået, derfor oplysninger fra de fire højere hastigheder blev anvendt. Ved pH 7,3 blev SH WT sig at danne pentamerer (figur 8 og tabel 1) med tilsyneladende log K a = 21,35 (tabel 2). Foreningen konstant ændrede ikke ved pH 5,5, men det blev væsentligt reduceret ved pH 3. Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporter 24, der indberettede et fald på ledningsevne ved lavere pH, med en pK på 4,5.
Se figur 8 nedenfor.
Se tabel 1 nedenfor.
Figur 7. Density matching af C14SB med D 2 O. (A) Radial distribution profil dannet af C14SB detergent miceller i 50 mM Tris, 100 mM NaCI pH 7,3 med 25, 30, og 35% D 2 O. Dataene blev separat monteret på en lineær model (sort). (B) skråninger blev plottet mod D2O fusion (sorte firkanter), og monteret på en lineær model (rød linje). Matching D2O koncentrationen er angivet (rød pil).
Figur 8. Montering af SH i C14SB til monomer-pentamer model. Radial fordeling profil SH i C14SB ved pH 7 (åbne cirkler) blev fundet at passe bedst til monomer-pentamer selvassociering model (sort, fast linie). Montering resterende er vist nedenfor. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Model (n-mer) | Chi-i-(fast MW) | Chi-i-(monteret MW) | Monteret MW |
| 3 | 15,444 | 1,0492 | 13477 Da |
| 4 | 3,8094 | 1,0469 | 9889 Da |
| 5 | 1,0499 | 1,0497 | 7822 Da |
| 6 | 2,5994 | 1,547 | 6504 Da |
| 7 | 6,1667 | 1,2112 | 5743 Da |
Tabel 1. Sammenligning af globale reducerede chi-square-værdier af forskellige monomer-n-mer-modeller.
| pH | Nedre grænse (163;) | Log Ka | Øvre grænse (1σ) |
| 3 | 17,432 | 17,576 | 17,737 |
| 5.5 | 20,064 | 20,419 | 20,839 |
| 7.3 | 20,687 | 21,052 | 21,492 |
Tabel 2. Sammenligning af tilsyneladende log K-værdier ved forskellige pH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir giver en forsøgsprotokol til forberedelse og analyse af oligomerisering af en lille membran protein i vaskemiddel hjælp ligevægt sedimentering prøve. Den beskrevne protokol gælder også -og simpler- for opløselige proteiner, som tætheden matching skridt ikke er påkrævet. Faktisk er systemet udgøres af en blanding af rengøringsmiddel og protein. At gennemføre sedimentering undersøgelser, skal vaskemiddel være usynlig for tyngdefeltet, så det ikke bidrager til partiklen flotation. Således densitet detergent skal nøje afstemt ved tilsætning af D2O til bufferen, med den begrænsning, at hvis den anvendte detergent er for tæt, f.eks., SDS, ikke engang 100% D2O kan matche det. Tætheden matching trin er ikke påkrævet, når man arbejder med et vandopløseligt protein, idet prøven ikke har detergent.
I vores ansøgning, en lille viralt protein, der danner ion kanaliEls er blevet brugt. Som alle viroporins, SH protein har en α-helix transmembrandomæne, og derfor skal undersøges i et vaskemiddel, der ikke vil forstyrre dens native oligomere størrelse.
Før disse undersøgelser derfor egnede detergenter skal screenes. For eksempel i tidligere SE studerer SH protein dannet pentamere oligomerer i DPC, C8E5 og C14-betain og pentamerer blev også observeret under elektroforese i den milde detergent PFO 22. Alle disse rengøringsmidler er egnede til SE, da deres densitet kan matches ved tilsætning af D 2 O. Prøver skal også testes ved sedimentering hastighed (SV), der giver det mindste antal arter 34.
Desuden vil uegnede rengøringsmidler producere flere arter i SV, og flere bands i PFO elektroforese, indikerer flere ikke-specifik forening. Nyttige oplysninger fra SE opnås, når den overvejende antal arter pre sendt i systemet ikke er højere end to; i tilfælde af SH protein blev data monteret på en ligevægt mellem monomerer og pentamerer.
Det er vigtigt at bemærke, at den valgte at passe til SE datamodel, også bør være så enkel som muligt, dvs.., Bør en enkelt art af ukendt molekylvægt være forsøgt først, efterfulgt af reversible ligevægt mellem monomer og oligomerer af stigende størrelse. Mere komplekse modeller har tilknyttet en højere tvetydighed. Desuden kan små bestande af andre mindre eller større oligomerer ikke blive opdaget, og modellen vil bare oplyse, hvad der er de fremherskende arter. I tilfælde af viroporins Dette er især tydeligt, fordi oligomere størrelse ændres afhængigt subtile eksperimentelle betingelser, f.eks vaskemiddel, pH, proteinkoncentration, centrifugering hastighed eller mutationer, fx i hepatitis C-virus p7 35, influenza A M2 36 eller SH protein 24.
jove_content "> De opnåede resultater for WT SH protein viser klart, at foreningen konstant pentameren reduceres ved pH 3. Disse resultater match kanalaktivitet målinger opnået med SH protein i syntetisk lipiddobbeltlag, hvor ledningsevne var markant reduceret ved pH 3 (pK ~ 4,5), mens den forblev konstant mellem pH 7 og 5 24. Baseret på disse resultater, kan det være muligt, at SH kanalaktivitet noget reguleres ved lavere pH, når til stede i native biologiske membraner. Selv i Golgi lumen pH er kun en enhed under det cytoplasmaet, intravesikulær pH falder langs endocytiske proces fra pH 6,0-6,5 i begyndelsen endosomer til pH 4,5-5,5 i slutningen endosomer og lysosomer 37. I den inficerede celle, kan pK for konduktansændringer eller pentamere stabilitet være højere end dem, der opnås in vitro heri og tidligere 24 derfor pH kunne faktisk spille en rolle i modulering af kanalaktivitet i livscyklusaf virus. Mutation af protonerbar His-rester i forbindelse med den inficerede celle er en interessant vej til fremtidige eksperimenter 38.Endelig er studiet af SH protein lettes ved tilstedeværelsen af Trp i dens sekvens lette UV-absorption målinger. Imidlertid kan viden om strukturen af oligomeren muliggøre indførelsen af Trp på ufølsomme steder, fx lipid -OR opløsningsmidler overfor dele af proteinet i membranen - eller soluble- proteiner. Alternativt kan proteinet være mærket med et synligt absorberende eller fluorescerende etiket.
Sammenfattende denne protokol beskriver anvendelsen af SE til at bestemme oligomere størrelse og associeringsaftaler konstanter en defineret viral kanal, når eksperimentelle parametre ændres. I dette tilfælde er pH blevet varieret for at undersøge virkningen på stabiliteten af Hans protonering, men mange andre hypotese kan testes, såsom virkningerne af mutationer på strukturelintegrity af disse oligomerer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate | Sigma | T0807 | |
| Deuterium oxide 99.8% | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8 | |
| An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place | Beckman Coulter | 361964 | |
| Cell housing | Beckman Coulter | 334784 | |
| 12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled | Beckman Coulter | 331376 | |
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | |
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | |
| Sapphire window | Beckman Coulter | 307177 | |
| Quartz window | Beckman Coulter | 301730 | |
| Screw-ring washer | Beckman Coulter | 362328 | |
| Screw ring | Beckman Coulter | 301922 | |
| Spinkote | Beckman Coulter | 306812 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | |
| SEDNTERP | http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page | ||
| HeteroAnalysis | http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp | ||
| SEDFIT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm |
||
| SEDPHAT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm |
References
- Laue, T. M., Stafford, W. F. 3rd Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530 (2009).
- Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
- MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge. Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-Protein Interactions - Methods for Detection and Analysis. Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).
- Alexandrov, A. A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs. Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).
- Ebel, C. Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins. Methods. 54, 56-66 (2011).
- Minton, A. P. Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction. Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).
- Dowell, S. F. Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults. J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).
- Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse. J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).
- Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein. J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).
- Jin, H. Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo. Virology. 273, 210-218 (2000).
- Karron, R. A. Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).
- Whitehead, S. S. Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees. J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).
- Rixon, H. W. The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection. J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).
- Collins, P. L., Mottet, G. Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus. J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).
- Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B. J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).
- Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene. J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).
- Gan, S. W. The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein Sci. 17, 813-820 (2008).
- Li, Y. Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment. J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).
- Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity. Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).
- Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium. Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).
- Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).
- An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , Beckman Coulter, Inc. Available from: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/techdocs?docname=LXLA-TB-003 (2005).
- Mayer, G. Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching. Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).
- Laue, T. Ch. 20.3. Current Protocols in Protein Science. 20, John Wiley & Sons, Inc. 20.23.21-20.23.13 (2001).
- Gan, S. W. The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Bevington, P. R., Robinson, D. K. Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, McGraw-Hill. New York. (1969).
- Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1. Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).
- Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins. Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).
- Montserret, R. NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus). J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).
- Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions. Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).
- Sorkin, A., von Zastrow, M. Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).
- Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).
