Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ربط الجينات المحددة الحامض النووي التغييرات مع التعبير والترانسكربتي آخر من نجمي Published: September 26, 2015 doi: 10.3791/52406
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell Developmental and Integrative Biology, University of Alabama at Birmingham

Protocol

تم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا للمعاهد القومية للصحة المبادئ التوجيهية. وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوان في جامعة ألاباما في برمنغهام استخدام الحيواني.

1. الحصول على الحمض النووي الريبي والحمض النووي المخصب من نجمي السكان الذين يستخدمون نيون المنشط خلية الفرز (FACS) من الخلايا النجمية من كامل أنسجة المخ

  1. الحيوان رزين مع CO 2 لمدة 1 دقيقة ثم قطع رأس بسرعة. تشريح القشور كما هو موضح في البوكيرك وآخرون، 26؛ ليس من الضروري لإزالة السحايا.
    ملاحظة: تم إنشاؤها الفئران المعدلة وراثيا معربا عن EGFP تحت S100β (علامة نجمية) المروج التي كتبها إيتاكورا وآخرون 27 وتستخدم لFACS فرز الخلايا النجمية.
  2. إعداد جناسة الدماغ كله باستخدام عدة التفكك غراء في ظل ظروف غير معقمة وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. للحرارة تفعيل غراء عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 10 دقيقة. ملاحظة:وتقدم الحل غراء من قبل الشركة المصنعة ويحتوي L-السيستين وEDTA (انظر الجدول المواد).
    1. قطع أو DREMEL ثقب في الجزء العلوي من أنبوب 50 مل مخروطي الشكل للسماح أنابيب تحمل 95٪ O 2: CO 2 5٪ ليكون الطعام في أنبوب مخروطي مغلق (الشكل 1A). وضع القشور تشريح في طبق ثقافة 10MM تحتوي على وسائل الاعلام تفارق (MEM تستكمل مع الجلوكوز 20MM والبنسلين / الستربتومايسين (500 U / مل)، ومعايرتها إلى 95٪ O 2: 5٪ CO 2)، واستخدام شفرة حلاقة نظيفة لتخطر على الأنسجة في 1 × 1 مم 2 قطعة.
  3. نقل الأنسجة باستخدام 10 مل pipetman اليدوي إلى 50 مل أنبوب مخروطي يحتوي الحل غراء. تسمح الأنسجة لتستقر في قاع نقل ماصة قبل التفريغ لتقليل كمية من وسائل الاعلام تفارق ترحيلها. إبقاء الحل غراء معايرتها إلى 95٪ O 2: 5٪ CO 2 عن طريق تبادل الغازات السطح لمدة الحضانة. لا فقاعة غراء solutiعلى. احتضان الأنسجة لمدة 20 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
  4. وبعد الحضانة في حل غراء، الأنسجة يسحن 10 مرات مع ماصة 10 مل نقل بسرعة بطيئة. الطرد المركزي تعليق خلية غائم في 1000 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
    1. تتوازن الدناز / الزلال حل المانع (المقدمة من قبل الشركة المصنعة) عن طريق تبادل الغازات السطحية واعادة تعليق الخلايا مكعبات في 3 مل من محلول الدناز / الزلال المانع. إعداد التجاري التدرج الكثافة متقطعة باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  5. تدور متقطع التدرج الكثافة في 1000 x ج لمدة 6 دقائق. عزل الخلايا فصلها من أسفل أنبوب عن طريق مص بيليه السفلي باستخدام ماصة.
  6. اعادة تعليق الخلايا فصلها في 2-3 مل من DPBS مع 0.02٪ ألبومين المصل البقري و 1 ملغ / مل الدناز أو HEPES فضل مخزنة سائل الإعلام والثقافة. تمر عبر 40 ميكرون تصفية قبل FACS (الشكل 2A). تبقي الخلايا على الجليد حتى الفرز.
    1. أداء FACS 28. </ لى>
    2. خلايا بيليه في 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: الخلايا النجمية مكور يمكن استخدامها على الفور أو الاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي.
  7. استخراج الحمض النووي الريبي والحمض النووي باستخدام طريقة عزل المفضلة 29 30. تقييم RNA وتركيز الحمض النووي والجودة عبر الطيف وbioanalyzer 31.
    ملاحظة: الاستفادة فقط RNA ذات جودة عالية وDNA في الخطوات اللاحقة، 260/280 = 2،0-2،2 و1،8-1،9، على التوالي. تحليل Bioanalyzer ضروري لتقييم لتدهور RNA أو DNA تجزئة. RNA أو DNA يمكن أن تستخدم مباشرة أو تخزينها في -80 ° C أو -20 درجة مئوية، على التوالي لدراسات لاحقة.

2. تقييم الحامض النووي الحالة من الجينات باستخدام مثلأيشن تراعي عالية الدقة التحليل تذوب (MS-HRMA)

  1. أدخل تسلسل الجينات في المصالح في فضل برنامج رسم الخرائط مثيلة على الانترنت لتحديد أي الجزر الدليل السياسي الشامل في الجيناتالفائدة 32.
    1. الاشعال تصميم ضد بيسلفيت تحويلها تسلسل DNA 33 و تضخيم باستخدام البلمرة DNA المفضل وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. تحقق تضخيم حجم المنتج عن طريق تشغيل 1٪ هلام DNA الاغاروز في 100 V لمدة 45 دقيقة. متجر الاشعال في تركيز الأسهم من 20 ميكرومتر في -20 ° C.
  2. بيسلفيت تحويل 500-1،000 نانوغرام من الحمض النووي من كل عينة DNA والميثيلي والمعايير تتراوح بين 0-100٪ من الأنواع الحيوانية نفسها 34. عينات أزل لتوفير تركيز 20 نانوغرام / ميكرولتر. تحقق من تركيز الحمض النووي تحويل بيسلفيت عبر طيفي 31.
  3. إعداد 20 ميكرولتر ردود الفعل لتضخيم MS-HRM باستخدام البلمرة DNA المفضل والاشعال في 5 ميكرومتر تركيز وفقا للجدول 1 و 2. تشغيل جميع العينات، بما في ذلك المعايير DNA ومميثل FACS، في ثلاث نسخ.
  4. اعتمادا على برامج التحليل، تعيين قبل وبعد بدء ووقف المعلماتحول التحولات في منحنى ذوبان. مجموعة قبل ذوبان بداية والمعلمات توقف قبل تذوب حتى الفرق بين الاثنين هو 0،2-0،5 درجة مئوية. بدء تعيين ما بعد ذوبان وبعد ذوبان وقف بالمثل. استخراج البيانات الفرق في درجة الحرارة الذروة لكل عينة.
  5. باستخدام المعايير في المئة مميثل (ص القيمة) والذي يقابل متوسط ​​الاختلافات في درجة الحرارة ذروتها (خ القيمة) توليد معادلة الانحدار الخطي (الشكل 3A-B، الجدول 3-4). استخدام هذا معادلة الانحدار الخطي لتقدير حالة مثيلة من العينات المجهولة 35.

3. تقييم فرط ميثليته-آخر المروج عبر استخدام luciferase الفحص

  1. تحديد الجزر الدليل السياسي الشامل من الجين المستهدف (الخطوة 2.1). PCR تضخيم المناطق ذات الاهتمام 36 و استنساخ المنبع من luc2 اليراع مراسل luciferase المراسل الجينات لإنتاج البلازميدات الدليل السياسي الشامل الجزيرة-luc2 37.
  2. خطي 30 ميكروغرام من البلازميد الدليل السياسي الشامل الجزيرة-luc2 عبر تقييدانزيم الهضم 38. التحقق من مواقع لتقييد هضم وتجنب تخفيضات مزدوجة باستخدام برنامج القاطع المفضل 38. للحرارة وقف نشاط الإنزيمات في درجة الحرارة ومدة المناسبة التالية الهضم وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. فقدان الحد الادنى من الحمض النووي يحدث خلال خطوة الخطية.
  3. ميثيل البلازميدات خطي باستخدام الدليل السياسي الشامل methylase (M.Sssl) O / N عند 30 درجة مئوية أو ترك دون علاج بروتوكول المصنعة التالية باستثناء التعديلات التالية.
  4. أداء 50 ميكرولتر ردود الفعل.
  5. استخدام 5 وحدات من الدليل السياسي الشامل methylase إلى ميثيل 700 نانوغرام من البلازميد خطي.
  6. تشغيل ردود الفعل O / N ل13-19 ساعة.
  7. وبعد رد فعل methylase الدليل السياسي الشامل، نفذ تنظيف DNA باستخدام معيار، المتاحة تجاريا غشاء السيليكا جل تنظيف عدة وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. خسائر كبيرة في DNA تحدث بعد الدليل السياسي الشامل methylase رد فعل، وفقدان 30-60٪.
  8. تحقق مثيلة من البلازميدات عن طريق تقييد هبان II هضم. تأخذ 1 ميكروغرام من الحمض النووي ميثليته أو غير ميثليته وتقييد هضم مع هبان II لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. استخدام 5-10 وحدات من هبان II لكل DNA ميكروغرام. بعد هبان II الهضم، نفذ تنظيف DNA باستخدام المفضلة، غشاء المتاحة تجاريا السيليكا جل تنظيف عدة. تشغيل كل من الدليل السياسي الشامل البلازميدات مميثل وغير مثيلة على 1٪ هلام DNA الاغاروز في TAE أو TBE العازلة عند 100 V لمدة 45 دقيقة لتصور (الشكل 4B).
  9. البلازميدات تخضع كل من مميثل وغير ميثليته الهضم مزدوجة مع الانزيمات تقييد المناسبة لإطلاق سراح كامل طول لوك 2 (ناقلات) وجزيرة الدليل السياسي الشامل (إدراج) شظايا 38. أداء مزدوج الهضم O / N في درجة حرارة مناسبة والإنزيمات للحرارة تعطيل التالية الهضم وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. فقدان الحد الادنى من تركيز الحمض النووي يحدث خلال تقييد مزدوج هضم.
  10. تشغيل البلازميدات يهضم ضعف في 1٪ agarose هلام DNA في 100 V لمدة 1 ساعة للسماح للانفصال سو ناقلات وإدراج (الشكل 4C). الحذر. ارتداء الأشعة فوق البنفسجية واقية درع الوجه، ووضع جل DNA على ضوء أسود الطاولة لتصور العصابات. على أساس الحجم والمكوس إدراج الميثيلي وغير ميثليته وناقلات غير ميثليته باستخدام شفرة جراحية نظيفة.
  11. هلام استخراج الحمض النووي باستخدام الفينول المشبعة، ودرجة الحموضة 6.6. لفترة وجيزة، تزن هلام DNA التي تحتوي على ناقل أو إدراج. استخدام 100 ميكرولتر من الفينول في 0.1 غرام من هلام DNA. التجانس هلام DNA في الفينول استخدام الزجاج dounce الخالط.
  12. إضافة الكلوروفورم (باستخدام 1/5 من حجم الفينول) ويهز عينات لمدة 20 ثانية. احتضان العينات في RT لمدة 2-3 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في أقصى سرعة (16.1 X 1000 x ج) في 4 درجات مئوية.
  13. إزالة محلول مائي وإضافة حجم 0.1X من 3 M خلات الصوديوم وحجم 2.5X من الايثانول. احتضان العينات لمدة 1 ساعة على -80 ° C. بعد الحضانة، وإزالة الإيثانول وإعادة تعليق الحمض النووي في 30 ميكرولتر من العازلة المفضل. خسارة كبيرة من الحمض النووي يحدث العزلة التالية من إدراج وناقلات، 30-50٪ لوق ق.
  14. إعادة ligate إدراج مميثل وغير مثيلة لغير ميثليته المتجه باستخدام T4 DNA يغاز 38. استخدام نسبة 1: 4 ناقلات لادخال لردود الفعل ربط. رد فعل الإعداد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدام الحجم الكلي لل50 ميكرولتر لردود الفعل واحتضان O / N عند درجة حرارة -20 درجة مئوية أو على الجليد مع غطاء على دلو الجليد.
  15. بعد ربط، نفذ تنظيف DNA باستخدام المفضلة، غشاء المتاحة تجاريا السيليكا جل تنظيف عدة. خسائر كبيرة في DNA تحدث بعد رد فعل ربط، وهي تقريبية فقدان 30-50٪ من الحمض النووي. التحقق من إعادة ربط كل من يعمل على 1٪ هلام DNA الاغاروز في 100 V لمدة 45 دقيقة وتقييم تركيز-ligated إعادة البلازميدات (الشكل 4D).
  16. Transfect البلازميدات ميثليته أو غير مثيلة في الخلايا D54 باستخدام كاشف ترنسفكأيشن التجاري وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. الخلايا D54 البذور على 12 لوحة جيدا في 0.14 × 10 6 خلايا / جيد.
  17. وبعد 24 ساعة، وخلايا transfect وايتركيزات متساوية عشر إما (1) البلازميد غير methyated الدليل السياسي الشامل، luc2 + Renilla أو غيرها من ناقلات السيطرة luciferase المراسل أو (2) ميثليته البلازميد الدليل السياسي الشامل، luc2 + Renilla أو غيرها من ناقلات السيطرة luciferase المراسل.
  18. تسمح للخلايا ل transfect لمدة 24 ساعة قبل إجراء المزدوج luciferase الفحص. أداء الاختبار وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أداء قراءات باستخدام luminometer. قراءة كل بئر في ثلاث نسخ.
  19. حساب نسبة اليراع luciferase النشاط إلى Renilla أو غيرها من الأنشطة السيطرة luciferase المراسل. تطبيع الميثيلي واليراع: السيطرة luciferase النشاط إلى اليراع غير ميثليته: السيطرة luciferase النشاط بتقسيم luciferase النشاط الميثيلي التي كتبها luciferase النشاط غير ميثليته

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد اكتسب السكان المخصب من الخلايا النجمية عبر FACS الفرز من EGFP-S100β الحيوانات المعدلة وراثيا 27. بسبب تدني نوعية الخلايا والجزيئات الجزيئية المعزولة من الحيوانات القديمة من بعد الولادة اليوم 50 (P50)، والحيوانات الذين تتراوح أعمارهم بين P0-P40 هي الأمثل لمثل هذه التجارب. تم استخدام الأنسجة القشرية لهذه التجارب. وكان يتم تجميع القشور من يومين إلى ستة الحيوانات معا. تم تنفيذ FACS في منشأة UAB الشامل التدفق الخلوي الأساسية. تم إجراء الفرز على بيكتون ديكنسون FacsAria II. تم الحصول على EGFP الإثارة باستخدام الليزر 488 نانومتر. لم يكن التعويض اللازم. تم استهداف عدد السكان بوابات استنادا إلى الأمام والجانب مبعثر (الشكل 1B). تم تحديد عدد الخلايا الحية باستخدام مؤشر الخلية الميتة بروميد إيثيديوم وبوابات (الشكل 1C). وقد لوحظت اثنين من السكان مختلفة استنادا إلى بيان EGFP (1D الشكل). من خلال اختبار تجريبيا، سكان الخلية مع ارتفاع EGFPوقد تم تحديد هذا الملف الشخصي طابع السكان خلية EGFP الإيجابي (الشكل 1F-F ''). وكشف التحليل البصري للسكان الثاني مع لمحة EGFP أقل شظايا خلية معربا عن EGFP، ولكن خالية من النوى، من المرجح أن يمثل الحطام من العمليات نجمي (الشكل 1G-G ''). صور الممثل فصل الخلايا النجمية إيجابية EGFP التالية التفكك ولكن قبل الفرز (الشكل 2A) وبعد الفرز يتم عرض (الشكل 2B). أظهر معزولة EGFP السكان الخلية إيجابية زيادة 40 أضعاف في ALDH1L1 مرنا، علامة محددة نجمي 39 (الشكل 2C). بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من التعبير المشتركة للS100β في NG2 + يجد OPCs والخلايا النجمية 39، لاحظنا انخفاض 4 أضعاف من NG2 مرنا، علامة للخلايا دبقية قليلة التغصن السلائف 39، مشيرا إلى عزل السكان خلية نجمي الخلايا المخصب (الشكل 2C-D). RNAوDNA معزولة عن FACS فرزها كانت الخلايا النجمية من نوعية وكمية كافية لاستخدامها في دراسات مثيلة لاحقة. يتم سرد مجموع RNA والحمض النووي معزولة عن الأعمار وعدد الحيوانات متفاوتة كمرجع للالعائد المتوقع من جزيئات الجزيئية التالية FACS (الجدول 5). وتجدر الإشارة إلى أن العائد كما تختلف بناء على عدد الحيوانات المستخدمة، وفترة الحضانة، وتجربة الباحث. يوضح الجدول 6 تقلب الأحداث اكتسبت اعتمادا على عدد الحيوانات المستخدمة وفترات الحضانة.

للدراسات مثيلة، بدءا من جودة عالية وكميات كافية من الحمض النووي الضروري لتطبيقات المصب ناجحة. لضمان تحلل كاف من الأنسجة لRNA أو استخراج الحمض النووي، وأعقب كل تجانس الأنسجة أو الخلايا عن طريق سحن باستخدام 7X 23G إبرة، مع الحرص على تجنب مزبد خلال تحلل. مرة واحدة يتم استخراج DNA ذات جودة عالية وتحويل بيسلفيتالطبعه، مناطق الفائدة يمكن أن يكون هدفا للMS-HRMA. لاحظ أنه عند تقييم جودة وتركيز الحمض النووي تحويل بيسلفيت، يجب تعيين معمل لقراءة في عامل OD من 33 كما بيسلفيت تحويل الحمض النووي هو احد الذين تقطعت بهم السبل. وتراوحت قيم 260/280 لDNA تحويل بيسلفيت 2،20-2،70.

قبل البدء في دراسات مثيلة، فمن الأهمية بمكان لتحديد ومعايرة cycler الحرارية للدراسات MS-HRMA بشكل مناسب. بالإضافة إلى ذلك، لا بد من تحديد كيفية تصدير واستخدام البيانات الخام الناتجة عن MS-HRMA. النظم البيولوجية التطبيقية عالية الدقة الانصهار الشروع استخدمت دليل للمساعدة في معايرة cycler الحرارية 7900HT. وأخيرا، تم استخراج البيانات واستيرادها إلى HRM برامج التحليل لتحليل البيانات لاحقا. كما هو مفصل في البروتوكول، ما قبل وبداية آخر، ووقف وتعيين المعلمات بالقرب من التحولات في منحنى ذوبان. استخدمت الاختلافات في درجة الحرارة الذروة لاستقراء الوضع مثيلة من سا غير معروفmples. البيانات مثيلة تقدر الحصول عليها من MS-HRMA تتوافق بشكل وثيق للبيانات مثيلة الناتجة عن pyrosequencing (ولدت البيانات pyrosequencing في المنزل باستخدام بادئات استهداف مناطق نفس الاشعال MS-HRM) (الشكل 3C) 15.

واستخدمت A luciferase الفحص المزدوج لتقييم النشاط النسخي من المناطق ميثليته المفرط من الجينات في المصالح (الشكل 4A). كان كل البلازميد الدليل السياسي الشامل الجزيرة-luc2 خطي ثم ميثليته. ومع ذلك، لأن كلا من إدراج (جزيرة الدليل السياسي الشامل) وناقلات (luc2) الميثيلي خلال رد فعل، لا بد من استئصال إدراج الميثيلي وإعادة ligate إلى ناقل غير ميثليته. بسبب التلاعب واسعة من البلازميد، تحدث خسائر كبيرة واحدة يجب أن تبدأ مع المواد انطلاق كافية. واستخدمت HpaII الهضم للتحقق من حالة مثيلة من كل البلازميد كما HpaII يساعد على هضم فقط DNA غير ميثليته (الشكل 4B). وتجدر الإشارة إلى أنإذا O / N مثيلة غير كاف، يمكن إضافة 1X إضافية من SAM و1X من الدليل السياسي الشامل methylase التالية 1 ساعة من الحضانة عند 30 درجة مئوية. تواصل O / N الحضانة بعد إضافة تكميلية SAM والدليل السياسي الشامل methylase. الجيل البلازميد الدليل السياسي الشامل الجزيرة-luc2 الميثيلي وغير ميثليته يسمح للتقييم المباشر من التغييرات بين الحامض النووي والنشاط النسخي عن طريق قياس luciferase النشاط.

الشكل 1
الشكل 1. FACS الفرز يعزل popoulation خلية EGFP +. (A) استخدام 50 مل أنبوب مخروطي الشكل مع قطع ثقب في الجزء العلوي يسمح لتبادل الغازات السطح خلال غراء الهضم. تم بوابات (B) الترتيب الخلايا استنادا إلى الأمام والجانب مبعثر المؤامرات. وقد استخدمت (C) وهو بروميد إيثيديوم مؤشر خلية ميتة استنادا إلى بوابة سكان الخلية الحية (الحمراء). (D) سل لايفتظاهر سكان ل اثنين من السكان - واحدة مع مكانة عالية EGFP (الأخضر) ونبذة EGFP منخفض (البنفسجية). لجميع الرسوم البيانية، والمحور الصادي يمثل منطقة مبعثر الجانب (SSC-A)؛ محور س يمثل الأمام منطقة مبعثر الجانب (FSC-A)، والأخضر منطقة بروتين فلوري (GFP-A)، أو إيثيديوم بروميد (EtBr). وحضنت (EG) تنفصل الخلايا مع هويشت وضعت 20 ميكرولتر من الخلايا نأت على ساترة وتصوير. وتصور (EE '') EGFP + الخلايا النجمية، مع عمليات واسعة النطاق قبل الفرز (NS). (FF '') وبعد الفرز، EGFP عالية + السكان (POS) تثبت سوما الخلية EGFP + الذي شارك في توطين مع هويشت تلطيخ. (GG '') يوضح السكانية المنخفضة EGFP EGFP + تلطيخ التي لم تشارك في توطين مع هويشت تلطيخ، من المرجح أن يمثل الحطام نجمي الخلايا (لجميع الصور، الحجم = 20 ميكرون). الرجاءانقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. FACS فرز EGFP-S100 β الحيوانات المعدلة وراثيا وتقدم السكان المخصب من الخلايا النجمية. (A) يتم عرض 20 ميكرولتر من الخلايا فصلها قبل FACS (NS)، ما زالت عمليات سليمة (مقياس = 50 ميكرون). (B) صورة الممثل بعد FACS-ترد (FACS) خلايا. تتم إزالة العمليات نجمي وبقايا سوما الخلية (مقياس = 20 ميكرون). يوضح البيانات (C) QPCR زيادة 40 أضعاف في ALDH1L1 مرنا في FACS فرز الخلايا (FACS) بالمقارنة مع السكان غير مصنفة (NS). يتم تخفيض (D) NG2 مرنا بنسبة 4 أضعاف في FACS فرز الخلايا مقارنة مع عدد السكان غير مصنفة (NS). يرجى النقر هنا ل عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. نموذج البيانات، وتحليل لدراسات MS-HRM. (A) مثال من المؤامرات الفرق في درجة الحرارة المتولدة من المعايير مثيلة. وصفت المقابلة في المئة مثيلة لكل منحنى (B) مثال على معادلة الانحدار الخطي ولدت من المعايير الفئران ميثليته. (C) مقارنة مثيلة في المئة المكتسبة من pyrosequencing (pyroseq والحانات الخضراء) وMS-HRMA (القضبان الرمادية) توضح مستويات مماثلة من مثيلة في مناطق مختلفة من KCNJ10. البيانات Pyrosequencing ولدت في منزل باستخدام بادئات استهداف مناطق نفس MS-HRM تحليل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

خيمة "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الرقم 4
الرقم 4. المزدوج luciferase الفحص يسمح لتقييم النشاط النسخي من المناطق الجين ميثليته تفاضلي. (A) رسم تخطيطي لluciferase المراسل النسخي النشاط فحص يوضح سير العمل في البروتوكول. يعرض (B) هلام DNA الاختلافات في مميثل مقابل البلازميدات غير ميثليته التالية الهضم HpaII. يتم هضم الحمض النووي غير ميثليته بسهولة بعد هضم HpaII مقارنة الحمض النووي ميثليته، مما يدل على نجاح مثيلة الحمض النووي البلازميد. (C) هلام DNA يوضح الفصل بين ناقلات من إدراج التالية الهضم مزدوج. بعد الانفصال DNA، وناقلات إدراج هي جل استخراج. (D) جل DNA يوضح نجاح إعادة ربط للناقلات وإدراج. البلازميد ligated إعادة تمتلك مماثل الوزن الجزيئي كما البلازميد غير المعالجة (untx). NM، غير اجتمع-hylated. M، مميثل. RL، وإعادة ligated. untx، دون علاج. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

. الحجم (ميكرولتر) X3 + 10٪ زيادة س # العينات
MeltDoc MM 10 ميكرولتر 33 ميكرولتر
التمهيدي 1 1.2 ميكرولتر 3.96 ميكرولتر
التمهيدي 2 1.2 ميكرولتر 3.96 ميكرولتر
gDNA 1 ميكرولتر ---
2 درهم 0 6.6 ميكرولتر 21.78 ميكرولتر

الجدول 1. حساب عينة من MeltDoctor Mastermix. تشغيل كل الجرمية MS-HRMction في ثلاث نسخ مع 10٪ زيادة للتعويض عن الخطأ pipetting ل. العمود الأخير إلى حساب اللازمة لأرقام متعددة من العينات. الحجم الإجمالي لكل رد فعل 20 ميكرولتر.

دورة درجة الحرارة (° C) الوقت (ثانية) معدل المنحدر (٪)
95 درجة مئوية : 15 100
40X 95 درجة مئوية : 15 100
60 درجة مئوية : 60 100
المعلمات ذوبان 95 درجة مئوية : 10 100
60 درجة مئوية : 60 100
95 درجة مئوية : 15 1
60 درجة مئوية : 15 100
عقد 4 76؛ C

الجدول 2: بروتوكول عينة لتضخيم تفسد العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة تليها 40 دورات من التضخيم وتوليد منحنى ذوبان. يتم سرد المعلمات ذوبان داخل الجدول. ملاحظة التغير في أسعار المنحدر الذي يسمح لاقتناء عالية درجة الحرارة قرار ذوبان.

في المئة مثلأيشن (الجرذ قياسي) ذروة الفرق في درجة الحرارة
ذ س
0 5.670116
5 10.70448
10 15.5044
25 25.52295
50 34.43047
75 43.80894
100 53.88717
يسمى الإقليم الشمالي "> الجدول 3. مثال من البيانات الفرق في درجة الحرارة الذروة. معيار النسبة مثيلة كما ذ-تنسيق. هو المسمى بيانات الفرق في درجة الحرارة الذروة كما X-تنسيق. وقد اكتسبت الذروة التمثيلية البيانات الفرق في درجة الحرارة باستخدام MS-HRM من منطقة جين واحد.

ذروة الحرارة الفرق مثيلة يقدر
X Y
عينة 1 (ن = 4)
47،450 81،115
46،292 78،657
41،694 68،894
47،292 80،779
نموذج 2 (ن = 4)
29،925 43،904
24،269 31،894
25،061 33،575
25،389 34،272

يستخدم الجدول 4. مثال على احتساب مثيلة المقدرة في المئة. الفرق في درجة الحرارة ذروة عينات من حالة مثيلة غير معروف لتقدير المئة مثيلة باستخدام معادلة الانحدار الخطي. ، وتظهر بيانات تمثيلية من ظرفين مختلفين، نموذج 1 ونموذج 2. ن = 4 لكل حالة.

سن عدد الحيوانات مجموع RNA (نغ) مجموع الحمض النووي (نغ)
P4-P10 3-6 455-868 265-1523
P19-P22 1-2 220-680 583-1483
P40-P50 3-4 198-260 578-1700

الجدول 5. إجمالي RNA والحمض النووي تم الحصول عليها من FACS فرز الخلايا. العمر وعدد الحيوانات المستخدمة في كرة القدميتم سرد التجارب CS. ملاحظة، واستخدمت كل من القشور لكل N. إجمالي RNA، وهي مدرجة DNA كمرجع للالعائد المتوقع.

سن عدد الحيوانات نقاط البيع الأحداث NEG الأحداث فترة حضانة (عند 37 درجة مئوية)
P26 1 2.18X10 ^ 6 1.15X10 ^ 6 20:00 دقيقة
P26 2 4.4X10 ^ 6 2.78X10 ^ 6 20:00 دقيقة
P26 2 9.2X10 ^ 6 3.3X10 ^ 6 30:00 دقيقة

الجدول 6. عدد من الأحداث تم الحصول عليها من FACS في يوم ما بعد الولادة 26. وفي عدد P26 من الإيجابية (EGFP +) الأحداث والأحداث السلبية يختلف باختلاف عدد الحيوانات المستخدمة وفترة الحضانة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150
AllPrep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204
Methyl Primer Applied Biosystems online software to localize CpG Islands
EZ DNA methylation Kit Zymo Research D5001
Rat Premixed Calibration Standard EpiGenDx 80-8060R-Premix
CpG Methylase (M.Sssl) Zymo Research E2010
QIAquick Gel Extraction  QIagen 28704 Used for gel extraction and DNA cleanup
Restriction enzymes New England BioLabs
NEB cutter New England BioLabs online verify restriction digest sites
Dual Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Luc2 vector, pGL4.10 Promega E6651
renilla vector, pGL4.74 Promega E2241
TD-20/20 Luminometer Turner Designs
Lipofectamine LTX and Plus Reagent Life Technologies A12621
Phenol, saturated pH 6.6/6.9 Fisher Scientific BP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer ThermoScientific
MeltDoctor Master Mix Life Technologies 4415440
High Resolution Melt (HRM) Software v2.0 Life Technologies 4397808
AB SDS software v2.3 Life Technologies online
AB High Resolution Melting Getting Started Guide  Life Technologies online
AB 7900HT Fast Real-Time System Life Technologies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16 (1), 6-21 (2002).
  2. Deaton, A. M., Bird, A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25, 1010-1022 (2011).
  3. Lorincz, M. C., Dickerson, D. R., Schmitt, M. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells. Nat Struct. Mol Biol. 11 (11), 1068-1075 (2004).
  4. Moore, L. D., Le, T. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacol. 38, 23-38 (2013).
  5. Santos, K. F., Mazzola, T. N. The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Braz.J.Med.Biol.Res. 38 (10), 1531-1541 (2005).
  6. Day, J. J., Sweatt, J. D. Cognitive neuroepigenetics: a role for epigenetic mechanisms in learning and memory. Neurobiol. Learn.Mem. 96, 2-12 (2011).
  7. Denk, F., McMahon, S. B. Chronic pain: emerging evidence for the involvement of epigenetics. Neuron. 73, 435-444 (2012).
  8. Endres, M., et al. DNA methyltransferase contributes to delayed ischemic brain injury. J. Neuroscience. 20 (9), 3175-3181 (2000).
  9. Qureshi, I. A., Mehler, M. F. Emerging role of epigenetics in stroke: part 1: DNA methylation and chromatin modifications. Arch.Neurol. 67, 1316-1322 (2010).
  10. Tian, R., et al. disease mutant glial fibrillary acidic protein compromises glutamate transport in astrocytes. J Neuropathol. Exp Neurol. 69, 335-345 (2010).
  11. Perisic, T., Holsboer, F., Rein, T. The CpG island shore of the GLT-1 gene acts as a methylation-sensitive enhancer. Glia. 60 (9), 1345-1355 (2012).
  12. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  13. Poopalasundaram, S., et al. Glial heterogeneity in expression of the inwardly rectifying K+ channel, Kir4.1, in adult rat CNS. Glia. 30, 362-372 (2000).
  14. Hibino, H., Fujita, A., Iwai, K., Yamada, M. Differential assembly of inwardly rectifying K+ channel subunits. Kir4.1 and Kir5.1, in brain astrocytes. 279, 44065-44073 (2004).
  15. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  16. Li, L., Head, V. Identification of an inward rectifier potassium channel gene expressed in mouse cortical astrocytes. Glia. 33, 57-71 (2001).
  17. Kucheryavykh, Y. V., et al. Downregulation of Kir4.1 inward rectifying potassium channel subunits by RNAi impairs potassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes. Glia. 55 (3), 274-281 (2007).
  18. Djukic, B., Casper, K. B., Philpot, B. D., Chin, L. S. Conditional knock-out of Kir4.1 leads to glial membrane depolarization, inhibition of potassium and glutamate uptake, and enhanced short-term synaptic potentiation. J. Neuroscience. 27, 11354-11365 (2007).
  19. Fujita, A., et al. Clustering of Kir4.1 at specialized compartments of the lateral membrane in ependymal cells of rat brain. Cell Tissue Res. 359 (2), 627-634 (2015).
  20. MacFarlane, S. N., Sontheimer, H. Electrophysiological changes that accompany reactive gliosis in vitro. J Neuroscience. 17 (19), 7316-7329 (1997).
  21. Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R. Impaired K(+) homeostasis and altered electrophysiological properties of post-traumatic hippocampal glia. J. Neuroscience. 19 (18), 8152-8162 (1999).
  22. Anderova, M., et al. Voltage-dependent potassium currents in hypertrophied rat astrocytes after a cortical stab wound. Glia. 48 (4), 311-326 (2004).
  23. Olsen, M. L., Campbell, S. C., McFerrin, M. B., Floyd, C. L. Spinal cord injury causes a wide-spread, persistent loss of Kir4.1 and glutamate transporter 1: benefit of 17 beta-oestradiol treatment. Brain. 133, 1013-1025 (2010).
  24. Koller, H., Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Time course of inwardly rectifying K(+) current reduction in glial cells surrounding ischemic brain lesions. Brain Res. 872, 1-2 (2000).
  25. Bordey, A., Lyons, S. A., Hablitz, J. J. Electrophysiological characteristics of reactive astrocytes in experimental cortical dysplasia. J Neurophysiol. 85 (4), 1719-1731 (2001).
  26. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P. plating, and maintenance of cortical astrocyte cultures. 8, Cold Spring. 10-1101 (2009).
  27. Itakura, E., et al. Generation of transgenic rats expressing green fluorescent protein in S-100beta-producing pituitary folliculo-stellate cells and brain astrocytes. Endocrinology. 148, 1518-1523 (2007).
  28. Foo, L. C. Purification of astrocytes from transgenic rodents by fluorescence-activated cell sorting. Cold Spring Harb.Protoc. 2013, 551-560 (2013).
  29. Smith, C., Otto, P., Bitner, R. A silica membrane-based method for the isolation of genomic DNA from tissues and cultured cells. CSH. Protoc. 2006, 2006-201 (2006).
  30. Sambrook, J., Russell, D. W. A Single-step Method for the Simultaneous Preparation. of DNA, RNA, and Protein from Cells and. 1, 2006-201 (2006).
  31. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K. Quantitation of DNA and. , (2007).
  32. Zhao, Z., Han, L. CpG islands: algorithms and applications in methylation studies. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 643-645 (2009).
  33. Srivastava, G. P., Guo, J., Shi, H. PRIMEGENS-v2: genome-wide primer design for analyzing DNA methylation patterns of CpG islands. Bioinformatics. 24, 1837-1842 (2008).
  34. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J.Vis.Exp.(56), doi:3170 [pii];10.3791/3170. , (2011).
  35. Drummond, G. B., Vowler, S. L. Categorized or continuous? Strength of an association-and linear regression. Adv.Physiol Educ. 36, 89-92 (2012).
  36. Sambrook, J., Russell, D. W. The basic polymerase chain reaction. CSH.Protoc. 1, (2006).
  37. Arpa, P. Strategies for cloning PCR products. Cold Spring Harb.Protoc. 8, (2009).
  38. Makovets, S. Basic DNA electrophoresis in molecular cloning: a comprehensive guide for beginners. Methods Mol.Biol. 1054, 11-43 (2013).
  39. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neuroscience. 28, 264-278 (2008).
  40. Maldonado, P. P., Velez-Fort, M., Levavasseur, F. Oligodendrocyte precursor cells are accurate sensors of local K+ in mature gray matter. J Neuroscience. 33, 2432-2442 (2013).
  41. Kalsi, A. S., Greenwood, K., Wilkin, G. Kir4.1 expression by astrocytes and oligodendrocytes in CNS white matter: a developmental study in the rat optic nerve. J.Anat. 204, 475-485 (2004).
  42. Higashi, K., et al. An inwardly rectifying K(+) channel, Kir4.1, expressed in astrocytes surrounds synapses and blood vessels in brain. Am.J.Physiol Cell Physiol. 281 (3), (2001).
  43. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  44. Neusch, C., Rozengurt, N., Jacobs, R. E., Lester, H. A. Kir4.1 Potassium Channel Subunit Is Crucial for Oligodendrocyte Development and In Vivo Myelination. J. Neuroscience. 21 (15), 5429-5438 (2001).
  45. Kofuji, P., et al. Genetic Inactivation of an Inwardly Rectifying Potassium Channel (Kir4.1 Subunit) in Mice: Phenotypic Impact in Retina. J. Neuroscience. 20 (15), 5733-5740 (2000).
  46. Kofuji, P., Connors, N. C. Molecular substrates of potassium spatial buffering in glial cells. Mol.Neurobiol. 28, 195-208 (2003).
  47. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  48. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high-resolution melting. Nat.Protoc. 3, 1903-1908 (2008).
  49. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res. 35, 10-1093 (2007).
  50. Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nat.Rev.Genet. 11, 191-203 (2010).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 103، الحامض النووي، MS-HRMA، luciferase المراسل المروج الفحص، FACS، النجمية، Kir4.1،
ربط الجينات المحددة الحامض النووي التغييرات مع التعبير والترانسكربتي آخر من نجمي<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nwaobi, S. E., Olsen, M. L.… More

Nwaobi, S. E., Olsen, M. L. Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1). J. Vis. Exp. (103), e52406, doi:10.3791/52406 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter