Protocol
所有动物均按照健康准则全国学院处理。动物护理和使用委员会在阿拉巴马大学伯明翰分校批准的动物使用。
1.使用荧光激活细胞从全脑组织排序星形胶质细胞（FACS）从富集的星形胶质细胞人口获得的RNA和DNA
- 稳重动物用CO 2 1分钟，然后迅速斩首。在阿尔布开克等人解剖皮层，26。这是没有必要去除脑膜。
注：表示在S100β绿色荧光蛋白（星形胶质细胞标记物）子转基因大鼠由板仓等 27产生和利用的星形胶质细胞的FACS分选。 - 使用根据制造商的协议在非无菌条件下用木瓜蛋白酶的解离试剂盒制备全脑匀浆。在水浴热激活的木瓜蛋白酶在37℃下进行10分钟。注意：木瓜蛋白酶溶液通过制造商提供，并包含L-半胱氨酸和EDTA（见表材料）。
- 切割或DREMEL空穴到50毫升锥形管的顶部，以允许管道携带95％O 2：5％的CO 2被送入一个封闭的圆锥管（图1A）。放置在10毫米培养皿含有解离媒体解剖皮层（MEM补充有20mM的葡萄糖和青霉素/链霉素（500U / ml）和平衡至95％O 2，5％CO 2），并使用干净的刀片剁碎组织成1- ×1毫米2件 。
- 用10ml手册的Pipetman至50ml锥形管含有木瓜蛋白酶溶液转移组织。让组织来履行，以尽量减少分离介质的结转额前下沉到移液管的底部。保持平衡至95％ 的 O 2的木瓜蛋白酶溶液：5％的CO 2经由该孵育期间表面气体交换。不要泡木瓜蛋白酶soluti上。孵育组织为在37℃水浴20分钟。
- 孵育后在木瓜蛋白酶溶液，磨碎的组织的10倍以低速10ml的移液管。离心浑浊细胞悬浮液在1000×g离心5分钟，室温。
- 平衡经由表面气体交换的DNase /白蛋白抑制剂溶液（由制造商提供的），并在3ml的DNA酶/清蛋白抑制剂溶液重新悬浮沉淀的细胞。制备商业不连续密度梯度依照制造商的指令。
- 自旋不连续密度梯度，在1000×g离心6分钟。通过抽吸底部沉淀用吸管隔离管的底部离解的细胞。
- 重悬离解的细胞在2-3毫升的DPBS用0.02％牛血清白蛋白和1毫克/毫升DNA酶或缓冲培养基优选HEPES。流式细胞仪（ 图2A），然后通过40微米的过滤器传递。保持细胞在冰上，直到排序。
- 执行流式细胞仪28。</ LI>
- 沉淀细胞在1.5ml的离心管中，在2000×g离心5分钟，在4℃。
注意：丸粒化星形胶质细胞可以立即使用或保存在-80℃直至DNA提取。
- RNA和DNA使用优选的分离方法29 30提取。通过分光光度计和生物分析仪31评估RNA和DNA的浓度和质量。
注意：利用仅高质量RNA和DNA在随后的步骤中，260个/ 280个= 2.0-2.2和1.8-1.9，分别。生物分析仪分析是必不可少的，以评估RNA降解或DNA片段。 RNA或DNA可以立即使用或储存于-80℃或-20℃，分别用于随后的研究。
2.评估使用甲基化敏感高分辨率熔解分析（MS-HRMA）的基因的DNA甲基化状态
- 进入首选网上甲基化地图软件感兴趣的基因序列，以识别任何CpG岛的基因关注32。
- 亚硫酸氢盐对设计的引物转化DNA序列33和扩增按照制造商的方案使用优选的DNA聚合酶。通过运行在100伏的1％琼脂糖凝胶的DNA 45分钟确认扩增产物的大小。商店引物储备浓度20μM的在-20℃。
- 亚硫酸氢盐转化500-1000毫微克的每个样品和甲基化DNA的标准范围从0-100％来自同一动物种类34的DNA。洗脱样本以提供20毫微克/微升的浓度。通过分光光度计31验证的亚硫酸氢盐转化的DNA浓度。
- 设置20微升反应为根据表1和2使用优选的DNA聚合酶和引物在5微米浓度的MS-HRM扩增。运行所有的样品，包括流式细胞仪DNA和甲基化的标准，以一式三份。
- 根据分析软件，设置前置和后置启动和停止参数周围的熔解曲线的过渡。组预先熔融开始和预熔融停止参数，使两者之间的差为0.2 - 0.5℃。设置后开始融化，后熔停止类似。提取峰值温度的差数据的每个样本。
- 使用百分之甲基标准（y值）和它们的相应的平均峰温度差（x值）生成的线性回归方程（图3A-B，表3-4）。使用该线性回归方程来估算未知样品35的甲基化状态。
3.通过使用荧光素酶测定的评估超甲基化的启动子活性
- 确定目标基因（步骤2.1）的CpG岛。 PCR扩增感兴趣36和克隆区域luc2萤火虫萤光素酶报道基因的上游，以产生的CpG岛luc2质粒37。
- 线性化30微克的通过限制的CpG岛luc2质粒酶消化38。验证网站的限制消化，避免使用首选刀具软件38双削减。热灭活根据制造商的协议如下消化在适当的温度和持续时间的酶。在线性化步骤是DNA的损失降到最低。
- 使用的CpG甲基化酶（M.Sssl）O / N在30°C或将未经处理的，按照制造商的协议，除了以下调整甲醇线性质粒。
- 执行50微升反应。
- 使用5个单位的CpG甲基对甲基化700纳克线性化的质粒。
- 运行反应O / N为13-19小时。
- 以下的CpG甲基化酶反应，使用标准的，根据制造商的协议市售硅胶膜上清理试剂盒进行DNA的清理。 DNA的显著损耗发生以下的CpG甲基化酶反应，30-60％的损失。
- 通过中Hpa II酶切验证质粒甲基化。 取1微克的甲基化或非甲基化DNA和限制在37℃下消化用的Hpa II 1小时。使用5-10个单位的Hpa II为每微克DNA。继中Hpa II消化，使用的是首选，市售的硅胶膜清洁套装进行DNA清理。运行在100V在TAE或TBE缓冲液的1％琼脂糖凝胶的DNA在两个CpG的甲基化和非甲基化的质粒45分钟进行可视化（图4B）。
- 受试者都甲基化和非甲基化的质粒双重消化用合适的限制性酶释放的全长的luc 2（矢量）和CpG岛（插入） 片 38。以下，根据制造商的协议消化进行双酶切O / N在适当的温度和热灭活酶。在双酶切出现DNA浓度的损失降到最低。
- 运行在1％琼脂糖凝胶双酶切质粒在100V 1小时，以允许分离ö˚F载体和插入（图4C）。注意事项。戴防护紫外线面罩，放置在桌面黑光DNA凝胶可视化的乐队。基于大小，消费甲基化和非甲基化的插入和非甲基化的载体用干净的手术刀。
- 凝胶提取DNA用饱和酚，pH值6.6。简单地说，衡量含载体或插入DNA凝胶。用100微升苯酚每0.1克DNA凝胶。用玻璃Dounce匀浆均质DNA凝胶苯酚。
- 加氯仿（以苯酚量的1/5），并摇动样品20秒。孵育的样品在RT 2-3分钟。离心15分钟以最大速度（16.1×1,000 XG）在4℃。
- 除去水溶液，并添加3M乙酸钠和乙醇2.5X体积0.1X体积。孵育样品1小时，在-80℃下。孵育后，除去乙醇并于30μl优选缓冲液重悬的DNA。 DNA的显著损失发生的插入和载体以下隔离，30-50％LOSS。
- 再结扎甲基化和非甲基化的插入物，使用T4 DNA连接酶38未甲基矢量。使用1：4的比例矢量的插入用于连接反应。根据制造商的说明书设置反应。使用50微升的总体积的反应和孵化O / N在-20°C或在冰上用盖在冰桶。
- 连接后，使用的是首选，市售的硅胶膜清洁套装进行DNA清理。的DNA显著损失发生以下的连接反应，DNA的近似30-50％的损失。验证重新结扎通过在1％琼脂糖凝胶的DNA 45分钟运行，在100 V和评估的重新连接质粒（图4D）的浓度。
- 染甲基化或非甲基化的质粒导入使用根据制造商的协议的市售的转染试剂D54细胞。种子D54细胞到12孔板，在一个0.14×10 6个细胞/孔。
- 继24小时，转染细胞无线个相等的浓度，无论（1）非methyated CpG的luc2质粒+海肾或其他控制荧光素酶载体或（2）甲基化的CpG-luc2质粒+海肾或其他控制荧光素酶载体。
- 让细胞进行双荧光素酶检测前转24小时。根据制造商的说明进行检测。执行用光度计读数。一式三份阅读每口井。
- 计算萤火虫荧光素酶活性的比为海肾或其他控制的荧光素酶的活性。通过将甲基化荧光素酶活性非甲基化的荧光素酶控制的荧光素酶：规范化甲基化萤火虫：控制荧光素酶的活性，以非甲基化的萤火虫
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Representative Results
经由的eGFP-S100β转基因动物27的 FACS分选被收购的星形胶质细胞的富集群。由于降低年龄P0-P40细胞和年龄超过出生后第50天（P50）动物中分离分子的分子，动物的质量是最适合这样的实验。皮质组织被用于这些实验。从两个到六个动物皮质合并在一起。流式细胞仪在UAB综合流式细胞仪核心设施进行。在Becton Dickinson公司FacsAria II进行排序。采用488 nm激光获得绿色荧光蛋白的激励;没有补偿是必要的。基于前向和侧向散射（ 图1B）门控人口目标。阿活细胞群体，用溴化乙锭死细胞指示器确定和门（图1C）。基于所述的eGFP轮廓（ 图1D），观察两个不同的种群。通过经验性测试，细胞群更高的eGFP信息被确定为的eGFP阳性细胞群体（图1F-F''）。第二群体与低级eGFP的轮廓的视觉分析显示表达eGFP的细胞碎片，但不含细胞核，可能代表来自星形细胞过程（ 图1G-G''）碎片。解离的eGFP阳性星形细胞的以下的解离的代表性图像，但之前的分选（ 图2A）和分选（ 图2B）示出后。孤立的eGFP阳性细胞群表现出40倍的增加的mRNA ALDH1L1，一个星形细胞特异性标记物39（图2C）。此外，尽管S100β的NG2 + OPCs的星形胶质细胞和39共享表达，我们观察到4倍的降低NG2 mRNA的，标记为少突胶质细胞前体细胞39，说明富集星形细胞的细胞群体（图2C-D）的隔离。 RNA和DNA从分离的FACS分类的星形胶质细胞的足够质量和数量，以用于后续甲基化研究。总RNA和DNA从不同年龄和动物的数目分离被列为分子分子以下的FACS（表5）预测合格率的基准。应当指出的是，产率也将变化的基础上的动物使用的，潜伏期，和研究者的经验。 表6表明根据动物使用和潜伏期的一些事件的变异性获得的。
对于甲基化研究，开始以高品质和足够数量的DNA是成功的下游应用是必不可少的。以确保组织充分裂解为RNA或DNA提取，组织或细胞的所有均质化使用23G针7倍，同时注意避免裂解过程中起泡，随后通过研磨。一旦高品质的DNA提取和亚硫酸氢转换版，感兴趣的区域可以有针对性的MS-HRMA。需要注意的是评估和质量的亚硫酸氢盐转化的DNA的浓度时，分光光度计应设置为读取在33的OD因子如亚硫酸氢盐转化的DNA是单链的。 260/280值亚硫酸氢盐转化的DNA介于2.20-2.70。
之前开始甲基化研究，关键是要适当地选择和校准的MS-HRMA研究的热循环仪。此外，必须确定如何导出和使用从MS-HRMA生成的原始数据。 美国应用生物系统高分辨率熔解入门指南被用于帮助校准7900HT热循环仪。最后，数据提取并导入到HRM分析软件进行随后的数据分析。详见协议，前后的启动和停止参数设定接近熔解曲线的过渡。峰温度的差异被用来推断未知Sa的甲基化状态mples。从MS-HRMA获得估计甲基化数据密切对应于从焦磷酸测序产生的甲基化数据（焦磷酸测序数据在内部使用靶向相同的区域的MS-HRM引物的引物产生）（图3C）15。
双萤光素酶测定法用于评估感兴趣（图4A）的基因的超甲基化区域的转录活性。每一个的CpG岛luc2质粒线性化，然后甲基化。但是，由于这两个插入物（CpG岛）和载体（luc2）在反应过程中被甲基化，就必须切除甲基化插入件和重新结扎到非甲基化载体。由于大量操纵质粒，出现显著损失，必须首先足够的原料。的HpaⅡ消化用来验证每个质粒的甲基化状态为HpaII的消化仅非甲基化DNA（图4B）。应当指出的是如果O / N甲基化不足，SAM的和1x的CpG甲基化酶的另外1个可加入以下1小时的温育在30℃。继续O / N培养下加入补充SAM和CpG甲基化酶。甲基化和非甲基化的CpG岛-luc2质粒代允许DNA甲基化和转录活性之间的变化通过萤光素酶活性的测量直接评估。
图1. FACS分选分离绿色荧光蛋白+细胞popoulation。（A）使用50毫升的锥形管，孔切顶部允许木瓜蛋白酶消化过程中表面气体交换。 （B）的分选的细胞是基于前向和侧向散点图门控。 （C）一种溴化乙锭基于死细胞指示剂用于栅极的活细胞群（红色）。 （四）现场CEL升人口表明两个种群 - 一个具有高的eGFP轮廓（绿色）和低的eGFP轮廓（紫色）。对于所有的图表，y轴表示侧向散射面积（SSC-A）; x轴表示前侧散射区域（FSC-A）中，绿色荧光蛋白区域（GFP-A）中，或溴化乙锭（EtBr的）。 （EG）解离细胞孵育用Hoechst和20μl解离的细胞置于盖玻片和成像。 （EE''），绿色荧光蛋白+星形胶质细胞，具有广泛的进程排序（NS），然后进行观察。 （FF'）经过分拣，高绿色荧光蛋白+人口（POS）展示绿色荧光蛋白+细胞胞体其共定位与Hoechst染色。 （GG''）低绿色荧光蛋白人口展示了绿色荧光蛋白+染色而没有共定位与Hoechst染色，可能较星形细胞碎片（所有图像，规模= 20微米）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. FACS的eGFP-S100β转基因动物的排序提供星形细胞的富集群。（A）的20微升解离的细胞的FACS（NS）之前被示出，过程保持不变（标度= 50微米）。 （B）的代表性的图像后的FACS（FACS）细胞被示出;星形胶质细胞的过程被删除，胞体遗迹（规模= 20微米）。 （C）的qPCR数据表明相比没有排序人口（NS）的40倍增加ALDH1L1 mRNA的FACS分选的细胞（FACS）。 （四）NG2表达减少了4倍FACS分选的细胞相比，没有排序人口（NS）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.数据和分析为MS-HRM研究，从甲基化的标准产生的温差地块（A）为例。相应百分比的甲基化标记为从大鼠甲基化的标准生成线性回归方程的每个曲线（B）的实施例。从焦磷酸测序（pyroseq，绿柱线）和MS-HRMA（灰色条）所获得的百分比甲基化（C）的比较表明甲基化水平相似的不同地区KCNJ10的。使用靶向相同的区域MS-HRM引物内部产生的焦磷酸测序数据分析， 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.双荧光素酶测定允许差异甲基化基因区域的转录活性的评估。对荧光素酶转录活性测定（A）图说明协议的工作流程。在甲基化与未甲基化的质粒以下的HpaⅡ消化（B）的 DNA凝胶显示差异。非甲基化的DNA可容易地消化以下的HpaⅡ消化相比甲基化的DNA，证实DNA质粒的成功甲基化。 （ 三）DNA凝胶演示从插入下面的双酶切载体的分离。下列DNA分离，载体和插入的凝胶中提取。 （ 四）DNA凝胶展示了成功的重新连接载体和插入的。重新连接质粒具有类似分子量为未处理质粒（UnTx上）。 NM，非会见hylated;男，甲基化; RL，再连接; UnTx上，未经处理的。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 。 | 卷（微升） | ×3 + 10％过量 | x＃样品 |
| MeltDoc MM | 10微升 | 33微升 | |
| 底漆1 | 1.2微升 | 3.96微升 | |
| 底漆2 | 1.2微升 | 3.96微升 | |
| 基因组DNA | 1微升 | --- | |
| 卫生署2 0 | 6.6微升 | 21.78微升 |
表1.样本计算MeltDoctor反应体系的。每个运行MS-HRM REAction一式三份，用10％过量，以弥补移液错误。最后一列表示需要多个号码样品的计算。总体积为每个反应是20微升。
| 周期 | 温度（℃） | 时间（秒） | 斜坡率（％） |
| 95℃ | ：15 | 100 | |
| 40X | 95℃ | ：15 | 100 |
| 60℃ | ：60 | 100 | |
| 熔参数 | 95℃ | ：10 | 100 |
| 60℃ | ：60 | 100 | |
| 95℃ | ：15 | 1 | |
| 60℃ | ：15 | 100 | |
| 抱 | 4 76的温度 |
表2：用于扩增样品协议变性样品在95℃下进行10分钟，随后扩增熔解曲线的产生的40个循环。熔化参数列表内。注意改变升温速率，允许收购高分辨率熔解温度。
| 百分比甲基化（鼠标） | 峰值温度差 |
| ÿ | x |
| 0 | 5.670116 |
| 五 | 10.70448 |
| 10 | 15.5044 |
| 25 | 25.52295 |
| 50 | 34.43047 |
| 75 | 43.80894 |
| 100 | 53.88717 |
| 峰值温度差异 | 预计甲基化 |
| X | ÿ |
| 样品1（4例） | |
| 47.450 | 81.115 |
| 46.292 | 78.657 |
| 41.694 | 68.894 |
| 47.292 | 80.779 |
| 样品2（N = 4） | |
| 29.925 | 43.904 |
| 24.269 | 31.894 |
| 25.061 | 33.575 |
| 25.389 | 34.272 |
表计算估计％的甲基化4例。不明的甲基化状态样品的峰值温度差时采用线性回归方程来估算％的甲基化。从两个不同的条件下，样品1和样品2的代表性数据，示出; n = 4时为每个条件。
| 龄 | 动物的数目 | 总RNA（NG） | 总DNA（NG） |
| P4-P10 | 3-6 | 455-868 | 265-1523 |
| P19-P22 | 1-2 | 220-680 | 583-1483 |
| P40-P50 | 3-4 | 198-260 | 578-1700 |
表5总RNA和DNA从FACS获得的分选的细胞。年龄和使用的FA的动物数CS实验上市。注意，无论是皮质用于每一奈瑟总RNA和DNA被列为预期收率的参考。
| 龄 | 动物的数目 | 波什活动 | NEG活动 | 孵育时间（37℃） |
| P26 | 1 | 2.18X10 ^ 6 | 1.15X10 ^ 6 | 20:00分 |
| P26 | 2 | 4.4X10 ^ 6 | 2.78X10 ^ 6 | 20:00分 |
| P26 | 2 | 9.2X10 ^ 6 | 3.3×10 ^ 6 | 30:00分 |
从流式细胞仪获得在26日龄时的正（+ eGFP的）事件和负面事件的p26 数量的事件表6数量取决于动物使用和潜伏期的数目。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| Methyl Primer | Applied Biosystems | online | software to localize CpG Islands |
| EZ DNA methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Rat Premixed Calibration Standard | EpiGenDx | 80-8060R-Premix | |
| CpG Methylase (M.Sssl) | Zymo Research | E2010 | |
| QIAquick Gel Extraction | QIagen | 28704 | Used for gel extraction and DNA cleanup |
| Restriction enzymes | New England BioLabs | ||
| NEB cutter | New England BioLabs | online | verify restriction digest sites |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Luc2 vector, pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| renilla vector, pGL4.74 | Promega | E2241 | |
| TD-20/20 Luminometer | Turner Designs | ||
| Lipofectamine LTX and Plus Reagent | Life Technologies | A12621 | |
| Phenol, saturated pH 6.6/6.9 | Fisher Scientific | BP 17501-100 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer | ThermoScientific | ||
| MeltDoctor Master Mix | Life Technologies | 4415440 | |
| High Resolution Melt (HRM) Software v2.0 | Life Technologies | 4397808 | |
| AB SDS software v2.3 | Life Technologies | online | |
| AB High Resolution Melting Getting Started Guide | Life Technologies | online | |
| AB 7900HT Fast Real-Time System | Life Technologies |
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