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Biology

유전자 특이 발현과 DNA 메틸화 변화와 성상 세포의 전사 활동의 상관 관계 Published: September 26, 2015 doi: 10.3791/52406

Protocol

모든 동물은 건강 지침의 국립 연구소에 따라 처리되었다. 버밍엄에서 알라바마 대학의 동물 관리 및 사용위원회는 동물의 사용을 승인했다.

1. 전체 뇌 조직에서 성상 (FACS)을 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 풍부한 성상 세포 인구에서 RNA와 DNA를 얻기

  1. 1 분 동안 이산화탄소 후 빠르게 목을 벨과 진정 동물. 앨버 커키 등의 알에 설명 된대로 피질을 해부, 26.; 그것은 수막을 제거 할 필요가 없다.
    참고 :. S100β에서 eGFP는 (성상 세포 마커) 프로모터를 발현하는 형질 전환 쥐 이타 쿠라 (27)에 의해 생성 및 성상 세포의 FACS 정렬을 위해 사용되었다.
  2. 제조사의 프로토콜에 따라 비 멸균 조건 하에서 파파인 해리 키트를 사용하여 전체 뇌 균질 물을 준비한다. 10 분 동안 물을 욕조에 37 ℃에서 파파인을 열 활성화합니다. 노트 :파파인 솔루션은 제조업체에서 제공 및 L 시스테인 및 EDTA를 (재료의 표 참조)이 포함된다.
    1. 절단 또는 튜브는 95 % O 2 반송하도록 50 ㎖ 원뿔형 튜브의 상단에 구멍을 드레 멜 : 5 % CO 2는 폐쇄 원추형 튜브에 공급되는 (도 1a 참조). 해리 미디어 함유 10mm 배양 접시에 해부 피질 배치 (하여 20 mM 글루코스 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (500 U / ml)로 보충 된 95 %의 O를 평형화 MEM을 2 : 5 % CO 2) (1)에 조직을 말하다 깨끗한 면도날을 사용 X 1mm 2 개.
  3. 파파인 함유 용액 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 10 ㎖를 사용하여 수동 pipetman 전사 조직. 조직이 이월 해리 미디어의 양을 최소화하기 위해 배출 전에 전송 피펫의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 95 % O 2로 평형화 파파인 용액을 보관 : 5 % CO 2 항온 처리 기간 동안 표면을 통하여 가스 교환. 하지 거품 파파인 soluti를 수행에. 37 ° C의 물을 욕조에 20 분 동안 조직을 품어.
  4. 파파인 솔루션에 다음과 배양, 씹다 조직 느린 속도로 10 ml의 전송 피펫으로 10 배. 실온에서 5 분 1,000 XG에 원심 분리기 흐린 세포 현탁액.
    1. 표면을 통한 가스 교환 (제조사에 의해 제공된)의 DNase / 억제제 알부민 용액과 평형의 DNase / 억제제 알부민 용액 3 ml의 세포 펠렛을 다시 일시. 제조업체의 지침에 따라 상업 불연속 밀도 기울기를 준비합니다.
  5. 6 분 동안 1,000 XG 불연속 밀도 구배 스핀. 피펫을 사용하여 바닥 펠렛을 흡입에 의해 튜브의 바닥에서 해리 세포를 분리.
  6. 0.02 % 소 혈청 알부민 및 1 ㎎ / ㎖의 DNase 또는 배양 배지 HEPES 완충 바람직 DPBS로 2-3 ml 중에 해리 된 세포를 다시 일시 중지. FACS (그림 2A) 전에 40 μm의 필터를 통해 전달합니다. 정렬 될 때까지 얼음 세포를 유지합니다.
    1. 외과 (28)를 수행합니다. </ 리>
    2. 4 ℃에서 5 분 2,000 XG에 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브에서 펠렛 세포.
      주 : 펠릿의 성상은 즉시 사용 또는 DNA 추출까지 -80 ° C에 보관 될 수있다.
  7. RNA와 DNA를 선호하는 분리 방법 (29) (30)를 사용하여 압축을 풉니 다. 분광 광도계와 bioanalyzer (31)를 통해 RNA 및 DNA 농도와 품질을 평가합니다.
    주의 : 후속 단계에서 단지 고품질 RNA 및 DNA를 활용하여 각각 280분의 260 = 2.0~2.2 및 1.8-1.9를. Bioanalyzer 분석은 RNA 분해 또는 DNA 파편에 대해 평가하는 것이 필수적이다. RNA 또는 DNA는 즉시 사용하거나 또는 -20 ° C, 각각 후속 연구를위한 C °에서 -80 저장할 수 있습니다.

2. 메틸화에 민감한 고해상도 용융 분석 (MS-르마)를 사용하여 유전자의 DNA 메틸화 상태를 평가

  1. 유전자에 어떤의 CpG 섬을 식별하는 것이 바람직 온라인 메틸화 매핑 소프트웨어에 관심의 유전자 서열을 입력관심 (32).
    1. 중아 대해 디자인 된 프라이머는 DNA 서열 (33)를 변환하여 제조사의 프로토콜에 따라 바람직한 DNA 중합 효소를 이용하여 증폭한다. 45 분 동안 100 V에서 1 % 아가 로스 DNA 젤을 실행하여 증폭 산물의 크기를 확인합니다. -20 ° C에서 20 μM의 재고 농도 스토어 프라이머.
  2. 중아는 같은 동물 종 (34)로부터 0~100%에 이르기까지 각각의 샘플과 메틸화 된 DNA 표준 DNA의 500 ~ 1,000 NG를 변환합니다. 용출 시료 20 NG / μL의 농도를 제공한다. 분광 광도계 (31)를 통해 중아 변환 된 DNA의 농도를 확인합니다.
  3. 표 1 및 2에 따른 5 μM 농도에서 바람직한 DNA 폴리머 라제 및 프라이머를 사용하여 MS-HRM 증폭 용 셋업 20 μL 반응. 중으로, FACS의 DNA 메틸화 및 표준을 포함하여 모든 샘플을 실행할.
  4. 분석 소프트웨어에 따라, 미리 설정하고 시작 매개 변수를 중지 포스트용융 곡선의 천이 주위. 세트 미리 용융 개시 및 둘 사이의 차이가 0.​​2 정도로 미리 용융 정지 파라미터 - 0.5 ° C. 후 용융 시작 및 사후 용융 유사 중지를 설정합니다. 각 샘플에 대한 피크 온도 차이 데이터의 압축을 풉니 다.
  5. 메틸화 백분율 기준 (Y 값)과 대응하는 평균 피크 온도차 (x 값)을 사용하여 선형 회귀 방정식 (도 3A-B, 표 3-4)을 생성한다. 미지 시료 (35)의 메틸화 상태를 추정하기 위해 선형 회귀 방정식을 사용합니다.

3. 루시퍼 라제 분석의 사용을 통해 하이퍼 메틸화 발기인 활동 평가

  1. 표적 유전자 (2.1 단계)의의 CpG 섬을 식별합니다. 이 PCR의 CpG 섬 luc2-37 플라스미드를 제조 luc2 반딧불 루시퍼 라제 리포터 유전자의 상류에 관심 36 클론의 영역을 증폭.
  2. 제한을 통해의 CpG 섬 - luc2 플라스미드의 30 μg의 선형화효소 소화 38. 제한 다이제스트에 대한 사이트를 확인하고 원하는 커터 소프트웨어 (38)를 사용하여 두 번 상처를 피할 수 있습니다. 제조 업체의 프로토콜에 따라 소화를 다음과 같은 적절한 온도와 시간에 효소를 열 - 불 활성화. DNA의 최소 손실은 선형화 단계에서 발생합니다.
  3. 30 ° C에서의 CpG 메틸화 (M.Sssl) O / N을 사용하거나 다음과 같은 조정을 제외하고 처리되지 않은 다음과 같은 제조 업체 프로토콜을 남겨 메틸화 선형화 플라스미드.
  4. 50 μL 반응을 수행합니다.
  5. 선형화 플라스미드 700 NG 메틸화에의 CpG 메틸화의 5 단위를 사용합니다.
  6. 13 ~ 19 시간 동안 반응 O / N을 실행합니다.
  7. 의 CpG 메틸화 반응에 따라, 시판되는 실리카 - 겔 막의 제조 업체의 프로토콜에 따라 키트를 정리 표준을 사용하여 DNA 정리를 수행합니다. DNA의 상당한 손실은 메틸화 된 CpG 반응 30-60 %의 감소에 따라 발생한다.
  8. HPA II 제한 다이제스트를 통해 플라스미드의 메틸화를 확인합니다. 메틸화 또는 비 메틸화 된 DNA 1 μg의를 가지고 제한은 37 ℃에서 1 시간 동안 HPA II 다이제스트. 각 μg의 DNA를 위해 HPA II의 5 ~ 10 단위를 사용합니다. HPA II 소화에 따라, 선호, 시판되는 실리카 - 겔 막 청소 키트를 사용하여 DNA 정리를 수행합니다. 시각화를위한 45 분 (그림 4B) 100 V에서 TAE 나 TBE 버퍼에 1 % 아가 로스 DNA 젤에 모두의 CpG 메틸화 및 비 메틸화 된 플라스미드를 실행합니다.
  9. 적절한 제한 효소와 더블 소화에 따라 모두 메틸화 및 비 메틸화 플라스미드는 전체 길이 루크 2 (벡터)과의 CpG 섬 (삽입) 38 조각을 분리합니다. 제조 업체의 프로토콜에 따라 소화 다음 적절한 온도와 열을 비활성화 효소에서 더블 소화 O / N을 수행합니다. DNA 농도의 손실을 최소화 이중 제한 다이제스트 동안 발생합니다.
  10. O를 분리 할 수​​ 있도록 1 시간 동안 100 V에서 1 %의 DNA 아가 로스 젤을 두 번 소화 플라스미드를 실행F 벡터 삽입 (그림 4C). 주의. 보호 자외선 얼굴 가리개를 착용, 밴드를 시각화 탁상 블랙 라이트에 DNA 젤을 배치합니다. 깨끗한 수술 블레이드를 사용하여 크기, 소비세 메틸화 및 비 메틸화 삽입 및 비 메틸화 된 벡터 기준으로합니다.
  11. 포화 페놀, pH가 6.6을 사용하여 젤 추출 DNA. 간단히, 벡터 또는 삽입을 포함하는 DNA 젤 무게. DNA 젤 0.1 g 당 페놀의 100 μl를 사용합니다. 유리 다운스 균질 기에서 페놀을 사용하여 DNA 겔 균질화.
  12. 클로로포름 (페놀 량의 1/5 사용)을 추가하고 20 초 동안 샘플을 흔들. 2 ~ 3 분 동안 실온에서 샘플을 품어. 4 ° C에서 최대 속도 (16.1 X 1,000 XG)에서 15 분 동안 원심 분리기.
  13. 수용액을 제거하고, 3 M 아세트산 나트륨 및 에탄올 2.5 배 부피의 0.1X 볼륨. -80 ° C에서 1 시간 동안 샘플을 품어. 인큐베이션 후, 에탄올을 제거하고 바람직한 완충액 30 μL에 DNA를 다시 일시. DNA의 상당한 손실이 삽입 및 벡터의 다음 분리를 발생, 30 % ~ 50 % 싸다SS.
  14. 재 결찰을 메틸화 및 비 메틸화 된 인서트 T4 DNA 리가 제 (38)를 이용하여 벡터를 비 메틸화. 결찰 반응에 삽입하는 벡터의 4 비율 : 1을 사용합니다. 제조업체의 지침에 따라 설치 반응. 반응 50 μL의 총 부피를 사용하여 C ° 또는 얼음 양동이 위에 뚜껑 얼음에 -20 O / N을 품어.
  15. 결찰 후, 선호, 시중에서 판매하는 실리카겔 막 청소 키트를 사용하여 DNA 정리를 수행합니다. DNA의 상당한 손실은 연결 반응, DNA의 대략 30 % ~ 50 %의 손실에 따라 발생한다. 45 분 동안 100 V에서 1 % 아가 로스 DNA 젤에 실행하여 재 결찰을 확인하고 재 결찰 플라스미드 (그림 4D)의 농도를 평가합니다.
  16. 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 형질 전환 시약을 이용하여 세포 내로 D54 메틸화 또는 비 메틸화 된 플라스미드를 형질 감염. 잘 0.14 × 10 6 세포 / 12 웰 판에 씨앗 D54 셀.
  17. 24 시간 후, 형질 세포 위스콘신(1) 비 methyated의 CpG-luc2 플라스미드 + 레 닐라 또는 다른 제어 루시 페라 벡터 또는 (2) 메틸화 된 CpG-luc2 플라스미드 + 레 닐라 또는 다른 제어 루시 페라 벡터 중 하나의 일 동일 농도.
  18. 세포가 듀얼 루시 페라 제 분석을 수행하기 전에 24 시간 동안 형질을 허용합니다. 제조업체의 지침에 따라 분석을 수행합니다. 루미를 사용하여 측정을 수행합니다. 세중에서 잘 각을 읽어보십시오.
  19. 레 닐라하는 반딧불 루시 페라 제 활동의 비율 또는 기타 제어 루시퍼 라제 활성을 계산합니다. 비 메틸화를 제어 반딧불 루시페라아제 활성 : 메틸화 반딧불 정상화 제어 루시퍼 라제 활성을 비 메틸화 된 루시퍼 라제 활성에 의해 메틸화 된 루시퍼 라제 활성을 나누어

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Representative Results

성상 세포의 풍부한 인구는 eGFP는-S100β 형질 전환 동물 (27)의 FACS 정렬을 통해 인수되었다. 때문에 P0-P40 세 세포와 출생 후 하루 50 (P50)보다 오래된 동물에서 분리 된 분자 분자, 동물의 품질을 감소 그러한 실험에 최적이다. 대뇌 피질 조직을 다음 실험에 사용 하였다. 2-6 동물의 피질 함께 모았다. FACS는 UAB 종합 유동 세포 계측법 핵심 시설에서 수행되었다. 정렬은 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson) FacsAria II 시행 하였다. eGFP는 음원은 488 nm의 레이저를 사용하여 얻었다; 보상은 필요 없었다. 게이트 인구는 앞으로 및 측면 산란 (그림 1B)를 기반으로 대상으로 하였다. 생균 인구 티듐 브로마이드 사균 표시기를 사용하여 측정하고 (도 1C)을 게이팅 하였다. 두 개의 다른 개체군은 eGFP는 프로파일 (도 1D)에 기초하여 관찰 하였다. 경험적 테스트 높은 eGFP는 함께 세포 집단 스루프로파일은 eGFP는 양성 세포 인구 (그림 1 층-F '')로 확인되었다. 낮은 eGFP는 프로파일을 사용하여 두 번째 인구의 시각적 분석을 가능성이 성상 세포 프로세스 (그림 1G-G '')에서 파편을 대표 eGFP는 표현 세포 조각을 공개하지만, 핵없는. 해리 다음 해리 eGFP는 긍정적 인 성상 세포의 대표 이미지하지만 (그림 2A)를 정렬 및 (그림 2B)가 표시되어 정렬 후 사전. 고립 된 eGFP는 양성 세포 인구는 ALDH1L1의 mRNA, 성상 세포 특정 마커 (39) (그림 2C)의 40 배의 증가를 보여 주었다. 또한, NG2 + 개 OPC 및 성상 39 S100β의 공유 표현에도 불구하고, 우리는 풍부한 성상 세포 인구 (그림 2C-D)의 분리를 나타내는, NG2의 mRNA의 4 배 감소, 희소 돌기 아교 세포 전구 세포 (39)에 대한 마커를 관찰했다. RNA및 FACS로부터 단리 DNA가 메틸화 아스트로 후속 연구에 사용될 수있는 충분한 양 및 품질로 분류 하였다. 다양한 연령과 동물의 수에서 분리 된 총 RNA와 DNA는 FACS (표 5) 다음과 같은 분자 분자의 기대 수익률에 대한 참조로 표시됩니다. 이것은 수율이 또한 이용 동물 수, 잠복기 및 연구원의 경험에 따라 달라질 수 있음을 유의해야한다. 표 6은 이벤트의 가변성이 사용될 동물 및 인큐베이션 기간의 개수에 따라 획득 보여준다.

메틸화 연구의 경우, 높은 품질과 DNA의 충분한 양으로 시작하여 성공적으로 다운 스트림 애플리케이션에 필수적이다. RNA 또는 DNA 추출을위한 조직의 충분한 용해를 보장하기 위해, 조직 또는 세포의 모든 균질화은 용해시 거품을하지 않도록주의하면서, 23G 바늘의 7 배를 이용하여 분쇄으로 이어졌습니다. 일단 높은 품질의 DNA를 추출 중아 변환된다ED는, 관심 영역은 MS-르마 대상이 될 수있다. 품질과 중아 변환 된 DNA의 농도를 평가할 때, 분광 광도계는 중아는 DNA를 단일 가닥이다 환산 (33)의 외경 요인에서 읽기 전용으로 설정해야합니다. 중아 변환 된 DNA의 280 분의 260 값은 2.20-2.70였다.

메틸화 연구를 시작하기 전에, 그것은 적절하게 선택하고 MS-르마 연구에 열 자전거 타는 사람을 교정하는 것이 중요합니다. 또한, 하나는 MS-르마에서 생성 된 원시 데이터를 수출하고 활용하는 방법을 결정해야합니다. 어플라이드 바이오 시스템즈 고해상도 녹는 가이드가 7900HT 열 자전거 타는 사람을 보정을 지원하기 위해 사용 하였다 시작하기. 마지막으로, 데이터를 추출하고, 후속 데이터 분석 HRM 분석 소프트웨어로 반입 하였다. 프로토콜에 설명 된 바와 같이, 전후의 시작과 매개 변수가 용융 곡선의 전환 근처에 설정 한 중지합니다. 피크 온도차가 알려지지 SA의 메틸화 상태를 추정하는 데 사용 된mples. MS-르마로부터 취득한 기준 메틸화 데이터 (pyrosequencing 데이터가 MS-HRM 프라이머와 동일한 영역을 대상으로 프라이머를 사용하여 집에서 생성) (도 3c)에서 생성 된 15 pyrosequencing 메틸화 데이터에 대응 밀접.

이중 루시페라아제 분석법이자 (도 4a)의 유전자의 메틸화 하이퍼 영역의 전사 활성을 평가하기 위해 사용 하였다. 각각의 CpG 섬 - luc2 플라스미드를 선형화하고 메틸화했다. 그러나 삽입 (의 CpG 섬) 및 벡터 (luc2) 모두 반응 중에 메틸화되어 있기 때문에, 하나는 메틸화 삽입을 절제해야하며, 재 결찰을 비 메틸화 벡터에. 때문에 플라스미드의 광범위한 조작에 상당한 손실이 발생 하나는 충분한 원료로 시작해야합니다. HpaII 소화 HpaII는 단지 비 메틸화 DNA (도 4b)를 소화 각 플라스미드의 메틸화 상태를 확인하는 데에 이용 하였다. 또한 주목해야한다O / N 메틸화가 불충분하면, 메틸화 된 CpG의 추가적인 SAM의 1X 및 1X는 30 ° C에서 배양 한 다음, 1 시간에 첨가 될 수있다. 추가 샘과의 CpG 메틸화의 또한 다음과 같은 O / N 배양을 계속합니다. 메틸화 및 비 메틸화 된 CpG 섬 - luc2 플라스미드의 생성은 루시 페라 제 활동의 측정을 통해 DNA 메틸화 및 전사 활동 사이의 변화를 직접 평가를 할 수 있습니다.

그림 1
그림 1. 외과 정렬은 eGFP는 + 세포 popoulation을 분리합니다. 구멍 잘라 50 ML 원뿔 튜브 (A)를 사용하여 상단 파파인 소화하는 동안 표면 가스를 교환 할 수 있습니다에. (B) 세포를 분류 전방 및 측면 산란 플롯에 기초하여 게이팅 하였다. (C)에 티듐 브로마이드 기반 사균 표시 게이트 생균 인구 (적색)를 이용 하였다. (D) 라이브 CEL높은 eGFP는 프로파일 (녹색) 및 낮은 eGFP는 프로파일 (보라색)과 한 - L 인구는 두 집단을 보여 주었다. 모든 그래프에 대해, y 축은 측 분산 영역 (SSC-A)를 나타내고; x 축은 전방 측 분산 영역 (FSC-A), 녹색 형광 단백질 영역 (GFP-A), 또는에 티듐 브로마이드 (EtBr로)를 나타낸다. (EG) 훽스트 해리 된 세포와 함께 배양하고, 해리 된 세포의 20 μL는 커버 슬립에 배치하고 이미지화 하였다. 광범위한 프로세스와 EE ( '') eGFP는 + 성상 세포는 (NS)를 정렬하기 전에 가시화되었다. 정렬, 높은 eGFP는 + 인구 (POS) 다음 (FF는 '') 훽스트 염색과-지역화 공동 eGFP는 + 세포 소마를 보여줍니다. (GG는 '') 낮은 eGFP는 인구. 가능성 (모든 이미지, 규모 = 20 μm의) 성상 세포 파편을 나타내는, 훽스트 염색과 협력 지역화하지 않았다 eGFP는 + 염색을 보여 주십시오이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
eGFP는-S100의 β 형질 전환 동물의 분류 그림 2. 외과는 성상 세포의 풍부한 인구를 제공합니다. FACS (NS) 전에 해리 세포의 20 μL가 표시됩니다 (A)는, 프로세스가 그대로 유지 (규모 = 50 μm의). (B) 대표 화상이 후 FACS (FACS)는 세포를 나타낸다; 성상 세포 프로세스를 제거하고 세포 소마 남아 (규모 = 20 μm의)된다. (C) qPCR에 데이터가없는 분류 인구 (NS)에 비해 외과 세포를 분류에 ALDH1L1의 mRNA에 40 배 증가 (FACS)를 보여줍니다. (D) NG2의 mRNA가 외과에서 4 배 감소는 세포가 정렬되지 인구 (NS)에 비해 소트. 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 3
MS-HRM 연구 그림 3. 샘플 데이터 및 분석. 메틸화 표준에서 발생하는 온도 차이 플롯의 (A) 예. 해당 %의 메틸화는 쥐 메틸화 표준에서 생성 된 선형 회귀 방정식의 각 곡선 (B)의 예를 들어 레이블이 붙어 있습니다. (pyroseq, 녹색 막대) 및 MS-르마 (회색 막대) pyrosequencing로부터 취득 퍼센트 메틸화 (C) 비교 KCNJ10의 영역을 변화시키는 메틸화 비슷한 수준을 보여준다. MS-HRM으로 동일한 영역을 대상으로 프라이머를 사용하여 집에서 생성 Pyrosequencing 데이터 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

항상 "> :"유지 - together.within 페이지를 = FO "십t 그림 4
그림 4. 듀얼 루시 페라 제 분석은 차별적 메틸화 유전자 영역의 전사 활동의 평가를 할 수 있습니다. (A) 다이어그램 루시퍼 라제 전사 활성 분석의 프로토콜의 흐름을 보여줍니다. HpaII 소화 다음과 같은 비 메틸화 플라스미드 대 메틸화 (b)에서 DNA 젤 표시 차이. 비 메틸화 DNA 용이 플라스미드 DNA의 메틸화 성공을 보여주는, 메틸화 된 DNA와 비교하여 다음 HpaII 소화 분해된다. (C) DNA 젤 더블 소화 다음 삽입에서 벡터의 분리를 보여줍니다. DNA 분리, 벡터 및 삽입 후 젤이 추출됩니다. (D) DNA 젤 벡터와 삽입의 성공적인 재 결찰을 보여줍니다. 다시 결찰 플라스미드 비슷한 분자량 치료 플라스미드로 (untx)를 보유하고있다. 뉴 멕시코, 비는-충족hylated; M, 메틸화; RL, 다시 라이 게이션; untx는, 치료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

. 볼륨 (μL) X3 + 10 % 초과 샘플의 X #
MeltDoc MM 10 μL 33 μL
프라이머 1 1.2 μL 3.96 μL
프라이머 2 1.2 μL 3.96 μL
gDNA를 1 μL ---
DH 2 0 6.6 μL 21.78 μL

MeltDoctor Mastermix 표 1. 샘플 계산. 각각의 MS-HRM의 REA를 실행10 %를 초과와 세중 ction의는 피펫 오류를 보상한다. 마지막 열은 샘플의 여러 숫자에 필요한 계산을 나타냅니다. 각 반응의 총 부피는 20 μL이다.

주기 온도 (℃) 시간 (초) 램프 비율 (%)
95 ° C : 15 (100)
40 배 95 ° C : 15 (100)
60 ° C : 60 (100)
녹는 매개 변수 95 ° C : 10 (100)
60 ° C : 60 (100)
95 ° C : 15 1
60 ° C : 15 (100)
보유 4 76, C

표 2. 증폭을위한 샘플 프로토콜은 용융 곡선의 증폭 및 발생의 40주기 다음에 10 분 동안 95 ° C에서 샘플 변성. 녹는 매개 변수 테이블에서 나열되어 있습니다. 고해상도 용융 온도의 취득을 허용 램프 속도의 변화를합니다.

백분율 메틸화 (쥐 표준) 피크 온도 차이
Y 엑스
0 5.670116
(5) 10.70448
(10) 15.5044
(25) 25.52295
(50) 34.43047
(75) 43.80894
(100) 53.88717
NT "피크 온도차 데이터> 표 3 예. 백분율 메틸화 표준. 피크 온도차 데이터 x 좌표로 표시된다. y 좌표로 표시되는 대표적인 피크 온도차 데이터는 한 유전자 영역에서 MS-HRM을 사용하여 획득 하였다.

피크 온도 차이 예상 메틸화
엑스 Y
샘플 1 (N = 4)
47.450 81.115
46.​​292 78.657
41.694 68.894
47.292 80.779
샘플 2 (N = 4)
29.925 43.904
24.269 31.894
25.061 33.575
25.389 34.272

표 계산 추정 퍼센트 메틸화 4 실시 예. 미지의 메틸화 상태의 샘플 피크의 온도차가 선형 회귀 식을 사용하여 메틸화 백분율을 측정하기 위해 사용된다. 두 가지 조건, 샘플 1과 샘플 2에서 대표 데이터가 도시되어있다; N = 각 조건 4.

나이 동물의 수 총 RNA (NG) 총 DNA (NG)
P4-P10 3-6 455-868 265-1523
P19-P22 1-2 220-680 583-1483
P40-P50 3-4 198-260 578-1700

외과에서 획득 한 표 5. 총 RNA와 DNA는 세포를 분류. 나이와 동물의 수는 FA에 사용CS 실험이 나열됩니다. 참고 두 피질은 각 N. 전체 RNA를 이용하고, DNA를 예상 수익률에 대한 참조로 표시됩니다.

나이 동물의 수 순위 이벤트 NEG 이벤트 배양 시간 (37 ° C에서)
P26 1 2.18X10 ^ 6 1.15X10 ^ 6 20시 분
P26 (2) 4.4X10 ^ 6 2.78X10 ^ 6 20시 분
P26 (2) 9.2X10 ^ 6 3.3X10 ^ 6 30:00 분

긍정적 인 (eGFP는 +) 이벤트와 부정적인 사건의 P26 번호에서 출생 후의 일 26시 외과에서 획득 한 이벤트 표 6. 번호는 사용 동물과 잠복기의 수에 따라 달라집니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150
AllPrep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204
Methyl Primer Applied Biosystems online software to localize CpG Islands
EZ DNA methylation Kit Zymo Research D5001
Rat Premixed Calibration Standard EpiGenDx 80-8060R-Premix
CpG Methylase (M.Sssl) Zymo Research E2010
QIAquick Gel Extraction  QIagen 28704 Used for gel extraction and DNA cleanup
Restriction enzymes New England BioLabs
NEB cutter New England BioLabs online verify restriction digest sites
Dual Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Luc2 vector, pGL4.10 Promega E6651
renilla vector, pGL4.74 Promega E2241
TD-20/20 Luminometer Turner Designs
Lipofectamine LTX and Plus Reagent Life Technologies A12621
Phenol, saturated pH 6.6/6.9 Fisher Scientific BP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer ThermoScientific
MeltDoctor Master Mix Life Technologies 4415440
High Resolution Melt (HRM) Software v2.0 Life Technologies 4397808
AB SDS software v2.3 Life Technologies online
AB High Resolution Melting Getting Started Guide  Life Technologies online
AB 7900HT Fast Real-Time System Life Technologies

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References

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분자 생물학 문제 (103) DNA 메틸화 MS-르마 루시 페라 제 프로모터 분석 외과 성상 Kir4.1,
유전자 특이 발현과 DNA 메틸화 변화와 성상 세포의 전사 활동의 상관 관계<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)
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Nwaobi, S. E., Olsen, M. L. Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1). J. Vis. Exp. (103), e52406, doi:10.3791/52406 (2015).

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