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Chemistry

एक छोटे oligomer के गठन झिल्ली प्रोटीन की अवसादन संतुलन: Pentameric स्थिरता पर Histidine Protonation का प्रभाव

Published: April 2, 2015 doi: 10.3791/52404
Automatic Translation
1, 1
1School of Biological Sciences, Nanyang Technological University

Abstract

विश्लेषणात्मक ultracentrifugation (नीलामी) बातचीत ताकत की एक विस्तृत श्रृंखला से अधिक है और शारीरिक शर्तों के तहत बड़े अणुओं के बीच प्रतिवर्ती बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस नीलामी मात्रात्मक stoichiometry और homo- और जैव रासायनिक प्रक्रियाओं में क्षणिक और प्रतिवर्ती हैं कि असमलैंगिक एसोसिएशन की ऊष्मा का आकलन करने के लिए विकल्प की एक विधि बनाता है। अवसादन संतुलन के साधन (एसई) में, प्रसार और अवसादन के बीच एक संतुलन एक विशिष्ट एसोसिएशन मॉडल पर निर्भर करता है कि रेडियल दूरी के एक समारोह के रूप में एक प्रोफाइल प्रदान करता है। इस के साथ साथ, एक विस्तृत एसई प्रोटोकॉल एक विश्लेषणात्मक ultracentrifuge का उपयोग कर एक छोटी सी झिल्ली प्रोटीन oligomer के आकार और मोनोमर-मोनोमर एसोसिएशन ऊर्जा निर्धारित करने के लिए वर्णित है। नीलामी-ते केवल भौतिक सिद्धांतों पर आधारित है, लेबल से मुक्त है, और दोनों पानी में घुलनशील और झिल्ली प्रोटीन पर इस्तेमाल किया जा सकता है। एक उदाहरण के उत्तरार्द्ध से दिखाया गया है, मानव श्वसन syncytial वायरस में छोटे हाइड्रोफोबिक (एसएच) प्रोटीन (hRSV), Pentameric आयन चैनल है कि रूपों एक एकल α-पेचदार ट्रांसमेम्ब्रेन (टीएम) डोमेन के साथ एक 65 एमिनो एसिड पॉलीपेप्टाइड। एनएमआर आधारित संरचनात्मक डेटा एसएच प्रोटीन चैनल के लुमेन का सामना करना पड़ उन्मुख होते हैं कि अपने ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन protonatable दो उनके अवशेषों को पता चलता है कि। एसई प्रयोगों पीएच एसोसिएशन निरंतर और एसएच प्रोटीन की oligomeric आकार को प्रभावित करता है कि कैसे निर्धारित करने के लिए डिजाइन किया गया है। Pentameric फार्म सभी मामलों में संरक्षित किया गया था, वहीं अपने सहयोग निरंतर कम पीएच पर कम हो गया था। इन आंकड़ों एसएच प्रोटीन में दो उनके अवशेषों की एक lumenal उन्मुखीकरण के साथ संगत एसएच चैनल गतिविधि के लिए मनाया एक समान पीएच निर्भरता, साथ समझौते में हैं। उत्तरार्द्ध कम पीएच पर इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण और कम oligomer स्थिरता अनुभव हो सकता है। शारीरिक स्थितियों में सूक्ष्म प्रोटीन, प्रोटीन एसोसिएशन परिवर्तन पर मात्रात्मक जानकारी मापा जा करने के लिए है, जब भी सारांश में, इस पद्धति लागू है।

Introduction

विश्लेषणात्मक ultracentrifugation 1-5, शारीरिक शर्तों के तहत बड़े अणुओं की बातचीत का अध्ययन कमजोर और मजबूत बातचीत दोनों के लिए सुलभ होने के लिए सबसे महत्वपूर्ण तरीकों में से एक है। विधि लेबल से मुक्त है और प्रकाश अवशोषण या हस्तक्षेप का उपयोग करता है, और यहां तक कि प्रतिदीप्ति ऑप्टिकल प्रणाली परिमाण 6 के कई आदेशों से अधिक एकाग्रता पर्वतमाला का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

सबसे जैव रासायनिक प्रक्रियाओं प्रतिवर्ती बातचीत पर निर्भर करती है, क्योंकि इस पद्धति का विशेष रूप से उपयोगी है। इन मुलाकातों के stoichiometry और ताकत मात्रात्मक जैविक प्रक्रियाओं को समझने की विशेषता किया जाना है, और तरीकों की एक संख्या में इस उद्देश्य के 7, 8 के लिए मौजूद हैं। हालांकि, क्षणिक बातचीत 9 अध्ययन करने के लिए मुश्किल हैं।

macromolecular बातचीत चिह्नित करने के लिए एक विधि के चुनाव को अपनी स्थिर या गतिशील प्रकृति पर निर्भर करता है। पहले मामले में, sedim entation वेग (एसवी) रेडियल परिवहन की दर को मापा जाता है और परिसरों प्रसन्नचित्त द्रव्यमान और आकार में अंतर के आधार पर fractionated कर रहे हैं, प्रयोग किया जाता है।

इसके विपरीत, प्रयोग के समय के पैमाने पर प्रतिवर्ती हैं कि गतिशील संघों शारीरिक रूप से अलग नहीं किया जा सकता है। इस मामले में, स्वयं या गैर सहसंयोजक बातचीत के लिए अग्रणी असमलैंगिक बातचीत कुल प्रोटीन एकाग्रता पर निर्भर करता है कि एक संतुलन में हैं। ये गतिशील बातचीत अवसादन संतुलन (एसई) और अवसादन वेग (एसवी) 10 दोनों द्वारा अध्ययन किया जा सकता है। हालांकि, पहली विधि के प्रदर्शन करने के लिए सरल है और यहाँ वर्णित है। एक संतुलन प्रसार और अवसादन के बीच तक पहुँच जाता है इतना है कि असल में, centrifugation के एक पर्याप्त रूप से कम गति से किया जाता है। इस बिंदु पर, रेडियल दूरी के एक समारोह के रूप में एक ऑप्टिकल संकेत (यूवी तुलना) का संतुलन प्रोफाइल, संघों 11 के लिए पूर्व निर्धारित thermodynamic के मॉडल का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है।

ve_content "> वर्तमान पत्र में, एक अवसादन संतुलन अध्ययन की वजह से अपनी hydrophobicity की। आयन चैनल है कि रूपों एक वायरल झिल्ली प्रोटीन की स्वयं संघ के समक्ष प्रस्तुत किया है, प्रयोग डिटर्जेंट की मौजूदगी में चलाने के लिए, और इस मामले में घनत्व की है विलायक डिटर्जेंट की है कि करने के लिए मिलान किया जाना है। हालांकि, प्रोटोकॉल कोई विलायक घनत्व मिलान की आवश्यकता होगी, सिवाय इसके कि एक पानी में घुलनशील प्रोटीन के मामले में होगा समान वर्णित है।

इस्तेमाल किया प्रोटीन मानव श्वसन syncytial वायरस (hRSV), कम श्वसन तंत्र शिशुओं में रोग, बुजुर्ग और प्रतिरक्षा अक्षमता आबादी दुनिया भर में 12 का कारण बनता है कि paramyxoviridae परिवार में एक छा pneumovirus में इनकोडिंग है। HRSV संक्रमण के ऊपर से 64 लाख मामलों की रिपोर्ट और 160,000 से होने वाली मौतों के लिए हर साल होते हैं।

hRSV जीनोम तीन झिल्ली प्रोटीन एफ, जी, और छोटे हाइड्रोफोबिक (एसएच) सहित 11 प्रोटीन, transcribes। एसएच प्रोटीन शामिल हैआरएसवी संक्रमण के रोगजनन में। एसएच जीन (RSVΔSH) की कमी आरएसवी, व्यवहार्य था syncytia के गठन के कारण होता है और जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) वायरस 13-16 के रूप में भी वृद्धि हुई। हालांकि, RSVΔSH वायरस ऊपरी श्वास पथ 15, 16 में गुम्मट से भी कम कुशलता से 10 गुना दोहराया। इसके अलावा, RSVΔSH वायरस विवो माउस और चिंपांज़ी मॉडल 13, 17 में में तनु था।

एसएच प्रोटीन एक 64 (आरएसवी उपसमूह ए) या ​​65 (आरएसवी उपसमूह बी) अमीनो एसिड लंबे प्रकार गोल्गी कम्पार्टमेंट 18 की झिल्लियों पर ज्यादातर जम जाता है कि द्वितीय अभिन्न झिल्ली प्रोटीन होता है। एसएच प्रोटीन एक भी अत्यधिक 20,21 संरक्षित है, जो एक-पेचदार ट्रांसमेम्ब्रेन (टीएम) डोमेन 19 की भविष्यवाणी की है। सी और एन टर्मिनल extramembrane डोमेन के lumenally / extracellularly और cytoplasmically, क्रमशः उन्मुख होते हैं।

दोनों सिंथेटिक टीएम डोमेन (अवशेषों 18-43) और पूरी लंबाई एसएच प्रोटीन डिटर्जेंट की एक किस्म में homopentamers फार्म करने के लिए दिखाया गया है। homopentameric फार्म तलीय लिपिड bilayers 22,23 में चैनल गतिविधि के लिए जिम्मेदार है। लिपिड bilayer में टीएम monomers के सही ओरिएंटेशन पहले उनकी -22, एक lumenal में होना करीब अभिविन्यास, इंटर-पेचदार करने के लिए जो दिखाया साइट विशिष्ट अवरक्त Dichroism 23 का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। एक ही टीएम डोमेन अभिविन्यास (डीपीसी) dodecylphosphocholine में pentameric पूर्ण लंबाई प्रोटीन का एक-पेचदार बंडल खंगाला 22 micelles कि एनएमआर अध्ययन से इसकी पुष्टि की गई थी। इस 'मिसेल' मॉडल में, एक भी एक- पेचदार टीएम डोमेन एक विस्तारित बी-बाल के लिये कांटा द्वारा सी-टर्मिनली एक एक-हेलिक्स द्वारा एन टर्मिनली flanked, और किया गया था। एसएच प्रोटीन के दो protonatable अवशेष, उनकी -22 और उनका-51, टीएम डोमेन (lumenally उन्मुख) में स्थित हैं, और extramembrane सी टर्मिनल β बाल के लिये कांटा की नोक पर क्रमश: (दूर चैनल ताकना से)। एक bicellar enviro मेंnment, तथापि, टीएम α-हेलिक्स उनका-51 तक फैली है, और अपने दोनों अवशेषों चैनल 24 के लुमेन के लिए पहुंच रहे हैं। 22 हाइड्रोफोबिक पक्ष श्रृंखला (इले-32, इले-36, इले-40 और लियू-44), और साथ तैयार है चैनल संरचना एक कीप की तरह वास्तुकला 22, जहां संकरा क्षेत्र को गोद ले (Cys-45 सर्विसेज-29 के लिए) इले-36 चैनल लुमेन में सबसेसंकरेमें बिंदु को परिभाषित करता है। उनका-51 छोटी से छोटी खोलने की नोक पर है जबकि उनकी -22, यह कीप का सबसे बड़ा उद्घाटन के अवसर पर स्थित है।

वर्तमान में कागज, एक अवसादन संतुलन मोड में विश्लेषणात्मक centrifugation के उनके protonation एसएच प्रोटीन pentamer की स्थिरता को प्रभावित करता है, तो यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस मामले में, एसएच प्रोटीन कि एसएच प्रोटीन रूपों pentameric oligomers 22 को दिखाने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया है जो C14-betaine डिटर्जेंट, में solubilized गया था।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल अधिक जानकारी और विशेष विचार 3, 25-28 के लिए भेजा जा करने के लिए कर रहे हैं, जो निम्न संसाधनों पर आधारित है।

2 एच 2 ओ के साथ डिटर्जेंट मिसेलस 1. घनत्व मिलान

नोट: बफर समाधान के घनत्व डिटर्जेंट मिसेलस के घनत्व के लिए मिलान किया जाना चाहिए। आम घनत्व समायोजन एजेंटों 2 एच 2 हे, एच 2 18 हे, 2 एच 2 18 हे, ग्लिसरॉल और सुक्रोज 29 में शामिल हैं। एच 2 18 2 हे एच 2 ओ के रूप में ही घनत्व है और प्रोटीन में विनिमेय प्रोटॉनों की deuteration वांछित नहीं है, तो एक बेहतर विकल्प हो सकता है। इस प्रक्रिया में, 50 मिमी Tris पीएच 7.3 में 3- (एन, एन dimethylmyristylammonio) -propanesulfonate (C14SB) डिटर्जेंट का घनत्व, 100 मिमी NaCl 2 एच 2 ओ के साथ मिलान किया जाएगा का एक प्रारंभिक अनुमान के रूप में निम्नलिखित सांद्रता2 एच 2 ओ का प्रयोग किया जाएगा: 10, 30, और 50% वी / वी।

1 1। नमूना तैयार करना

  1. निम्नलिखित स्टॉक समाधान और फिल्टर एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से बाँझ तैयार: 50 एमएल 500 मिमी Tris पीएच 7.3 और 1 एम NaCl (10X बफर समाधान); 1 एमएल 250 मिमी C14SB (50X डिटर्जेंट समाधान)।
  2. 20 μl 10X बफर समाधान, 4 μl 50X डिटर्जेंट समाधान, 20 μl 2 एच 2 ओ (99.9%), और 156 μl मिश्रण से नमूना समाधान के 200 μl तैयार करें एच 2 ओ विआयनीकृत 20 μl 2 एच 2 ओ (99.9%), और 160 μl, 20 μl 10X बफर समाधान के मिश्रण से संदर्भ समाधान के भी 200 μl तैयार करें एच 2 ओ विआयनीकृत
  3. अन्य 2 एच 2 ओ सांद्रता के लिए दोहराएँ चरण 1.1.2, उचित 2 एच 2 हे और एच 2 हे मात्रा का समायोजन, 30% और 50% अर्थात।

1.2। 6-चैनल एक की सभाकोशिकाओं में यूसी कोशिकाओं और नमूना लोड हो रहा है।

नोट: नमूना लोड हो रहा पद्धति के आधार पर नीलामी सेल के दो प्रकार के होते हैं। कोशिकाओं सील कर रहे हैं के बाद कोशिकाओं को लोड किया जा सकता बाहरी भरने जबकि बाहरी भरने के बिना सेल, सेल सील करने से पहले लोड करने के लिए किया गया है। एक बाहरी भरने नीलामी सेल की सभा में पहले तीन वर्णित किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, बाहरी भरने के बिना एक 6 चैनल नीलामी सेल की विधानसभा में वर्णित है। मुख्य अंतर यह अलग से कड़ा किए जाने की जरूरत है, जो दोनों पक्षों पर पेंच के छल्ले है कि है, और यह (छवि। 1) आवास प्लग की जरूरत नहीं है। विधानसभा चरणों में अंतर के नीचे डाला जाता है।

चित्र 1
चित्रा 1. बाहरी भरने के बिना एक 6 चैनल नीलामी सेल के मद्देनजर विस्फोट हो गया। यह आंकड़ा Beckman कल्टर एक-50 तिवारी से संशोधित और एक-60 तिवारी Analyti किया गया हैसीएएल रोटर, कोशिकाओं, और counterbalance उपयोगकर्ता पुस्तिका।

  1. नीलमणि खिड़की के बजाय क्वार्ट्ज खिड़की (छवि। 2) के साथ प्रत्येक नीलामी सेल के लिए दो खिड़की विधानसभाओं तैयार करें। खिड़की धारक में खिड़की गैसकेट रखें। थोड़ा खिड़की लाइनर मोड़ और खाई खिड़की धारक Keyway के विपरीत बनाई है कि इस तरह की खिड़की धारक में जगह। खिड़की धारक Keyway के साथ निशान aligning, खिड़की लाइनर अंदर नीलमणि खिड़की रखें।
    । नोट: इस तरह के घनत्व मिलान प्रयोग के रूप में 30,000 आरपीएम से ऊपर हस्तक्षेप माप, इसलिए उच्च गति 28, 30 पर और अधिक प्रकाश के अपवर्तन का उत्पादन होगा, इस प्रकार क्वार्ट्ज खिड़की दबाने और, नीलम खिड़कियों किया जाता है। एक नीलमणि खिड़की क्वार्ट्ज खिड़की से भारी है और अपने पक्ष पर etched एक "एक्स" है।

चित्र 2
चित्रा 2. विस्फोट को देखने ओएफ खिड़की विधानसभा। यह आंकड़ा Beckman कल्टर एक-50 तिवारी और एक-60 तिवारी विश्लेषणात्मक रोटर, कोशिकाओं, और counterbalance उपयोगकर्ता पुस्तिका से संशोधित किया गया है

  1. भाग संख्या ऊपर से नीचे के साथ सेल आवास रखें। आवास कुंजी के साथ गठबंधन keyways के साथ, (बाएं, अंजीर। 1) नीचे का सामना करना पड़ खिड़की के साथ एक खिड़की विधानसभा द्वारा पीछा किया, सबसे पहले सेल आवास नीचे beveled पक्ष के साथ एक 6 क्षेत्र centerpiece में स्लाइड।
  2. हल्के कोट spinkote साथ पेंच अंगूठी धागे और पेंच अंगूठी वॉशर। खिड़की विधानसभा के शीर्ष पर एक पेंच अंगूठी वॉशर रखें। बाहर का सामना करना पड़ शब्द "बाहर" के साथ खिड़की के आवास में पेंच अंगूठी को स्थापित करें। सेल aligning उपकरण का उपयोग करके पेंच अंगूठी हाथ से कस लें।
  3. टोक़ रिंच का उपयोग, केवल 60 इंच पाउंड करने के लिए पेंच अंगूठी कस लें।
  4. भाग संख्या ईमानदार और 12-दोपहर में तैनात साथ सेल रखें। एलबाएं पंक्तियों में oad 120 μl संदर्भ और सही पंक्तियों में 110 μl नमूना। प्रत्येक नमूने और संदर्भ को सही ढंग से रखा जाता है कि सुनिश्चित करें।
    नोट: सटीक नमूना मात्रा महत्वपूर्ण नहीं है, लेकिन नमूना meniscus के अलग हो जाएगा तो यह है कि संदर्भ नमूना (5-10 μl) की तुलना में थोड़ा अधिक मात्रा की जरूरत है।
  5. ध्यान से खिड़की (छवि। एक, दाएं) नीचे का सामना करना पड़ के साथ सेल के आवास एक खिड़की विधानसभा में स्लाइड। जरूरत से ज्यादा सेल को परेशान और सामग्री गिर करने के लिए नहीं ख्याल रखना।
  6. दोहराएँ कदम 1.2। 3 और 1.2। 4, 120 इंच पाउंड करने के लिए दूसरा पेंच अंगूठी कस। सेल पलटना और 120 इंच पाउंड के लिए पहला पेंच अंगूठी फिर से कस लें।
  7. रोटर में कोशिकाओं लोड अपकेंद्रित्र में रोटर स्थापित करने और निर्माता के निर्देशों 28 के अनुसार monochromator स्थापित करें।
    नोट: इस सेंट पर विवरणईपी भी इस संदर्भ तीन में पाया जा सकता है।

1.3। हस्तक्षेप माप की स्थापना

  1. संक्षेप में निम्नलिखित कदम में संक्षेप किया जाएगा, जो निर्माता के निर्देशों के अनुसार, नीलामी साधन के लिए यूजर इंटरफेस सॉफ्टवेयर स्टार्ट अप और 3000 rpm पर प्रत्येक कक्ष के लिए लेजर सेटअप और रेडियल अंशांकन प्रदर्शन करते हैं।
  2. पर्याप्त वैक्यूम बाद 1.3.1.1 (<100 माइक्रोन), 3000 rpm पर अपकेंद्रित्र चलाने पर पहुंच गया है। यूजर इंटरफेस सॉफ्टवेयर में हस्तक्षेप पैटर्न का पूर्वावलोकन और उच्चतम विपरीत प्राप्त करने के लिए लेजर मापदंडों को समायोजित।
  3. "संतुलन" और "हस्तक्षेप" माप को निर्दिष्ट | (नई फ़ाइल) एक नया सेट अप फ़ाइल बनाएँ। एक अवसादन संतुलन विधि ("विधि" बटन) 20 डिग्री सेल्सियस पर रन तापमान के साथ, 45,000 आरपीएम या जो भी अधिक हो प्रोटीन के नमूने के लिए प्रत्याशित उच्चतम गति, कम से चलाने के लिए और एक स्कैन इकट्ठा करने के लिए हर 15 मिनट में सेट करें। MonitoHeteroAnalysis में डेटा फ़ाइलों को खोलने और कम से कम 12 घंटे के बाद "मैच" समारोह का चयन करके आर संतुलन प्रगति (लगभग रातोंरात छवि। 3)।
    नोट: एक समान कार्य भी SEDFIT (विकल्प | लोड हो रहा है विकल्प | संतुलन को टेस्ट दृष्टिकोण) में उपलब्ध है।

चित्र तीन
चित्रा HeteroAnalysis मैच समारोह से 3. परिणाम। मिलान समारोह लगातार स्कैन और आखिरी स्कैन के बीच RMSD की तुलना द्वारा संतुलन प्रगति पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक्स अक्ष के उपगामी RMSD मूल्यों से संकेत के रूप में इस उदाहरण 8 घण्टे के बाद संतुलन की प्राप्ति से पता चलता है।

1.4। डेटा विश्लेषण

  1. नमूने के प्रत्येक सेट के लिए, 2 एच 2 ओ एकाग्रता के खिलाफ रेडियल वितरण प्रोफाइल की ढलान साजिश है।
    नोट: वितरण एक बहुत उथले घातीय कि एपी हो जाएगाproaches रैखिकता। X- अक्ष अवरोधन मिलान 2 एच 2 ओ एकाग्रता से मेल खाती है।
  2. अधिक सटीक परिणाम के लिए, कई प्रतिकृति में प्रयोग करते हैं। वैकल्पिक रूप से, 2 एच 2 ओ एकाग्रता का एक संकरा रेंज के साथ प्रयोग को दोहराने।

C14SB मिसेलस में एसएच 2. अवसादन संतुलन

2.1। भागो मापदंडों

  1. SEDNTERP का उपयोग करके बफर घनत्व और चिपचिपापन, प्रोटीन आंशिक विशिष्ट मात्रा और centrifugation गति की गणना। डी 2 हे एकाग्रता सहित, 'बफर डेटा का चयन "खंड में बफर घनत्व और चिपचिपापन, का चयन कंप्यूट की गणना और तदनुसार बफर घटकों दर्ज करें।
  2. 2.1.1.1 "वी-बार" खंड में प्रोटीन आंशिक विशिष्ट मात्रा, का चयन कंप्यूट की गणना और प्रोटीन अमीनो एसिड अनुक्रम में प्रवेश करने के लिए। ": एन = इस मोनोमर से एक oligomer बनाओ" में सबसे ज्यादा होने की उम्मीद है oligomeric आकार निर्दिष्ट करेंक्षेत्र, इस मामले में एन = 5. मुख्य विंडो पर आरपीएम क्षेत्र में मान दर्ज करके गति की गणना तक σ ≈ 1; इस रेडियल वितरण प्रोफाइल 25 का एक अच्छा घातीय आकार सुनिश्चित करने के लिए अंगूठे का एक नियम है।
    नोट: इस प्रकार के रूप में इस प्रयोग के लिए मूल्यों की गणना था: ρ = 1.03839 ग्राम / मिलीलीटर, η = 1.0267 सी.पी. = 0.7569 मिलीग्राम / जी, ω 1 = 16000 RPM।
  3. एक गति और अगले 25 पर वितरण प्रोफाइल के बीच पर्याप्त अंतर यह सुनिश्चित करने के लिए का पालन करने के बाद गति की गणना।
    नोट: यह भी समारोह से किया जा सकता है, खाते में समाधान कॉलम (भरने मात्रा) लेता है जो SEDFIT में, "संतुलन रोटर समारोह गति का अनुमान है।"

2.2। नमूना तैयारी

  1. 5 मिमी C14SB साथ 1 मिलीलीटर संदर्भ समाधान और 32.3% 2 एच को तैयार 2 हे 100 μl 10X बफर solutio के मिश्रण से घनत्व मिलान प्रयोग (खंड 1), से निर्धारितएन (कदम 1.1.1), 20 μl 50X डिटर्जेंट समाधान (कदम 1.1.1), 323 μl 2 एच 2 ओ (99.9%) और 527 μl एच 2 ओ विआयनीकृत
  2. ऐसे मेथनॉल या 50% वी / वी जलीय acetonitrile के रूप में उपयुक्त विलायक में lyophilized, एचपीएलसी शुद्ध एसएच पेप्टाइड्स (पहले 31 में वर्णित अभिव्यक्ति और शुद्धि) भंग। प्रत्येक के लिए पतला जब एक 280 देने के लिए तीन नमूने लिए एक microlitre पैमाने पर यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और विभाज्य में भंग पेप्टाइड्स के A280 उपाय, 12mm = 0.3, 0.5, और 0.8 (ए 280, 10mm = 0.25, 0.417, और 0.67) 130 μl। रातोंरात नमूने Lyophilize और resuspend 130 μl संदर्भ समाधान (कदम 2.2.1) में नमूना समाधान देने के लिए।
    नोट: यह टीआरपी और Tyr अवशेषों क्योंकि इसमें एसएच प्रोटीन 280 एनएम पर यूवी / विज़ absorbance के से पता लगाया जा सकता है। खुशबूदार अवशेषों के बिना प्रोटीन, या हस्तक्षेप का उपयोग करके, एक उपयुक्त क्रोमोफोर के साथ उन्हें टैगिंग टीआरपी युक्त उत्परिवर्ती का उपयोग करके पता लगाया जा सकता हैबजाय absorbance के के nce के माप।
  3. क्वार्ट्ज खिड़कियों के साथ एक 6 चैनल नीलामी सेल इकट्ठा करने के लिए खंड 1.2 में दिए चरणों का पालन करें। निकटतम रोटर केंद्र से रोटर केन्द्र और सबसे कम एकाग्रता नमूना (ए 280, 12mm = 0.3) से दूर करने के लिए (ए 280, 12mm = 0.8) चैनल में सर्वोच्च एकाग्रता नमूना लोड।

2.3। Absorbance के माप की स्थापना

  1. "संतुलन" और "Absorbance" माप को निर्दिष्ट | (नई फ़ाइल) एक नया सेट अप फ़ाइल बनाएँ। डिटेक्टर तरंगदैर्ध्य के रूप में 280 एनएम निर्दिष्ट करें।
  2. एक भी स्कैन रेडियल कदम आकार = 0.01 सेमी, प्रतिकृति = 3 (कम संकल्प, उपवास) के साथ उदाहरण के लिए, कम से प्रस्ताव पर डेटा संग्रह को निर्दिष्ट, स्कैन विकल्प में "पहले स्कैन करने से पहले रेडियल अंशांकन" जाँच कर रहा है, और निष्पादित द्वारा 3000 rpm पर रेडियल अंशांकन प्रदर्शन । स्कैन पूरा हो जाने के बाद, विकल्प अचयनित।
  3. "(Metho एक अवसादन संतुलन विधि सेट करें"बटन) डी 20 डिग्री सेल्सियस, कदम 2.1.3 में गणना की पहली गति से चलाने के लिए, और एक स्कैन हर 30 मिनट लेने के लिए। प्रत्येक 'कोशिकाओं "विस्तार" में कदम 2.3.2 में के रूप में कम के प्रस्ताव पर डेटा संग्रह निर्दिष्ट करें। कम से कम 18 घंटे के बाद "मैच" समारोह HeteroAnalysis में डेटा फ़ाइलों को खोलने और चयन करके संतुलन प्रगति की निगरानी (लगभग रातोंरात, अंजीर। 4)।
    नोट: बाद में गति कम समय लगेगा, जबकि संतुलन की प्राप्ति, पहले गति के लिए काफी लंबा समय लग सकता है।

चित्रा 4
HeteroAnalysis मैच समारोह से चित्रा 4. परिणाम। पहली और दूसरी गति (ऊपर बाएं और दाएं) संतुलन पर पहुंच गया है दिखाई देते हैं, लेकिन यह सुनिश्चित किया जा करने के लिए कुछ अधिक घंटे इंतजार करने के लिए बेहतर है। इसकी तुलना में, तीसरे और चौथे गति (नीचे बाएँ और दाएँ) स्पष्ट रूप से संतुलन पर पहुँच गए हैंएक कम समय में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. संतुलन पर पहुंच गया है, रेडियल कदम आकार = 0.001 सेमी, प्रतिकृति = 10 (उच्च संकल्प, धीमी गति) के साथ उच्च संकल्प, उदा में एक भी स्कैन इकट्ठा।
  2. स्कैन पूरा हो गया है के बाद, अगले गति के लिए कदम 2.3.3 और 2.3.4 दोहराएँ।
  3. समय प्रत्येक गति के लिए संतुलन में जाना जाता है (गणना या अनुभव से) है तक पहुँचने के लिए जरूरत पड़ने पर वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक के लिए संतुलन समय के बाद एक स्कैन इकट्ठा करने के लिए कदम और 2.1.3 में गणना की सभी गति शामिल करने के लिए अवसादन संतुलन विधि स्कैन की स्थापना रफ्तार। इस मामले में, प्रत्येक कोशिकाओं '' विस्तार 'में उच्च संकल्प डेटा संग्रह निर्दिष्ट करें।

2.4। SEDFIT और SEDPHAT में डेटा विश्लेषण

नोट: अधिक जानकारी और डेटा विश्लेषण रीडर में विचार के लिए T संदर्भित किया जाता हैwww.analyticalultracentrifugation.com: निम्न वेबसाइट हे।

  1. ओपन उच्च संकल्प SEDFIT में स्कैन (डाटा | भार अवसादन संतुलन डेटा) और तीन चैनलों (; | लोड हो रहा है विकल्प | 3 सबसेट में 6 चैनल कच्चे डेटा को बचाने के विकल्प ये अलग प्रत्येक नमूने के लिए सांद्रता के अनुरूप) में डेटा विभाजित।
  2. पुन: खुला SEDFIT में ही नमूना है और एक ही एकाग्रता लेकिन अलग गति के हैं कि डेटा फ़ाइलों। Meniscus (ऊर्ध्वाधर लाल रेखा), सेल नीचे (ऊर्ध्वाधर नीली रेखा) और फिटिंग सीमा (ऊर्ध्वाधर हरे रंग की लाइनों) समायोजित करें, और SEDPHAT में उपयोग के लिए डेटा निर्यात (डाटा | SEDPHAT निर्यात करने के लिए डाटा)। इनपुट के रूप में अनुरोध रोटर प्रकार और केंद्र में प्रकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, कदम 2.1.1 में गणना पैरामीटर। हर नमूना और एकाग्रता के लिए इस चरण को दोहराएँ।
  3. SEDPHAT में ही नमूना से सभी डेटा (सभी सांद्रता और गति) को खोलें और प्रयोग पैरामीटर में भरने; एक उदाहरण चित्र दिखाया गया है। 5।
    नोट: डी 2 हे बफर, Deut में जोड़ा जाता है जब विनिमेय प्रोटॉनों की eration काफी विशेष रूप से पानी में घुलनशील प्रोटीन के लिए प्रोटीन की आणविक वजन को बदल सकता है। झिल्ली एम्बेडेड क्षेत्रों एक्सचेंज से संरक्षित कर रहे हैं क्योंकि झिल्ली प्रोटीन, एसएच प्रोटीन की तरह विशेष रूप से छोटे हैं, कम प्रभावित कर रहे हैं। यह सही करने के लिए, इनपुट 'डी मोल अंश बफर "।
    नोट: इस चरण में यह मेनू डेटा का चयन करके अलग से संपादित डाटासेट को बचाने के लिए सिफारिश की है | नया विन्यास रूप में की प्रतिलिपि सभी डेटा और सहेजें।
  4. एक मॉडल का चयन और उस मॉडल के लिए वैश्विक मानकों में भरें।
    नोट: एक उदाहरण के रूप में, "Monomer-एन-मेर स्वयं संघ" मॉडल और उसके मापदंडों छवि में दिखाया जाता है। 6।

चित्रा 5
चित्रा 5. प्रयोगात्मक मापदंडों में भरने के लिए कैसे पर एक उदाहरण।

फ़ाइलें / ftp_upload / 52,404 / 52404fig6.jpg "/>
चित्रा 6 Monomer-एन-मेर स्वयं संघ मॉडल के लिए वैश्विक मानकों में भरने के लिए कैसे पर एक उदाहरण।

  1. मेनू फ़िट का चयन करके एक वैश्विक फ़िट भागो | ग्लोबल फ़िट और फिट converges जब तक प्रतीक्षा करें। नीचे नोट (या के एक स्क्रीनशॉट लेने के लिए) फिटिंग परिणाम है, विशेष रूप से वैश्विक कम ची-वर्ग और कश्मीर एक मूल्यों लॉग ऑन करें। Thermodynamic जानकारी प्रदर्शित | ऐसे फिट डेटा और मेनू कॉपी और प्रदर्शन से ढाले बच के रूप में अन्य डेटा निकालें।
  2. वैश्विक मानकों पर लौटें और (1) मोनोमर आणविक वजन फिट और कदम 2.4.5 दोहराने के लिए एम की जाँच करें। सज्जित आणविक वजन और वैश्विक कम ची-वर्ग के नीचे ध्यान दें।
  3. दोहराएँ चरण 2.4.3 प्रत्येक मॉडल का परीक्षण किया जा करने के लिए 2.4.6 और कम वैश्विक ची-वर्ग मान के रूप में अच्छी तरह से ढाले बच तुलना द्वारा प्रत्येक मॉडल के फिट गुणवत्ता की तुलना करने के लिए।
    नोट: लघु और यादृच्छिक फिटिंग बच आम तौर पर एक अच्छा फिट इंगित करता है, और सबसे अच्छा फिट बैठता है कि मॉडलछोटी से छोटी वैश्विक कम ची-वर्ग है। सज्जित मोनोमर आणविक वजन और उसके ची-वर्ग मूल्य तय (सैद्धांतिक) आणविक भार के उस से काफी अलग नहीं किया जाना चाहिए।
  4. पहले चयन सांख्यिकी द्वारा मूल्य द्वारा प्राप्त प्रवेश का लिए आत्मविश्वास अंतराल की गणना | गंभीर त्रुटि सतह के अनुमानों के लिए ची-वर्ग और इच्छित विश्वास अंतराल inputting। प्रवेश का लिए ची-वर्ग मूल्यों को प्राप्त करने के लिए वैश्विक मानकों संवाद में का प्रवेश करें, एक-आयामी त्रुटि सतह प्रक्षेपण उत्पन्न और न चुनें | अगला, सांख्यिकी के पास जाओ।
    नोट: पाठकों को इस विधि 33 की विधि 32 के साथ ही चित्रण के बारे में अधिक जानकारी के लिए निम्नलिखित स्रोतों (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ sedphat / statistics.htm) से परामर्श करने की सलाह दी जाती है।

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Representative Results

50 मिमी Tris में C14SB डिटर्जेंट मिसेलस के रेडियल वितरण प्रोफाइल, 100 मिमी NaCl पीएच 7.3 रूपों एक रेखीय मॉडल (चित्रा 7A) के लिए फिट किया जा सकता है कि एक बहुत उथले घातीय। इस वितरण की ढलान व्युत्क्रमानुपाती डी 2 हे एकाग्रता (चित्रा 7B) के लिए सहसंबद्ध है। ढलान शून्य है, इस मुद्दे पर जहां, मिलान डी 2 हे एकाग्रता, 32.3% हो पाया था यानी।

नीचे आंकड़ा 7 देखें।

एक ही प्रयोग अलग buffers के लिए दोहराया गया था: 50 मिमी सोडियम फास्फेट, 5.5 100 मिमी NaCl पीएच और 50 मिमी फॉस्फेट साइट्रेट, 100 मिमी NaCl पीएच 3 क्रमशः, डी 30.3% और 41.0% की 2 हे सांद्रता मिलान प्राप्त करने के लिए।

डिटर्जेंट में एसएच जंगली प्रकार (WT) के नमूने 15,000, 19,000, 23,000, 28,000, 34,000 और 42,000 rpm पर centrifugation द्वारा पीछा किया, पीएच 3, 5.5 और 7.3 (कुल छह नमूने) से अवगत कराया गया। डीअता कम गति मज़बूती से सज्जित किया जा सका, पर संतुलन प्राप्त कर ली नहीं किया गया था, शायद क्योंकि इसलिए चार उच्च गति से प्राप्त आंकड़ों का इस्तेमाल किया गया प्राप्त की। पीएच 7.3 से कम, एसएच गुम्मट स्पष्ट प्रवेश कश्मीर एक = 21.35 (तालिका 2) के साथ pentamers (8 चित्रा और तालिका 1) के रूप में पाया गया था। एसोसिएशन लगातार 5.5 पीएच में बदलाव नहीं किया है, लेकिन यह काफी पीएच यह 4.5 के पी के साथ, कम पीएच पर प्रवाहकत्त्व की कमी की सूचना दी जो पिछली रिपोर्टों 24, के साथ संगत है 3. में कम हो गया था।

नीचे आंकड़ा 8 देखें।

नीचे दी गई तालिका 1 देखें।

चित्रा 7
डी 2 ओ के साथ C14SB चित्रा 7. घनत्व मिलान (ए) रेडियल distributioएन 50 मिमी Tris में C14SB डिटर्जेंट मिसेलस द्वारा गठित, 100 मिमी NaCl पीएच 7.3 25, 30, और 35% डी 2 के साथ ओ प्रोफ़ाइल डेटा को अलग से। एक रेखीय मॉडल (काला) के लिए फिट (बी) ढलानों डी 2 हे एकाग्रता (काले वर्गों) के खिलाफ साजिश रची गई और एक रेखीय मॉडल (लाल रेखा) को लगाया गया था। मिलान डी 2 हे एकाग्रता (लाल तीर) संकेत दिया है।

आंकड़ा 8
C14SB में एसएच की फिटिंग 8 चित्रा पीएच पर C14SB में। 7 (खुला हलकों) एसएच के रेडियल वितरण प्रोफाइल मॉडल-pentamer monomer को मोनोमर-pentamer स्वयं संघ मॉडल (काले ठोस लाइन) के लिए सबसे अच्छा फिट पाया गया। फिटिंग अवशिष्ट नीचे दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मॉडल (एन-मेर) ची-वर्ग (मेगावाट फिक्स्ड) ची-वर्ग (सज्जित मेगावाट) फिट मेगावाट
3 15.444 1.0492 13,477 दा
4 3.8094 1.0469 9889 दा
5 1.0499 1.0497 7822 दा
6 2.5994 1.547 6504 दा
7 6.1667 1.2112 5743 दा

अलग मोनोमर-एन-मेर मॉडलों की वैश्विक कम ची-वर्ग मूल्यों की तालिका 1 तुलना।

पीएच ऊपरी सीमा (163;) प्रवेश का ऊपरी सीमा (1σ)
3 17.432 17.576 17.737
5.5 20.064 20.419 20.839
7.3 20.687 21.052 21.492

स्पष्ट तालिका 2 तुलना विभिन्न पीएच पर कश्मीर एक मूल्यों लॉग ऑन करें।

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Discussion

इस पत्र नमूना तैयार करने और संतुलन अवसादन का उपयोग कर डिटर्जेंट में एक छोटी सी झिल्ली प्रोटीन की oligomerization के विश्लेषण के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदान करता है। घनत्व मिलान चरण आवश्यक नहीं है के रूप में वर्णित प्रोटोकॉल, समान रूप से मान्य -और घुलनशील प्रोटीन के लिए simpler- है। दरअसल, सिस्टम डिटर्जेंट और प्रोटीन का एक मिश्रण द्वारा गठित की है। यह कण तैरने की क्रिया के लिए योगदान नहीं करता है, ताकि अवसादन अध्ययन का संचालन करने के लिए, डिटर्जेंट गुरुत्वाकर्षण क्षेत्र के लिए अदृश्य होना चाहिए। इस प्रकार, डिटर्जेंट का घनत्व ध्यान से इस्तेमाल डिटर्जेंट, बहुत घना है अगर उदा।, एसडीएस, नहीं भी 100% डी 2 हे यह मेल कर सकते हैं कि सीमा के साथ, बफर करने के लिए डी ओ 2 के अलावा द्वारा मिलान किया गया है। एक पानी में घुलनशील प्रोटीन के साथ काम कर रहा है जब नमूना डिटर्जेंट जरूरत नहीं है क्योंकि घनत्व मिलान कदम है, जरूरी नहीं है।

हमारे आवेदन, आयन chann कि रूपों एक छोटे से वायरल प्रोटीन मेंएल्स इस्तेमाल किया गया है। सभी viroporins तरह, एसएच प्रोटीन एक α-पेचदार ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन है, और इसलिए इसके मूल oligomeric आकार को बाधित नहीं होगा कि एक साबुन में अध्ययन किया जाना है।

इन अध्ययनों से पहले, इसलिए, उपयुक्त डिटर्जेंट जांच की जानी है। उदाहरण के लिए, पिछले एसई में एसएच प्रोटीन डीपीसी, C8E5 और C14-betaine में pentameric oligomers का गठन किया है, और pentamers भी हल्के साबुन पफो 22 में वैद्युतकणसंचलन दौरान मनाया गया अध्ययन करता है। उनके घनत्व डी ओ 2 के अलावा द्वारा मिलान किया जा सकता, क्योंकि ये सभी डिटर्जेंट, एसई के लिए उपयुक्त हैं नमूने भी 34 उपस्थित प्रजातियों की न्यूनतम संख्या प्रदान करता है जो अवसादन वेग (एसवी) द्वारा परीक्षण किया जाना चाहिए।

इसके अलावा, अनुपयुक्त डिटर्जेंट एसवी में कई प्रजातियों, और कई गैर विशिष्ट एसोसिएशन का संकेत पफो वैद्युतकणसंचलन में कई बैंड, उत्पादन होगा। एसई से उपयोगी जानकारी प्रजातियों के प्रमुख संख्या पूर्व जब प्राप्त किया जाता है प्रणाली में भेजा दो नहीं की तुलना में अधिक है; एसएच प्रोटीन के मामले में, डेटा monomers और pentamers के बीच एक संतुलन के लिए लगाया गया था।

यह monomer और बढ़ते आकार की oligomers के बीच प्रतिवर्ती संतुलनों के द्वारा पीछा किया, एसई डेटा फिट करने के लिए चुना मॉडल भी अर्थात।, अज्ञात आणविक वजन की एक प्रजाति पहली कोशिश की जानी चाहिए, संभव के रूप में सरल होना चाहिए कि नोट करना महत्वपूर्ण है। अधिक जटिल मॉडल एक उच्च अस्पष्टता संबद्ध कर दिया है। इसके अलावा, अन्य छोटे या बड़े oligomers की छोटी आबादी नहीं पाया जा सकता है, और मॉडल सिर्फ वर्तमान प्रमुख प्रजातियों क्या कर रहे हैं संकेत जाएगा। Viroporins के मामले में, यह विशेष रूप से स्पष्ट है क्योंकि 35 P7 हेपेटाइटिस सी वायरस में जैसे सूक्ष्म प्रयोगात्मक डिटर्जेंट में इस्तेमाल किया जैसे शर्तों, पीएच, प्रोटीन एकाग्रता, centrifugation गति या म्यूटेशन, पर निर्भर करता है oligomeric आकार में परिवर्तन, इन्फ्लूएंजा ए M2 के 36 या एसएच प्रोटीन 24।

jove_content "> गुम्मट एसएच प्रोटीन के लिए प्राप्त परिणामों स्पष्ट रूप से (pentamer के सहयोग से निरंतर पीएच 3. प्रवाहकत्त्व स्पष्ट रूप से पीएच 3 पर कम हो गया था, जहां सिंथेटिक लिपिड bilayers में एसएच प्रोटीन के साथ प्राप्त इन परिणामों मैच चैनल गतिविधि माप में कम हो जाता है कि पीके दिखाने एसएच चैनल गतिविधि कुछ हद तक देशी जैविक झिल्लियों में जब वर्तमान कम पीएच द्वारा नियंत्रित किया जाता है कि ~ 4.5), यह पीएच 7 और 5 24। इन परिणामों के आधार के बीच निरंतर बनी है, जबकि यह संभव हो सकता है। गोल्गी में पीएच ही है लुमेन यद्यपि कोशिका द्रव्य की है कि नीचे एक इकाई, intravesicular पीएच देर endosomes में पीएच 4.5-5.5 करने के लिए जल्दी endosomes में पीएच 6.0-6.5 से endocytic मार्ग के साथ चला जाता है और 37 लाइसोसोम। संक्रमित कोशिका में, चालकता परिवर्तन के लिए पीके या pentameric स्थिरता हो सकता है इस के साथ साथ और पहले 24 विट्रो में प्राप्त उन लोगों की तुलना में अधिक है, इसलिए पीएच वास्तव में जीवन चक्र के दौरान चैनल गतिविधि modulating में एक भूमिका निभा सकता हैवायरस की। संक्रमित कोशिका के संदर्भ में protonatable उनके अवशेषों का म्यूटेशन भविष्य प्रयोगों 38 के लिए एक दिलचस्प अवसर है।

अंत में, एसएच प्रोटीन का अध्ययन यूवी अवशोषण माप की सुविधा अपने अनुक्रम में टीआरपी की मौजूदगी से मदद की है। या soluble- प्रोटीन - हालांकि, oligomer की संरचना का ज्ञान जैसे असंवेदनशील स्थानों पर टीआरपी की शुरूआत, झिल्ली में प्रोटीन के कुछ हिस्सों का सामना करना पड़ विलायक -or लिपिड सक्षम कर सकते हैं। वैकल्पिक रूप से प्रोटीन एक-दर्शनीय अवशोषित या फ्लोरोसेंट लेबल के साथ टैग की जा सकती है।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक मापदंडों बदल रहे हैं जब एक परिभाषित वायरल चैनल के oligomeric आकार और संघ स्थिरांक निर्धारित करने के लिए एसई के आवेदन का वर्णन है। इस मामले में, पीएच ऐसे में संरचनात्मक पर परिवर्तन के प्रभाव के रूप में परीक्षण किया जा सकता है उनकी protonation की स्थिरता पर प्रभाव है, लेकिन कई अन्य परिकल्पना अध्ययन करने के लिए विविध किया गया हैइन oligomers की tegrity।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate Sigma T0807
Deuterium oxide 99.8% Cambridge Isotope DLM-4-99.8
An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place Beckman Coulter 363782
An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place Beckman Coulter 361964
Cell housing Beckman Coulter 334784
12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled Beckman Coulter 331376
Window holder Beckman Coulter 305037
Window gasket Beckman Coulter 327021
Window liner Beckman Coulter 362329
Sapphire window Beckman Coulter 307177
Quartz window Beckman Coulter 301730
Screw-ring washer Beckman Coulter 362328
Screw ring Beckman Coulter 301922
Spinkote Beckman Coulter 306812
Torque stand assembly Beckman Coulter 361318
Counterbalance Beckman Coulter 360219
Cell alignment tool Beckman Coulter 362340
SEDNTERP http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page
HeteroAnalysis  http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp
SEDFIT http://www.analyticalultracentrifugation
.com/sedfit.htm
SEDPHAT http://www.analyticalultracentrifugation
.com/sedphat/default.htm

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References

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रसायन विज्ञान अंक 98 विश्लेषणात्मक ultracentrifugation अवसादन संतुलन आणविक वजन झिल्ली प्रोटीन छोटे हाइड्रोफोबिक श्वसन syncytial वायरस डिटर्जेंट घनत्व मिलान oligomeric आकार हिस्टडीन protonation oligomer स्थिरता
एक छोटे oligomer के गठन झिल्ली प्रोटीन की अवसादन संतुलन: Pentameric स्थिरता पर Histidine Protonation का प्रभाव
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Surya, W., Torres, J. Sedimentation… More

Surya, W., Torres, J. Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability. J. Vis. Exp. (98), e52404, doi:10.3791/52404 (2015).

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