Protocol
Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Richtlinien behandelt. Die Animal Care und Verwenden Committee an der Universität von Alabama in Birmingham genehmigte Tierversuche.
1. Erhalten RNA und DNA aus einer Enriched Astrozytäre Bevölkerung mit Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) von Astrozyten aus Whole Brain Tissue
- Sedate Tier mit CO 2 für 1 Minute und dann schnell zu enthaupten. Sezieren Kortex wie in Albuquerque et al,. 26; es ist nicht notwendig, Meningen entfernen.
Hinweis:. Transgenen Ratten exprimieren eGFP unter der S100β (eine Astrozyten Marker) Promotors wurden durch Itakura et al 27 erzeugt und für die FACS-Sortierung von Astrozyten verwendet. - Vorbereitung ganze Gehirnhomogenisat mit einer Papain-Kit Dissoziation unter nicht-sterilen Bedingungen nach dem Protokoll des Herstellers. Wärme aktivieren Papain bei 37 ° C in einem Wasserbad für 10 min. Hinweis:Papain-Lösung wird durch den Hersteller zur Verfügung gestellt und enthält L-Cystein und EDTA (Siehe Tabelle der Materialien).
- Geschnitten oder Dremel ein Loch in der Spitze einer 50 ml konischen Röhrchen Rohrtrag 95% O 2 zu ermöglichen: 5% CO 2 in einem geschlossenen konischen Röhrchen zugeführt werden (1A). Platzieren seziert cortices in 10 mm Kulturschale enthaltend Dissoziation Medium (MEM mit 20 mM Glucose und Penicillin / Streptomycin (500 U / ml) ergänzt und 95% O äquilibriert 2: 5% CO 2) und mit einem sauberen Rasierklinge Gewebe in 1 Hackfleisch x 1 mm 2 Stück.
- Mit 10 ml Hand Pipetman zu 50 ml konische Röhrchen mit Papainlösung Transfergewebe. Erlauben Gewebe zur Unterseite der Transferpipette vor dem Entladen, um die Menge der Dissoziation Medien übertragenen minimieren begleichen. Halten Papainlösung zu 95% O 2 äquilibriert: 5% CO 2 über die Oberfläche der Gasaustausch für die Dauer der Inkubation. Nicht Blase Papain solutiam. Inkubieren Gewebe für 20 Minuten in 37 ° C Wasserbad.
- Nach der Inkubation in Papainlösung, triturate Gewebe 10mal mit 10 ml Transferpipette mit langsamer Geschwindigkeit. Zentrifuge trübe Zellsuspension bei 1.000 g für 5 min bei RT.
- Äquilibrieren DNase / Albumin-Inhibitor-Lösung (Herstellerangabe) über Oberflächengasaustausch und resuspendieren pelletierten Zellen in 3 ml DNase / Albumin-Inhibitor-Lösung. Bereiten kommerziellen diskontinuierlichen Dichtegradienten gemäß Herstellerangabe.
- Spin diskontinuierlichen Dichtegradienten bei 1.000 × g für 6 min. Isolieren dissoziierten Zellen vom Boden des Röhrchens durch Ansaugen unteren Pellet mit einer Pipette.
- Resuspendieren dissoziierten Zellen in 2-3 ml DPBS mit 0,02% Rinderserumalbumin und 1 mg / ml DNase oder bevorzugte HEPES gepufferte Kulturmedien. Fahren Sie durch 40 & mgr; m-Filter vor der FACS (2A). Halten Sie Zellen auf Eis, bis die Sortierung.
- Führen FACS 28. </ li>
- Pellet-Zellen in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen bei 2.000 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
Anmerkung: Pelletierte Astrozyten kann sofort verwendet oder in -80 ° C bis die DNA-Extraktion zu halten.
- Auszug RNA und DNA mit Hilfe bevorzugte Isolierungsverfahren 29 30. Beurteilen Sie RNA- und DNA-Konzentration und Qualität über Spektralphotometer und Bioanalyzer 31.
Hinweis: Nutzen Sie nur qualitativ hochwertige RNA und DNA in den nachfolgenden Schritten, 260/280 = 2,0 bis 2,2 und 1,8 bis 1,9 auf. Bioanalyzer Analyse ist wichtig, für die RNA-Abbau oder DNA-Fragmentierung zu bewerten. RNA oder DNA kann sofort verwendet oder in -80 ° C oder -20 ° C, jeweils für die nachfolgenden Untersuchungen gespeichert werden.
2. Bewertung der DNA-Methylierungsstatus eines Gens mit methylierungssensitiven Hohe Auflösung Schmelzanalyse (MS-HRMA)
- Geben Sie Gen-Sequenz von Interesse in bevorzugten Online-Methylierungs-Mapping-Software, um alle CpG-Inseln im Gen zu identifizierenInteressen 32.
- Design-Primer gegen Bisulfit-konvertierter DNA-Sequenz 33 und verstärken mit bevorzugten DNA-Polymerase nach Herstellerprotokoll. Stellen Sie sicher, verstärkte Produktgröße, indem Sie einen 1% -igen DNA-Gel bei 100 V für 45 min. Shop Primer bei Stammkonzentration von 20 um -20 ° C.
- Bisulfit konvertieren 500-1000 ng DNA von jeder Probe und methylierten DNA-Standards im Bereich von 0-100% von der gleichen Tierart 34. Eluieren Proben auf eine Konzentration von 20 ng / & mgr; l bereitzustellen. Stellen Sie sicher, Konzentration von Bisulfit-konvertierter DNA mittels Spektralphotometer 31.
- Setup 20 & mgr; l-Reaktionen für MS-HRM-Amplifikation unter Verwendung bevorzugte DNA-Polymerase und Primern bei 5 & mgr; M-Konzentration gemäß Tabelle 1 und 2. Führen Sie alle Proben, einschließlich FACS DNA methylierte und Standards, in dreifacher Ausfertigung.
- Je nach Analysesoftware, setzen vor und nach dem Start und Stopp-Parameterum die Übergänge der Schmelzkurve. Set vor, eine Schmelz Start und Pre-Schmelzstoppparameter so dass der Unterschied zwischen den beiden ist von 0,2 bis 0,5 ° C. Stellen Sie nach dem Schmelzbeginn und nach der Schmelze zu stoppen ähnlich. Extrahieren Spitzentemperatur Differenzdaten für jede Probe.
- Verwenden Prozent methylierte Standards (y-Wert) und die entsprechenden durchschnittlichen Spitzentemperaturunterschiede (x-Wert) erzeugen einen linearen Regressionsgleichung (3A-B, Tabelle 3-4). Verwenden Sie dieses linearen Regressionsgleichung zur Methylierungsstatus von unbekannten Proben 35 zu schätzen.
3. Bewertung Hyper-methyliert Promotoraktivität durch Verwendung von Luciferase Assay
- Identifizieren CpG-Inseln des Zielgens (Schritt 2.1). PCR zu amplifizieren interessierenden Bereiche 36 und Klon stromaufwärts des luc2 Firefly Luziferase-Reportergens an CpG-Insel-luc2 Plasmide 37 zu produzieren.
- Linearisieren 30 & mgr; g CpG-Insel-luc2 Plasmid über RestriktionsEnzymverdau 38. Stellen Sie sicher, Standorte für Restriktionsverdau und vermeiden Doppel Schnitte mit bevorzugten Schneidesoftware 38. Wärme inaktivieren Enzyme bei geeigneter Temperatur und Dauer, die nach Aufschluss nach dem Protokoll des Herstellers. Minimalen Verlust an DNA erfolgt während der Linearisierungsschritt.
- Methylat linearisierte Plasmide mit CpG-Methylase (M.Sssl) O / N bei 30 ° C oder lassen Sie unbehandelten folgenden Herstellerprotokoll mit Ausnahme der folgenden Einstellungen.
- Führen Sie 50 ul-Reaktionen.
- Verwenden Sie 5 Einheiten CpG Methylase bis 700 ng linearisierte Plasmid methylieren.
- Führen Reaktionen O / N für 13-19 Std.
- Nach CpG Methylase-Reaktion, führen DNA-Bereinigung mit handelsüblichen Silicagel-Membran reinigen Kit gemäß Herstellerprotokoll. Erhebliche Verluste der DNA auftreten folgenden CpG Methylase-Reaktion, 30-60% Verlust.
- Stellen Sie sicher, Methylierung von Plasmiden über einen HpaII Restriktionsverdau. Nehmen 1 ug methylierten oder unmethylierten DNA und Restriktionsverdau mit Hpa II für 1 h bei 37 ° C. Verwenden Sie 5-10 Einheiten HpaII pro ug DNA. Nach HpaII Verdauung, führen DNA-Bereinigung mit bevorzugten, im Handel erhältlich Silicagel-Membran reinigen Kit. Laufen die beiden CpG-methylierter und nicht-methylierter Plasmide auf einem 1% Agarose-Gel in TAE-DNA oder TBE-Puffer bei 100 V für 45 min zur Visualisierung (4B).
- Gegenstand sowohl methylierten und nicht-methylierten Plasmiden doppelten Digestion mit geeigneten Restriktionsenzymen, um Volllängen-luc 2 (Vektor) und CpG-Insel (insert) -Fragmente 38 freizugeben. Zuführen doppelten Verdau O / N bei geeigneten Temperatur- und Wärme Enzyme zu deaktivieren, die nach Aufschluss nach dem Protokoll des Herstellers. Minimalem Verlust an DNA-Konzentration tritt bei Doppel Restriktionsverdau.
- Laufen Doppel verdauten Plasmide auf 1% DNA Agarosegel bei 100 V für 1 Stunde, um die Trennung zu ermöglichen of Vektor und Insert (4C). Vorsicht. Das Tragen von Schutz UV-Gesichtsschutz, legen DNA-Gel auf einer Tischplatte Schwarzlicht, um Bands zu visualisieren. Basierend auf Größe, Verbrauch methylierter und nicht-methylierter Einsatz und nicht-methylierte Vektor mit einem sauberen Skalpell.
- Gel-Extrakt DNA mit gesättigtem Phenol, pH-Wert 6,6. Kurz gesagt, wiegen DNA Gel-enthaltenden Vektor oder Einsatz. Verwenden Sie 100 ul Phenol pro 0,1 g DNA-Gel. Homogenisieren DNA-Gel in Phenol unter Verwendung von Glas Dounce-Homogenisator.
- In Chloroform (mit 1/5 der Phenolvolumen) und schütteln Proben für 20 Sekunden. Proben Inkubieren bei Raumtemperatur für 2-3 min. Zentrifuge für 15 min bei Maximalgeschwindigkeit (16,1 x 1.000 x g) bei 4 ° C.
- Entfernen wässrigen Lösung und füge 0,1 X Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 X Volumen Ethanol. Proben Inkubation für 1 h bei -80 ° C. Nach der Inkubation Ethanol entfernen und erneut zu suspendieren DNA in 30 ul bevorzugte Puffer. Signifikanten Verlust der DNA erfolgt nach der Isolierung von Einsätzen und Vektoren, 30-50% loss.
- Wieder Ligat methylierter und nicht-methylierter Einsätze nicht methylierte Vektor unter Verwendung von T4-DNA-Ligase 38. Verwenden Sie eine 1: 4-Verhältnis von Vektor für Ligationsreaktionen einfügen. Setup-Reaktion nach Herstellerangaben. Verwenden Sie ein Gesamtvolumen von 50 & mgr; l für Reaktionen und Inkubation O / N bei -20 ° C oder auf Eis mit Deckel auf Eis Eimer.
- Nach der Ligation durchführen DNA Cleanup mit bevorzugten, im Handel erhältlich Silicagel-Membran reinigen Kit. Signifikanten Verlust der DNA auftreten folgenden Ligationsreaktion, eine ungefähre 30-50% Verlust der DNA. Überprüfen Religation von auf 1% Agarose Gel DNA läuft bei 100 V für 45 min und Beurteilung Konzentration re-ligiert Plasmide (Figur 4D).
- Transfektion von methylierten oder unmethylierten Plasmide in D54-Zellen unter Verwendung eines kommerziellen Transfektionsreagens gemäß dem Protokoll des Herstellers. Samen D54 Zellen auf 12-Well-Platte mit einer 0,14 x 10 6 Zellen / Vertiefung.
- Nach 24 Stunden, Transfektion von Zellen, with gleiche Konzentrationen von entweder (1) Nicht methyated CpG-luc2 Plasmid + Renilla oder andere Steuer Luciferase-Vektor oder (2) methylierte CpG-luc2 Plasmid + Renilla oder andere Steuer Luciferase-Vektor.
- Zulassen-Zellen für 24 Stunden Transfektion vor der Durchführung Dual Luciferase-Assay. Führen Sie Test gemäß Herstellerangaben. Führen Sie Messwerte unter Verwendung eines Luminometers. Lesen Sie jede Vertiefung in dreifacher Ausfertigung.
- Berechnen Verhältnis von Firefly Luziferase-Aktivität zu Renilla oder andere Steuer Luciferase-Aktivität. Normalisieren methylierte Firefly: Steuer Luciferase-Aktivität, um nicht methylierten Firefly: Steuer Luciferase-Aktivität durch Division methylierte Luciferase-Aktivität von nicht methylierten Luciferaseaktivität
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Representative Results
Eine angereicherte Population von Astrozyten wurde mittels FACS-Sortierung von eGFP-S100β transgenen Tieren 27 erworben. Aufgrund abnehmender Qualität der Zellen und molekularen Moleküle von Tieren, die älter sind als postnatalen Tag 50 (p50) isoliert, alten Tieren p0-p40 sind optimal für solche Experimente. Cortexgewebe wurde für diese Experimente verwendet. Cortices von zwei bis sechs Tiere wurden gepoolt. FACS wurde UAB Umfassende Durchflusszytometrie Core Facility durchgeführt. Sortier wurde am Becton Dickinson FACSAria II durchgeführt. eGFP Anregung wurde mit 488 nm-Laser erhalten wird; keine Kompensation notwendig. Ein Wohnbevölkerung wurde basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuung (1B) ausgerichtet. Eine Live-Zellpopulation wurde unter Verwendung eines Ethidiumbromid tote Zelle Indikator bestimmt und gated (Abbildung 1c). Zwei verschiedene Populationen wurden auf der Grundlage der eGFP-Profil (Figur 1D) beobachtet. Durch empirische Tests, die Zellpopulation mit höheren eGFPProfil wurde als die eGFP-positive Zellpopulation (1F-F '') identifiziert. Visuelle Analyse der zweiten Population mit einem niedrigeren eGFP Profil zeigte Zellfragmente exprimieren eGFP, aber ohne Kerne, wahrscheinlich, die Trümmer von Astrozytenfortsätze (1G-G ''). Repräsentative Bilder dissoziierter eGFP positive Astrozyten folgenden Dissoziation aber vor der Sortierung (2A) und nach der Sortierung (2B) werden gezeigt. Isoliert eGFP-positiven Zellpopulation zeigte eine 40-fache Steigerung der ALDH1L1 mRNA, einem astrozytischen spezifischer Marker 39 (Abbildung 2C). Zusätzlich trotz geteilt Expression S100β in NG2 + OPCs und Astrozyten 39, beobachteten wir eine 4-fache Verringerung der mRNA NG2, einen Marker für Oligodendrozyten-Vorläuferzellen 39, was anzeigt, Isolierung eines angereicherten Astrozyten Zellpopulation (2C-D). RNAund DNA aus FACS isoliert, sortiert Astrozyten waren von ausreichender Qualität und Quantität für die anschließende Methylierung Studien verwendet werden. Die Gesamt-RNA und DNA aus unterschiedlichen Alters und Anzahl der Tiere isoliert wird als Referenz für die erwartete Rendite des molekular folgenden FACS (Tabelle 5) aufgeführt. Es sei darauf hingewiesen, daß die Ausbeute wird auch je nach Anzahl der verwendeten Tiere, Inkubationszeit und Erfahrung der Forscher basieren. Tabelle 6 zeigt die Variabilität der gemessenen Ereignisse je nach Anzahl der verwendeten Tiere und Inkubationszeiten.
Für Methylierungsstudien, die mit hoher Qualität und ausreichende Mengen an DNA ist von wesentlicher Bedeutung für eine erfolgreiche Downstream-Anwendungen. Um eine ausreichende Lyse von Gewebe zur RNA oder DNA-Extraktion zu gewährleisten, wurden alle Homogenisierung von Gewebe oder Zellen durch Trituration unter Verwendung einer 23G Nadel 7x, wobei darauf zu achten Aufschäumen während der Lyse gefolgt. Sobald hochwertige DNA wird extrahiert und Bisulfit converted, Bereiche von Interesse kann für MS-HRMA ausgerichtet sein. Beachten Sie, dass bei der Beurteilung der Qualität und Konzentration von Bisulfit-konvertierter DNA, sollte Spektralphotometer gesetzt, um bei einer OD-Faktor von 33 zu lesen, wie Bisulfit-konvertierter DNA Einzelstrang werden. Die 260/280 Werte für Bisulfit-konvertierter DNA lag im Bereich von 2,20 bis 2,70.
Vor Beginn der Methylierungsstudien, ist es dringend notwendig, auszuwählen und zu kalibrieren ein Thermocycler für MS-HRMA Studien. Darüber hinaus muss man bestimmen, wie zu exportieren und zu nutzen Rohdaten von MS-HRMA generiert. Applied Biosystems High Resolution Melting Erste Schritte wurde verwendet, um bei der Kalibrierung des 7900HT Thermocycler zu unterstützen. Schließlich wurden die Daten extrahiert und in HRM Analysesoftware für die anschließende Datenanalyse eingeführt. Wie im Protokoll beschrieben, vor und nach der Start- und Stopp-Parameter wurden in der Nähe der Übergänge der Schmelzkurve gesetzt. Spitzentemperaturunterschiede wurden verwendet, um Methylierungsstatus unbekannt sa zu extrapolierenmples. Geschätzter von MS-HRMA erworbenen Methylierung Daten entsprachen eng mit Methylierungsdaten von Pyrosequenzierung generiert (Pyrosequenzierung Daten wurden in Haus unter Verwendung von Primern Targeting gleichen Regionen wie MS-HRM Primern) (3C) 15.
Ein Dual-Luciferase-Assay wurde verwendet, um die Transkriptionsaktivität von hyper-methylierten Bereichen des Gens von Interesse (4A) zu beurteilen. Jedes CpG-Insel-luc2 Plasmid wurde linearisiert und dann methyliert. Da jedoch sowohl der Einsatz (CpG-Insel) und Vektor (luc2) werden während der Reaktion methyliert, muß man das methylierte Insert herauszuschneiden und Wieder Ligat an einen nicht methylierten Vektors. Durch umfangreiche Manipulation des Plasmids treten erhebliche Verluste und muss eine ausreichende Ausgangsmaterial beginnen. HpaII-Verdau wurde verwendet, um den Methylierungsstatus von jedem Plasmid Nachprüfung der HpaII verdaut einzige nicht-methylierte DNA (4B). Es sollte angemerkt werden, dassWenn O / N-Methylierung nicht ausreicht, kann ein zusätzlicher 1x von SAM und 1x CpG Methylase folgenden 1 h Inkubation bei 30 ° C zugegeben werden. Weiter O / N Inkubation nach Zugabe von zusätzlichem SAM und CpG-Methylase. Generation von methylierter und nicht-methylierter CpG-Insel-luc2 Plasmid ermöglicht die direkte Beurteilung der Veränderungen zwischen DNA-Methylierung und Transkriptionsaktivität durch Messung der Luciferase-Aktivität.
Abbildung 1. FACS-Sortierung isoliert eGFP + Zellen popoulation. (A) Verwendung eines 50 ml konischen Röhrchen mit Lochausschnitt auf der Oberseite ermöglicht eine Oberflächengasaustausch während Papainverdau. (B) Sortiert Zellen wurden auf Basis von Vorwärts- und Seitenstreudiagramme gated. (C) Ein Ethidiumbromid basierend tote Zelle Indikator wurde eine Live-Zellpopulation (rot) an Gate verwendet. (D) Live-cell Bevölkerung demonstriert zwei Populationen - eines mit einem hohen Profil eGFP (grün) und einem niedrigen eGFP Profil (lila). Für alle Graphen repräsentiert y-Achse Seitenstreubereich (SSC-A); x-Achse die vorderen Seitenstreubereich (FSC-A), grün fluoreszierendes Protein Bereich (GFP-A) oder Ethidiumbromid (EtBr). (EG) dissoziierten Zellen wurden mit Hoechst inkubiert und 20 & mgr; l von dissoziierten Zellen auf Deckglas gelegt und abgebildet. (EE '') eGFP + Astrozyten, mit umfangreichen Prozessen wurden vor dem Sortieren (NS) visualisiert. (FF '') Im Folgenden Sortieren, Hoch eGFP + Bevölkerung (POS) zu demonstrieren eGFP + Zellen, die Soma-Lokalisierung Co mit Hoechst-Färbung. (GG '') Low eGFP Bevölkerung zeigt eGFP + Färbung, die nicht nebeneinander zu lokalisieren war mit Hoechst-Färbung, wahrscheinlich, die Astrozyten Schutt (für alle Bilder, scale = 20 um). BitteKlicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. FACS-Sortierung von eGFP-S100 β transgenen Tieren bietet angereicherte Population von Astrozyten. (A) 20 ul dissoziierten Zellen vor der FACS (NS) angezeigt, Prozesse intakt bleiben (Maßstab = 50 um). (B) Repräsentative Bildpost FACS (FACS) Zellen gezeigt; Astrozytenfortsätze werden entfernt und Zellsoma Überreste (Maßstab = 20 um). (C) qPCR Daten zeigen eine 40-fache Steigerung der ALDH1L1 mRNA im FACS sortierten Zellen (FACS), verglichen mit nicht sortiert Population (NS). (D) NG2 mRNA wird durch 4-fach in FACS reduziert sortierten Zellen im Vergleich zu nicht sortiert Bevölkerung (NS). Bitte klicken Sie hier, um vergrößern Version dieser Figur.
Abbildung 3. Beispiel Daten und Analysen für MS-HRM-Studien. (A) Beispiel der Temperaturdifferenz Plots von Methylierungsstandards generiert. Entsprechenden prozentualen Methylierung für jede Kurve (B) Beispiel eines linearen Regressionsgleichung aus Ratten methyliert Standards erzeugt markiert. (C) Vergleich der Prozent-Methylierung von Pyrosequenzierung (pyroseq, grüner Balken) und MS-HRMA (graue Balken) erworben zeigt ein ähnliches Niveau an Methylierung für unterschiedliche Regionen KCNJ10. Pyrosequenzierung Daten im Haus erzeugt unter Verwendung von Primern Targeting gleichen Regionen wie MS-HRM Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Dual-Luciferase-Assay ermöglicht die Beurteilung der Transkriptionsaktivität von differentiell methyliert Genregionen. (A) Schematische Darstellung der Luciferase-Transkriptionsaktivität Test zeigt Workflow-Protokoll. (B) DNA-Gel zeigt Unterschiede in der methylierten gegenüber nicht-methylierten Plasmiden folgenden HpaII-Verdau. Nicht-methylierter DNA ist leicht folgenden HpaII Verdauung verdaut Vergleich zu methylierte DNA und zeigt erfolgreiche Methylierung von DNA-Plasmid. (C) DNA-Gel zeigt Trennung von Vektor aus Einsatz folgenden Doppel Verdauung. Nach DNA-Trennung, Vektor und Insert sind Gel extrahiert. (D) DNA-Gel zeigt erfolgreiche Re-Ligation von Vektor und Insert. Re-ligierten Plasmid besitzt ähnliche Molekulargewicht, wie unbehandeltes Plasmid (uNTx). NM, nicht erfüllthylated; M, methylierte; RL, religiert; uNTx, unbehandelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| . | Volumen (ul) | x3 + 10% Überschuß | x Anzahl der Proben |
| MeltDoc MM | 10 & mgr; | 33 & mgr; | |
| Primer 1 | 1,2 & mgr; | 3,96 & mgr; | |
| Primer 2 | 1,2 & mgr; | 3,96 & mgr; | |
| gDNA | 1 & mgr; | --- | |
| dH 2 0 | 6,6 & mgr; | 21.78 ul |
Tabelle 1. Beispielberechnung MeltDoctor Mastermix. Führen Sie jeden MS-HRM reaction in dreifacher Ausfertigung mit 10% Überschuß, um Pipettierfehler zu kompensieren. Letzte Spalte zeigt die Berechnung für mehrere Probenzahlen benötigt werden. Gesamtvolumen für jede Reaktion ist 20 & mgr; l.
| Zyklus | Temp (° C) | Zeit (s) | Rampenrate (%) |
| 95 ° C | :15 | 100 | |
| 40x | 95 ° C | :15 | 100 |
| 60 ° C | : 60 | 100 | |
| Schmelzparameter | 95 ° C | : 10 | 100 |
| 60 ° C | : 60 | 100 | |
| 95 ° C | :15 | 1 | |
| 60 ° C | :15 | 100 | |
| Halten | 4 76; C |
Tabelle 2:. Beispielprotokoll für die Amplifikation Denaturieren Proben bei 95 ° C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen der Amplifikation und die Erzeugung von Schmelzkurve. Schmelz Parameter innerhalb Tabelle aufgeführt. Hinweis Änderung der Anstiegsrate, die für die Übernahme von hochauflösenden Schmelztemperatur ermöglicht.
| Prozent Methylierung (Rat Standard) | Peak-Temperatur-Differenz- |
| y | x |
| 0 | 5.670116 |
| 5 | 10,70448 |
| 10 | 15,5044 |
| 25 | 25,52295 |
| 50 | 34,43047 |
| 75 | 43,80894 |
| 100 | 53,88717 |
| Spitzen Temp Difference | Geschätzte Methylierung |
| X | Y |
| Probe 1 (n = 4) | |
| 47,450 | 81,115 |
| 46,292 | 78,657 |
| 41,694 | 68,894 |
| 47,292 | 80,779 |
| Probe 2 (n = 4) | |
| 29,925 | 43,904 |
| 24,269 | 31,894 |
| 25,061 | 33,575 |
| 25,389 | 34,272 |
Tabelle 4. Beispiel berechnete geschätzte Prozent Methylierung. Peak-Temperaturdifferenz von Proben unbekannter Methylierungsstatus wird verwendet, um den prozentualen Methylierungs Schätzung unter Verwendung einer linearen Regressionsgleichung. Repräsentative Daten von zwei verschiedenen Bedingungen, Probe 1 und Probe 2 sind gezeigt; n = 4 für jede Bedingung.
| Lebensalter | Anzahl der Tiere | Die Gesamt-RNA (ng) | Gesamt-DNA (ng) |
| P4-p10 | 3-6 | 455-868 | 265-1523 |
| p19-p22 | 1-2 | 220-680 | 583-1483 |
| p40-p50 | 3-4 | 198-260 | 578-1700 |
Von FACS erworbenen Tabelle 5. Gesamt-RNA und DNA-sortierten Zellen Alter. Und Anzahl der Tiere in FA verwendetCS-Experimente werden aufgelistet. Beachten Sie wurden beide Kortex für jeden N. Gesamt-RNA verwendet, und DNA wird als Referenz für die erwartete Rendite aufgeführt.
| Lebensalter | Anzahl der Tiere | Pos Events | Neg Events | Inkubationszeit (bei 37 ° C) |
| p26 | 1 | 2.18X10 ^ 6 | 1.15X10 ^ 6 | 20.00 min |
| p26 | 2 | 4.4X10 ^ 6 | 2.78X10 ^ 6 | 20.00 min |
| p26 | 2 | 9.2X10 ^ 6 | 3.3X10 ^ 6 | 30:00 min |
Tabelle 6. Anzahl der Ereignisse von FACS am postnatalen Tag 26 erworben Bei p26 Anzahl der positiven (eGFP +) Veranstaltungen und negativen Ereignissen variiert je nach Anzahl der verwendeten Tiere und Inkubationszeit abhängig.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| Methyl Primer | Applied Biosystems | online | software to localize CpG Islands |
| EZ DNA methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Rat Premixed Calibration Standard | EpiGenDx | 80-8060R-Premix | |
| CpG Methylase (M.Sssl) | Zymo Research | E2010 | |
| QIAquick Gel Extraction | QIagen | 28704 | Used for gel extraction and DNA cleanup |
| Restriction enzymes | New England BioLabs | ||
| NEB cutter | New England BioLabs | online | verify restriction digest sites |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Luc2 vector, pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| renilla vector, pGL4.74 | Promega | E2241 | |
| TD-20/20 Luminometer | Turner Designs | ||
| Lipofectamine LTX and Plus Reagent | Life Technologies | A12621 | |
| Phenol, saturated pH 6.6/6.9 | Fisher Scientific | BP 17501-100 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer | ThermoScientific | ||
| MeltDoctor Master Mix | Life Technologies | 4415440 | |
| High Resolution Melt (HRM) Software v2.0 | Life Technologies | 4397808 | |
| AB SDS software v2.3 | Life Technologies | online | |
| AB High Resolution Melting Getting Started Guide | Life Technologies | online | |
| AB 7900HT Fast Real-Time System | Life Technologies |
References
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