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Biology

जीन विशिष्ट अभिव्यक्ति के साथ डीएनए मेथिलिकरण परिवर्तन और astrocytic के transcriptional गतिविधि correlating Published: September 26, 2015 doi: 10.3791/52406

Protocol

सभी जानवरों को स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार संभाल रहे थे। बर्मिंघम में अलबामा विश्वविद्यालय में पशु की देखभाल और उपयोग समिति पशु उपयोग को मंजूरी दी।

1. पूरे मस्तिष्क के ऊतकों से astrocytes की छंटनी (FACS) फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल का उपयोग कर एक समृद्ध astrocytic जनसंख्या से आरएनए और डीएनए प्राप्त

  1. 1 मिनट के लिए सीओ 2 और फिर तेजी से सिर काटना के साथ शांत जानवर। अलबुकर्क एट अल में वर्णित के रूप में cortices काटना, 26। यह तानिका दूर करने के लिए आवश्यक नहीं है।
    नोट:। S100β तहत EGFP (एक अस्थिकणिका मार्कर) प्रमोटर व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों Itakura एट अल 27 द्वारा उत्पन्न और astrocytes की FACS छँटाई के लिए उपयोग किया गया।
  2. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार गैर बाँझ शर्तों के तहत एक papain हदबंदी किट का उपयोग कर पूरे मस्तिष्क homogenate तैयार करें। 10 मिनट के लिए पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर papain हीट को सक्रिय करें। ध्यान दें:Papain समाधान निर्माता द्वारा प्रदान की और एल सिस्टीन और EDTA (सामग्री की तालिका देखें) शामिल है।
    1. कट या ट्यूबिंग 95% 2 हे ले जाने की अनुमति के लिए एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष में एक छेद DREMEL: 5% सीओ 2 के एक बंद शंक्वाकार ट्यूब में खिलाया जा सकता है (चित्रा 1 ए)। हदबंदी मीडिया वाले 10mm संस्कृति डिश में विच्छेदित cortices प्लेस (20mm ग्लूकोज और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (500 यू / एमएल) के साथ पूरक और 95% हे equilibrated सदस्य 2: 5% सीओ 2) और 1 में ऊतक कीमा एक साफ रेजर ब्लेड का उपयोग एक्स 1 मिमी 2 टुकड़े।
  3. Papain समाधान युक्त 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को 10 मिलीलीटर मैनुअल pipetman का उपयोग स्थानांतरण ऊतक। ऊतक खत्म किया हदबंदी मीडिया की मात्रा को कम करने का निर्वहन करने से पहले हस्तांतरण पिपेट के नीचे बसा करने की अनुमति दें। 95% ओ 2 के लिए equilibrated papain समाधान रखें: 5% सीओ 2 ऊष्मायन की अवधि के लिए सतह गैस विनिमय के माध्यम से। नहीं बुलबुला papain soluti करोपर। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 20 मिनट के लिए ऊतक सेते हैं।
  4. Papain समाधान में निम्नलिखित ऊष्मायन, Triturate ऊतक धीमी गति से एक 10 मिलीलीटर हस्तांतरण विंदुक के साथ 10 बार। आरटी पर 5 मिनट के लिए 1000 XG पर अपकेंद्रित्र बादल सेल निलंबन।
    1. सतह गैस विनिमय के माध्यम से (निर्माता द्वारा प्रदान की) DNase / एल्बुमिन अवरोध करनेवाला समाधान संतुलित करना और DNase / एल्बुमिन अवरोध करनेवाला समाधान के 3 मिलीलीटर में pelleted कोशिकाओं को फिर से रोक देते हैं। निर्माता निर्देशों का पालन वाणिज्यिक असंतत घनत्व ढाल तैयार करें।
  5. 6 मिनट के लिए 1,000 XG पर असंतत घनत्व ढाल स्पिन। एक विंदुक का उपयोग कर नीचे गोली चूसने से ट्यूब के नीचे से अलग कोशिकाओं को अलग।
  6. 0.02% गोजातीय सीरम albumin और 1 मिलीग्राम / एमएल DNase या संस्कृति मीडिया बफर वरीय HEPES के साथ DPBS के 2-3 मिलीलीटर में अलग कोशिकाओं से निलंबित पुन। FACS (2A चित्रा) से पहले 40 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं। छँटाई तक बर्फ पर कोशिकाओं रखें।
    1. FACS के 28 प्रदर्शन करते हैं। </ Li>
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में गोली कोशिकाओं।
      नोट: pelleted astrocytes तुरंत उपयोग या डीएनए निष्कर्षण तक -80 डिग्री सेल्सियस में रखा जा सकता है।
  7. आरएनए और डीएनए वरीय अलगाव विधि 29 30 का उपयोग कर निकालें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और Bioanalyzer 31 के माध्यम से आरएनए और डीएनए एकाग्रता और गुणवत्ता का आकलन करें।
    नोट: बाद के चरणों में ही उच्च गुणवत्ता आरएनए और डीएनए का उपयोग, क्रमशः 260/280 = 2.0-2.2 और 1.8-1.9। Bioanalyzer विश्लेषण आरएनए गिरावट या डीएनए विखंडन के लिए आकलन करने के लिए आवश्यक है। शाही सेना या डीएनए तुरंत उपयोग या या -20 डिग्री सेल्सियस, क्रमशः बाद में पढ़ाई के लिए डिग्री सेल्सियस -80 संग्रहित किया जा सकता है।

2. मेथिलिकरण के प्रति संवेदनशील उच्च संकल्प पिघल विश्लेषण (एमएस-HRMA) का उपयोग कर एक जीन के डीएनए मेथिलिकरण स्थिति का आकलन

  1. जीन में किसी भी सीपीजी द्वीपों की पहचान करने के लिए पसंद ऑनलाइन मिथाइलेशन मानचित्रण सॉफ्टवेयर में ब्याज की जीन अनुक्रम दर्जब्याज 32 की।
    1. Bisulfite के खिलाफ डिजाइन प्राइमरों डीएनए अनुक्रम 33 परिवर्तित और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार वरीय डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग बढ़ाना। 45 मिनट के लिए 100 वी पर एक 1% agarose डीएनए जेल चलाकर प्रवर्धित उत्पाद आकार सत्यापित करें। -20 डिग्री सेल्सियस में 20 माइक्रोन के शेयर एकाग्रता पर स्टोर प्राइमरों।
  2. Bisulfite ही जानवरों की प्रजातियों में 34 से 0-100% से लेकर प्रत्येक नमूना और डीएनए methylated मानकों के डीएनए की 500-1,000 एनजी परिवर्तित। Elute नमूने 20 एनजी / μl के एक एकाग्रता प्रदान करते हैं। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर 31 के माध्यम से bisulfite परिवर्तित डीएनए की एकाग्रता की जाँच करें।
  3. तालिका 1 और 2 के अनुसार 5 माइक्रोन एकाग्रता में वरीय डीएनए पोलीमरेज़ और प्राइमरों का उपयोग एमएस मानव संसाधन विकास मंत्री प्रवर्धन के लिए सेटअप 20 μl प्रतिक्रियाओं। तीन प्रतियों में, FACS के डीएनए और मिथाइल मानकों सहित सभी नमूनों, चलाएँ।
  4. विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर निर्भर करता है, पूर्व निर्धारित है और शुरू करते हैं और मानकों को रोकने के बादपिघल वक्र के संक्रमण के आसपास। पूर्व निर्धारित पिघल शुरुआत है और दोनों के बीच अंतर 0.2 है तो पूर्व पिघल रोक मापदंडों - 0.5 डिग्री सेल्सियस। पोस्ट-पिघल शुरुआत और बाद पिघल इसी तरह रोक सेट करें। प्रत्येक नमूने के लिए चोटी के तापमान का अंतर डेटा निकालें।
  5. प्रतिशत methylated मानकों (वाई-मूल्य) और उनके इसी औसत शिखर तापमान मतभेद (एक्स-मूल्य) का उपयोग करते हुए एक रेखीय प्रतिगमन समीकरण (चित्रा 3 ए-बी, टेबल 3-4) उत्पन्न करते हैं। अज्ञात नमूने 35 के मेथिलिकरण स्थिति का अनुमान लगाने के लिए यह रेखीय प्रतिगमन समीकरण का प्रयोग करें।

3. luciferase परख के उपयोग के माध्यम हाइपर-methylated प्रमोटर गतिविधि का आकलन

  1. लक्ष्य जीन (2.1 कदम) के सीपीजी द्वीपों को पहचानें। पीसीआर सीपीजी-द्वीप-luc2 प्लास्मिडों 37 का उत्पादन करने luc2 जुगनू luciferase रिपोर्टर जीन के ऊपर ब्याज 36 और क्लोन के क्षेत्रों बढ़ाना।
  2. प्रतिबंध के माध्यम से सीपीजी-द्वीप-luc2 प्लाज्मिड के 30 माइक्रोग्राम Linearizeएंजाइम पाचन 38। प्रतिबंध पचाने के लिए साइटों की जाँच करें और वरीय कटर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 38 डबल कटौती से बचें। निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार पाचन के बाद उचित तापमान और अवधि पर एंजाइमों हीट निष्क्रिय। डीएनए का कम से कम नुकसान linearization चरण के दौरान होता है।
  3. 30 डिग्री सेल्सियस पर सीपीजी methylase (M.Sssl) हे / n का उपयोग या निम्न समायोजन के लिए छोड़कर इलाज निम्नलिखित निर्माता प्रोटोकॉल छोड़ methylate linearized प्लास्मिडों।
  4. 50 μl प्रतिक्रियाओं को पूरा करें।
  5. Linearized प्लाज्मिड के 700 एनजी methylate को सीपीजी methylase की 5 इकाइयों का प्रयोग करें।
  6. 13-19 घंटे के लिए प्रतिक्रियाओं हे / n भागो।
  7. सीपीजी methylase प्रतिक्रिया के बाद, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिलिका जेल झिल्ली निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार किट को साफ मानक, का उपयोग डीएनए सफाई करते हैं। डीएनए के महत्वपूर्ण नुकसान सीपीजी methylase प्रतिक्रिया, 30-60% नुकसान के बाद हो।
  8. एक ह्पा द्वितीय प्रतिबंध पचाने के माध्यम से plasmids के मिथाइलेशन सत्यापित करें। मिथाइल या गैर डीएनए methylated की 1 ग्राम लो और प्रतिबंध 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ह्पा द्वितीय के साथ पचा। प्रत्येक ग्राम डीएनए के लिए ह्पा द्वितीय के 5-10 इकाइयों का प्रयोग करें। ह्पा द्वितीय पाचन के बाद, पसंदीदा, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिलिका जेल झिल्ली को साफ किट का उपयोग डीएनए सफाई करते हैं। दृश्य के लिए 45 मिनट (चित्रा 4 बी) के लिए 100 वी पर TAE या TBE बफर में एक 1% agarose डीएनए जेल पर दोनों सीपीजी methylated और गैर-मिथाइल प्लास्मिडों चलाएँ।
  9. उचित प्रतिबंध एंजाइमों के साथ डबल पाचन के अधीन रहते हुए दोनों methylated और गैर methylated प्लास्मिडों पूर्ण लंबाई ल्यूक 2 (वेक्टर) और सीपीजी द्वीप (डालने) 38 टुकड़े जारी करने के लिए। निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार पाचन के बाद उचित तापमान और गर्मी निष्क्रिय एंजाइमों पर डबल पाचन हे / एन प्रदर्शन करते हैं। डीएनए एकाग्रता का कम से कम नुकसान डबल प्रतिबंध पचाने के दौरान होता है।
  10. ओ जुदाई के लिए अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए 100 वी पर 1% डीएनए agarose जेल पर डबल पचा प्लास्मिडों भागोच वेक्टर और डालने (चित्रा 4C)। सावधानी। सुरक्षात्मक यूवी चेहरा शील्ड पहने हुए, बैंड कल्पना करने के लिए एक टेबलटॉप काले रंग की रोशनी पर डीएनए जेल जगह है। एक साफ सर्जिकल ब्लेड का उपयोग कर आकार, आबकारी methylated और गैर-मिथाइल डालने और गैर-मिथाइल वेक्टर के आधार पर।
  11. संतृप्त फिनोल, पीएच 6.6 का उपयोग कर जेल निकालने डीएनए। संक्षेप में, वेक्टर या डालने युक्त डीएनए जेल तौलना। डीएनए जेल की 0.1 ग्राम प्रति फिनोल के 100 μl का प्रयोग करें। कांच Dounce homogenizer का उपयोग फिनोल में डीएनए जेल Homogenize।
  12. क्लोरोफॉर्म (फिनोल मात्रा का 1/5 का उपयोग) जोड़ें और 20 सेकंड के लिए नमूने हिला। 2-3 मिनट के लिए आरटी पर नमूने सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम गति (16.1 x 1000 XG) पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  13. जलीय समाधान निकालें और 3 एम सोडियम एसीटेट और इथेनॉल के 2.5X मात्रा की 0.1X मात्रा में जोड़ें। -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए नमूने सेते हैं। ऊष्मायन के बाद, इथेनॉल हटाने और वरीय बफर के 30 μl में डीएनए फिर से निलंबित। डीएनए के महत्वपूर्ण नुकसान सम्मिलित करता है और वैक्टर के निम्नलिखित अलगाव होता है, 30-50% लोएस एस।
  14. पुनः Ligate को methylated और गैर-मिथाइल सम्मिलित करता है टी -4 डीएनए ligase 38 का उपयोग वेक्टर गैर methylated। बंधाव प्रतिक्रियाओं के लिए डालने के लिए वेक्टर के 4 अनुपात: एक 1 का प्रयोग करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेटअप प्रतिक्रिया। प्रतिक्रियाओं के लिए 50 μl की कुल मात्रा का प्रयोग करें और डिग्री सेल्सियस या बर्फ बाल्टी के ऊपर ढक्कन के साथ बर्फ पर -20 में हे / एन सेते हैं।
  15. बंधाव के बाद, पसंदीदा, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिलिका जेल झिल्ली को साफ किट का उपयोग डीएनए सफाई करते हैं। डीएनए के महत्वपूर्ण नुकसान बंधाव प्रतिक्रिया, डीएनए की एक अनुमानित 30-50% नुकसान के बाद हो। 45 मिनट के लिए 100 वी पर 1% agarose डीएनए जेल पर चलाने के द्वारा फिर से बंधाव सत्यापित करें और फिर से ligated प्लास्मिडों (चित्रा 4D) की एकाग्रता का आकलन करें।
  16. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग D54 कोशिकाओं में methylated या गैर methylated प्लास्मिडों Transfect। अच्छी तरह से एक 0.14 x 10 6 कोशिकाओं / पर 12 अच्छी तरह से थाली पर बीज D54 कोशिकाओं।
  17. 24 घंटा के बाद, transfect कोशिकाओं वाई(1) गैर-methyated सीपीजी-luc2 प्लाज्मिड + Renilla या अन्य नियंत्रण luciferase वेक्टर या (2) methylated सीपीजी-luc2 प्लाज्मिड + Renilla या अन्य नियंत्रण luciferase वेक्टर या तो वें बराबर सांद्रता।
  18. कोशिकाओं दोहरी luciferase परख प्रदर्शन से पहले 24 घंटे के लिए transfect करने की अनुमति दें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार परख प्रदर्शन। एक luminometer का उपयोग कर रीडिंग प्रदर्शन करते हैं। तीन प्रतियों में अच्छी तरह से प्रत्येक पढ़ें।
  19. Renilla को जुगनू luciferase गतिविधि के अनुपात या अन्य नियंत्रण luciferase गतिविधि की गणना। गैर methylated जुगनू को नियंत्रण luciferase गतिविधि: methylated जुगनू को सामान्य नियंत्रण luciferase गतिविधि गैर methylated luciferase गतिविधि से मिथाइल luciferase गतिविधि विभाजित करके

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Representative Results

Astrocytes की एक समृद्ध आबादी EGFP-S100β ट्रांसजेनिक जानवरों 27 की FACS छँटाई के माध्यम से अधिग्रहण कर लिया था। कारण P0-P40 वृद्ध कोशिकाओं और प्रसव के बाद दिन 50 (P50) की तुलना में बड़े पशुओं से अलग आणविक अणु, जानवरों की गुणवत्ता को कम करने के लिए इस तरह के प्रयोगों के लिए उपयोगी हैं। Cortical ऊतक इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था। दो से छह जानवरों से cortices एक साथ जमा किए गए थे। FACS UAB व्यापक फ्लो कोर सुविधा पर प्रदर्शन किया गया था। छंटनी बेक्टन डिकिंसन FACSAria द्वितीय पर प्रदर्शन किया गया था। EGFP उत्तेजना 488 एनएम लेजर का उपयोग कर प्राप्त किया गया था; कोई मुआवजा जरूरी हो गया था। एक gated आबादी आगे और पक्ष तितर बितर (चित्रा 1 बी) के आधार पर लक्षित किया गया था। एक जीवित कोशिका आबादी एक ethidium ब्रोमाइड मृत सेल सूचक का उपयोग निर्धारित और चित्रा (1 सी) गेटेड था। दो अलग आबादी EGFP प्रोफ़ाइल (चित्रा -1) के आधार पर मनाया गया। अनुभवसिद्ध परीक्षण, उच्च EGFP के साथ सेल आबादी के माध्यम सेप्रोफ़ाइल EGFP पॉजिटिव सेल की आबादी (चित्रा 1F-एफ '') के रूप में पहचान की थी। एक कम EGFP प्रोफाइल के साथ दूसरे नंबर पर जनसंख्या का दृश्य विश्लेषण संभावना astrocytic प्रक्रियाओं (चित्रा 1G-जी '') से मलबे का प्रतिनिधित्व करने, EGFP व्यक्त सेल टुकड़े का पता चला है, लेकिन नाभिक से रहित। हदबंदी के बाद अलग EGFP सकारात्मक astrocytes की छवियों प्रतिनिधि लेकिन (2A चित्रा) छँटाई करने के लिए और (चित्रा 2 बी) दिखाए जाते हैं छंटाई के बाद पहले। पृथक EGFP सकारात्मक सेल की आबादी ALDH1L1 mRNA, एक astrocytic विशिष्ट मार्कर 39 (चित्रा -2) में 40 गुना वृद्धि का प्रदर्शन किया। इसके अतिरिक्त, NG2 + OPCs और astrocytes 39 में S100β की साझा अभिव्यक्ति के बावजूद, हम एक समृद्ध astrocytic सेल की आबादी (चित्रा -2 सी-डी) के अलगाव का संकेत है, NG2 mRNA का 4 गुना कमी, oligodendrocyte अग्रदूत कोशिकाओं 39 के लिए एक मार्कर मनाया। आरएनएऔर FACS से अलग डीएनए astrocytes के बाद के मेथिलिकरण अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए पर्याप्त मात्रा और गुणवत्ता के थे सुलझा लिया। अलग उम्र और पशुओं की संख्या से अलग कुल आरएनए और डीएनए FACS (5 तालिका) निम्न आणविक अणुओं की उम्मीद की उपज के लिए एक संदर्भ के रूप में सूचीबद्ध किया गया है। यह उपज का भी उपयोग पशुओं की संख्या, ऊष्मायन अवधि, और शोधकर्ता के अनुभव के आधार पर अलग अलग होंगे कि ध्यान दिया जाना चाहिए। टेबल 6 घटनाओं की परिवर्तनशीलता उपयोग किया जानवरों और ऊष्मायन अवधि की संख्या के आधार पर हासिल कर लिया दर्शाता है।

मेथिलिकरण अध्ययन के लिए, उच्च गुणवत्ता और डीएनए की पर्याप्त मात्रा के साथ शुरू सफल बहाव के अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक है। शाही सेना या डीएनए निष्कर्षण के लिए ऊतक की पर्याप्त सेल सुनिश्चित करने के लिए ऊतक या कोशिकाओं के सभी homogenization सेल के दौरान झाग से बचने के लिए, देखभाल करने के एक 23G सुई 7x का उपयोग कर विचूर्णन द्वारा पीछा किया गया था। एक बार जब उच्च गुणवत्ता डीएनए निकाला और bisulfite परिवर्तितएड, हित के क्षेत्रों एमएस HRMA के लिए निशाना बनाया जा सकता है। गुणवत्ता और bisulfite परिवर्तित डीएनए की एकाग्रता का आकलन करते समय, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर bisulfite डीएनए फंसे एक है परिवर्तित रूप में 33 के एक आयुध डिपो कारक पर पढ़ने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए कि ध्यान दें। Bisulfite परिवर्तित डीएनए के लिए 260/280 मूल्यों 2.20-2.70 लेकर।

मिथाइलेशन पढ़ाई शुरू करने से पहले, यह उचित चयन और एमएस HRMA अध्ययन के लिए एक थर्मल cycler जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, एक एमएस HRMA से उत्पन्न कच्चे डेटा निर्यात और उपयोग करने के लिए यह निर्धारित करना चाहिए। एप्लाइड Biosystems उच्च संकल्प पिघलती गाइड 7900HT थर्मल cycler औजार में सहायता करने के लिए उपयोग किया गया था शुरू हो रही है। अंत में, डेटा निकाली और बाद में डेटा विश्लेषण के लिए मानव संसाधन विकास मंत्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर में आयात किया गया था। प्रोटोकॉल में विस्तृत रूप में, पूर्व और पोस्ट शुरू और मापदंडों पिघल वक्र के संक्रमण के निकट स्थापित किए गए बंद करो। पीक तापमान मतभेद अज्ञात एसए के मेथिलिकरण स्थिति एक्सट्रपलेशन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे थेmples। एमएस HRMA से अर्जित अनुमानित मिथाइलेशन डेटा (pyrosequencing डेटा एमएस मानव संसाधन विकास मंत्री प्राइमरों के रूप में ही क्षेत्रों को लक्षित प्राइमरों का उपयोग घर में तैयार की गई थी) (चित्रा 3 सी) 15 pyrosequencing से उत्पन्न मिथाइलेशन डेटा को बारीकी से पत्राचार किया।

एक दोहरी luciferase परख ब्याज (चित्रा 4 ए) के जीन की अति-methylated क्षेत्रों के ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया था। प्रत्येक सीपीजी-द्वीप-luc2 प्लाज्मिड linearized और फिर methylated था। हालांकि डालने (सीपीजी द्वीप) और वेक्टर (luc2) दोनों प्रतिक्रिया के दौरान methylated कर रहे हैं, क्योंकि एक methylated डालने आबकारी चाहिए और फिर से Ligate एक गैर methylated वेक्टर के लिए। कारण प्लाज्मिड के व्यापक हेरफेर करने के लिए, महत्वपूर्ण नुकसान होते हैं और एक पर्याप्त सामग्री शुरू के साथ शुरू होगा। HpaII पाचन HpaII केवल गैर-डीएनए methylated (चित्रा 4 बी) हज़म के रूप में प्रत्येक प्लाज्मिड के मेथिलिकरण स्थिति को सत्यापित करने के लिए उपयोग किया गया था। इस बात पे ध्यान दिया जाना चाहिए किहे / एन मेथिलिकरण अपर्याप्त है, तो सीपीजी methylase के एक अतिरिक्त सैम की 1x और 1x 30 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 1 घंटा निम्नलिखित जोड़ा जा सकता है। पूरक सैम और सीपीजी methylase के अलावा निम्नलिखित हे / एन ऊष्मायन जारी रखें। Methylated और गैर-मिथाइल सीपीजी-द्वीप-luc2 प्लाज्मिड की पीढ़ी luciferase गतिविधि की माप के माध्यम से डीएनए मेथिलिकरण और ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि के बीच परिवर्तन का सीधा आकलन के लिए अनुमति देता है।

चित्र 1
चित्रा 1. FACS छँटाई EGFP + सेल popoulation आइसोलेट्स। छेद में कटौती के साथ एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के (ए) का प्रयोग करें शीर्ष papain पाचन के दौरान सतह गैस आदान प्रदान के लिए अनुमति देता है पर। (बी) के हल कोशिकाओं आगे और पक्ष बिखराव भूखंडों पर आधारित gated थे। (ग) एक ethidium ब्रोमाइड आधारित मृत सेल सूचक गेट के लिए एक जीवित सेल की आबादी (लाल) का उपयोग किया गया था। (डी) लाइव सेलएक उच्च EGFP प्रोफ़ाइल (हरा) और एक कम EGFP प्रोफ़ाइल (बैंगनी) के साथ एक - एल आबादी दो आबादी का प्रदर्शन किया। सभी रेखांकन के लिए, वाई अक्ष ओर तितर बितर क्षेत्र (एसएससी-ए) का प्रतिनिधित्व करता है; एक्स अक्ष आगे ओर तितर बितर क्षेत्र (एफएससी-ए), हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन क्षेत्र (GFP ए), या ethidium ब्रोमाइड (EtBr) का प्रतिनिधित्व करता है। (ईजी) अलग कोशिकाओं Hoechst के साथ incubated रहे थे और अलग कोशिकाओं के 20 μl coverslip पर रखा गया है और उतारी थी। व्यापक प्रक्रियाओं के साथ (ईई '') EGFP + astrocytes, (एन एस) छँटाई पहले कल्पना थे। छँटाई, उच्च EGFP + आबादी (पीओएस) के बाद (एफएफ '') Hoechst धुंधला के साथ-स्थानीय बनाना जो सह EGFP + सेल सोम प्रदर्शित करता है। (सीजी '') कम EGFP आबादी। संभावना (सभी छवियों के लिए, पैमाने = 20 माइक्रोन) astrocytic मलबे का प्रतिनिधित्व करने, Hoechst धुंधला के साथ सह-स्थानीय बनाना नहीं था जो EGFP + धुंधला दर्शाता करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
EGFP-S100 β ट्रांसजेनिक जानवरों की छँटाई चित्रा 2. FACS astrocytes की समृद्ध आबादी है। FACS (एन एस) से पहले अलग कोशिकाओं के 20 μl दिखाए जाते हैं (ए), प्रक्रियाओं बरकरार रहेगा (पैमाने = 50 माइक्रोन)। (बी) के प्रतिनिधि छवि पोस्ट FACS (FACS) कोशिकाओं को दिखाया जाता है; astrocytic प्रक्रियाओं हटा दिया है और सेल सोम अवशेष (पैमाने = 20 माइक्रोन) कर रहे हैं। (सी) qPCR डेटा नहीं छाँटे गए जनसंख्या (एन एस) की तुलना में FACS कोशिकाओं को हल में ALDH1L1 mRNA में एक 40 गुना वृद्धि (FACS) को दर्शाता है। (डी) NG2 mRNA FACS में 4 गुना से कम है कोशिकाओं को हल नहीं की आबादी (एन एस) की तुलना में हल। के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्र तीन
एमएस मानव संसाधन विकास मंत्री के अध्ययन के लिए चित्रा 3. नमूना डेटा और विश्लेषण। मिथाइलेशन मानकों से उत्पन्न तापमान अंतर भूखंडों की (ए) उदाहरण। इसी प्रतिशत मिथाइलेशन चूहे methylated मानकों से उत्पन्न रेखीय प्रतिगमन समीकरण के प्रत्येक वक्र (बी) उदाहरण के लिए लेबल है। (Pyroseq, हरे रंग की सलाखों) और एमएस HRMA (धूसर बार) pyrosequencing से प्राप्त कर लिया प्रतिशत मिथाइलेशन (सी) तुलना KCNJ10 के क्षेत्रों में परिवर्तन के लिए मिथाइलेशन के समान स्तर को दर्शाता है। एमएस मानव संसाधन विकास मंत्री के रूप में ही क्षेत्रों को लक्षित प्राइमरों का उपयोग घर में उत्पन्न pyrosequencing डेटा विश्लेषण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

हमेशा ">:" रख-together.within-पेज = के लिए "तम्बू चित्रा 4
चित्रा 4. दोहरी luciferase परख विभिन्न methylated जीन क्षेत्रों की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि के आकलन के लिए अनुमति देता है। (ए) आरेख luciferase ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि परख के प्रोटोकॉल के कार्यप्रवाह को दर्शाता है। HpaII पाचन के बाद गैर methylated प्लास्मिडों बनाम methylated में (बी) के डीएनए जेल प्रदर्शित करता मतभेद। गैर-डीएनए methylated आसानी से डीएनए प्लाज्मिड के सफल मिथाइलेशन का प्रदर्शन, डीएनए methylated की तुलना में HpaII पाचन निम्नलिखित पच जाता है। (सी) डीएनए जेल डबल पाचन निम्नलिखित डालने से वेक्टर की जुदाई को दर्शाता है। डीएनए जुदाई, वेक्टर और डालने के बाद जेल निकाले जाते हैं। (डी) डीएनए जेल वेक्टर और डालने का सफल फिर से बंधाव को दर्शाता है। पुनः ligated प्लाज्मिड समान आणविक वजन अनुपचारित प्लाज्मिड के रूप में (untx) के पास। समुद्री मील दूर, गैर मुलाकातhylated; एम, मिथाइल; आरएल, फिर से ligated; untx, अनुपचारित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मात्रा (μl) X3 10% अतिरिक्त नमूनों की एक्स #
MeltDoc एम.एम. 10 μl 33 μl
प्राइमर 1 1.2 μl 3.96 μl
प्राइमर 2 1.2 μl 3.96 μl
gDNA 1 μl ---
DH 2 0 6.6 μl 21.78 μl

MeltDoctor MasterMix की तालिका 1. नमूना गणना। प्रत्येक एमएस मानव संसाधन विकास मंत्री वजह भागो10% अतिरिक्त के साथ तीन प्रतियों में ction pipetting त्रुटि के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए। अंतिम स्तंभ नमूनों की कई नंबर के लिए आवश्यक गणना इंगित करता है। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए कुल मात्रा 20 μl है।

चक्र अस्थायी (डिग्री सेल्सियस) समय (सेकंड) रैंप दर (%)
95 डिग्री सेल्सियस : 15 100
40x 95 डिग्री सेल्सियस : 15 100
60 डिग्री सेल्सियस : 60 100
पिघलती मानकों को 95 डिग्री सेल्सियस : 10 100
60 डिग्री सेल्सियस : 60 100
95 डिग्री सेल्सियस : 15 1
60 डिग्री सेल्सियस : 15 100
पकड़ 4 76, सी

तालिका 2:। प्रवर्धन के लिए नमूना प्रोटोकॉल पिघल वक्र के प्रवर्धन और पीढ़ी के 40 चक्रों के बाद 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों denature। पिघलती मापदंडों तालिका में सूचीबद्ध हैं। उच्च संकल्प पिघलने के तापमान के अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है कि रैंप दर में परिवर्तन पर ध्यान दें।

प्रतिशत मेथिलिकरण (चूहा स्टैंडर्ड) पीक तापमान अंतर
Y एक्स
0 5.670116
5 १०.७०,४४८
10 15.5044
25 २५.५२२९५
50 ३४.४३,०४७
75 ४३.८०८९४
100 ५३.८८७१७
NT "पीक तापमान अंतर डेटा के> टेबल 3. उदाहरण। प्रतिशत मिथाइलेशन मानक। पीक तापमान अंतर डेटा एक्स समन्वय के रूप में चिह्नित किया गया है। Y समन्वय के रूप में लेबल प्रतिनिधि शिखर तापमान अंतर डेटा एक जीन क्षेत्र से एमएस मानव संसाधन विकास मंत्री का उपयोग कर हासिल किया गया था।

पीक अस्थायी अंतर अनुमानित मिथाइलेशन
एक्स Y
नमूना 1 (एन = 4)
47.450 81.115
46.292 78.657
41.694 68.894
47.292 80.779
नमूना 2 (एन = 4)
29.925 43.904
24.269 31.894
25.061 33.575
25.389 34.272

टेबल की गणना का अनुमान प्रतिशत मिथाइलेशन के 4. उदाहरण। अज्ञात मेथिलिकरण स्थिति के नमूनों की पीक तापमान का अंतर एक रेखीय प्रतिगमन समीकरण का उपयोग प्रतिशत मिथाइलेशन अनुमान लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है। दो अलग अलग परिस्थितियों, नमूना 1 और नमूना 2 से प्रतिनिधि डेटा दिखाए जाते हैं; एन = हर हालत के लिए 4।

आयु जानवरों की संख्या कुल शाही सेना (एनजी) कुल डीएनए (एनजी)
पी 4-P10 3-6 455-868 265-1523
P19-P22 1-2 220-680 583-1483
P40-P50 3-4 198-260 578-1700

FACS से अर्जित सारणी 5. कुल आरएनए और डीएनए कोशिकाओं को हल। आयु और जानवरों की संख्या एफए में इस्तेमाल कियासीएस प्रयोगों सूचीबद्ध हैं। ध्यान दें, दोनों cortices प्रत्येक एन कुल शाही सेना के लिए उपयोग किया गया और डीएनए उम्मीद की उपज के लिए एक संदर्भ के रूप में सूचीबद्ध किया गया है।

आयु जानवरों की संख्या स्थिति घटनाक्रम Neg घटनाक्रम ऊष्मायन समय (37 डिग्री सेल्सियस)
P26 1 2.18X10 ^ 6 1.15X10 ^ 6 20:00 मिनट
P26 2 4.4X10 ^ 6 2.78X10 ^ 6 20:00 मिनट
P26 2 9.2X10 ^ 6 3.3X10 ^ 6 30:00 मिनट

सकारात्मक (EGFP +) घटनाओं और नकारात्मक घटनाओं की P26 नंबर पर प्रसव के बाद दिन 26. पर FACS से अधिग्रहीत की घटनाओं में से 6 तालिका संख्या में उपयोग जानवरों और ऊष्मायन अवधि की संख्या पर निर्भर करता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150
AllPrep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204
Methyl Primer Applied Biosystems online software to localize CpG Islands
EZ DNA methylation Kit Zymo Research D5001
Rat Premixed Calibration Standard EpiGenDx 80-8060R-Premix
CpG Methylase (M.Sssl) Zymo Research E2010
QIAquick Gel Extraction  QIagen 28704 Used for gel extraction and DNA cleanup
Restriction enzymes New England BioLabs
NEB cutter New England BioLabs online verify restriction digest sites
Dual Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Luc2 vector, pGL4.10 Promega E6651
renilla vector, pGL4.74 Promega E2241
TD-20/20 Luminometer Turner Designs
Lipofectamine LTX and Plus Reagent Life Technologies A12621
Phenol, saturated pH 6.6/6.9 Fisher Scientific BP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer ThermoScientific
MeltDoctor Master Mix Life Technologies 4415440
High Resolution Melt (HRM) Software v2.0 Life Technologies 4397808
AB SDS software v2.3 Life Technologies online
AB High Resolution Melting Getting Started Guide  Life Technologies online
AB 7900HT Fast Real-Time System Life Technologies

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 103 डीएनए मेथिलिकरण एमएस-HRMA luciferase प्रमोटर परख FACS astrocytes Kir4.1,
जीन विशिष्ट अभिव्यक्ति के साथ डीएनए मेथिलिकरण परिवर्तन और astrocytic के transcriptional गतिविधि correlating<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)
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Nwaobi, S. E., Olsen, M. L. Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1). J. Vis. Exp. (103), e52406, doi:10.3791/52406 (2015).

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