Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Korrelere genspesifikke DNA metylering Endringer med Expression og Transkripsjonell Aktivitet av astrocytic Published: September 26, 2015 doi: 10.3791/52406

Protocol

Alle dyrene ble håndtert i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer. Animal Care og bruk komité ved University of Alabama i Birmingham godkjent dyre bruk.

1. Innhenting RNA og DNA fra en Beriket astrocytic Befolknings hjelp Fluorescent Aktivert Cell Sorting (FACS) av Astrocytter fra Whole Brain Tissue

  1. Sedate dyr med CO 2 for 1 min og deretter raskt halshogge. Dissekere cortices som beskrevet i Albuquerque et al, 26.; Det er ikke nødvendig å fjerne hjernehinnene.
    Merk: Transgene rotter uttrykker EGFP under S100β (en astrocyte markør) promoter ble generert av Itakura et al 27 og utnyttes for FACS sortering av astrocytter..
  2. Forbered hele hjernehomogenat bruker en papain dissosiasjon kit under ikke-sterile forhold i henhold til produsentens protokoll. Varme aktivere papain ved 37 ° C i vannbad i 10 min. notat:Papain løsning er levert av produsenten og inneholder L-cystein og EDTA (se tabell for material).
    1. Skjæres eller Dremel et hull i toppen av en 50 ml konisk rør for å tillate rør å bære 95% O 2: 5% CO2 for å bli matet inn i en lukket konisk rør (figur 1A). Plasser dissekert cortices i 10mm dyrkningsskålen inneholder dissosiasjon media (MEM supplert med 20 mM glukose og penicillin / streptomycin (500 U / ml) og likevekt til 95% O 2: 5% CO 2) og bruke en ren barberblad for å hakke vevet inn en x 1 mm 2 stk.
  3. Transfer vev ved hjelp av 10 ml manuell pipetman til 50 ml konisk tube inneholder papain løsning. Tillat vev for å gjøre opp til bunnen av overførings pipette før lossing til å minimalisere mengden av dissosiasjon media overført. Hold papain løsning ekvilibrert til 95% O 2: 5% CO2 via overflategassutveksling for varigheten av inkuberingen. Ikke boble papain solutipå. Inkuber vev i 20 min i 37 ° C vannbad.
  4. Etter inkubasjon i papain løsning, triturate vev 10 ganger med en 10 ml overføring pipette med sakte fart. Sentrifuger uklar cellesuspensjon ved 1000 xg i 5 min ved RT.
    1. Ekvilibrer DNase / albumin inhibitor oppløsning (levert av produsenten) via overflategassutveksling og re-suspenpelleterte celler i 3 ml DNase / albumin inhibitor-løsning. Forbered kommersiell diskontinuerlige tettshetsgradient følge produsentens instruksjoner.
  5. Spin usammenhengende tettshetsgradient på 1000 xg i 6 min. Isolere dissosierte celler fra bunnen av røret ved å suge bunnen pellet ved hjelp av en pipette.
  6. Re-suspen dissosierte cellene i 2-3 ml DPBS med 0,02% bovint serumalbumin og 1 mg / ml DNase eller foretrukne HEPES-bufret kulturmedier. Passere gjennom 40 mikrometer filter før FACS (Figur 2A). Hold cellene på is inntil sortering.
    1. Utfør FACS 28. </ li>
    2. Pellet-celler i 1,5 ml sentrifugerør ved 2000 xg i 5 min ved 4 ° C.
      Merk: Pelleterte astrocytter kan brukes umiddelbart eller oppbevart i -80 ° C inntil DNA-ekstraksjon.
  7. Pakk RNA og DNA ved hjelp av foretrukne isolasjonsmetoden 29 30. Vurdere RNA og DNA konsentrasjon og kvalitet via spektrofotometer og Bioanalyzer 31.
    Merk: Utnytte høy kvalitet RNA og DNA i etterfølgende trinn, 260/280 = 2,0-2,2 og 1,8-1,9 hhv. Bioanalyzer analyse er nødvendig for å vurdere for RNA-degradering eller DNA-fragmentering. RNA eller DNA kan benyttes umiddelbart eller lagres i -80 ° C eller -20 ° C, henholdsvis for etterfølgende studier.

2. Vurdere DNA Metylering Status for en Gene hjelp Metylering følsomme High Resolution Melt Analysis (MS-HRMA)

  1. Skriv inn gensekvensen av interesse inn foretrukne online metylering kartlegging programvare for å identifisere eventuelle CpG øyer i genetav interesse 32.
    1. Design primere mot sulfitt konvertert DNA sekvens 33 og forsterke bruker foretrukket DNA polymerase i henhold til produsentens protokoll. Kontroller amplifiserte produkt størrelse ved å kjøre en 1% agarose-gel-DNA ved 100 V i 45 minutter. Oppbevar primere på lager-konsentrasjon på 20 uM i -20 ° C.
  2. Bisulfite konvertere 500-1000 ng av DNA fra hver prøve og metylert DNA-standarder som strekker seg fra 0-100% fra samme dyreart 34. Eluere prøvene for å tilveiebringe en konsentrasjon på 20 ng / ul. Kontroller konsentrasjonen av sulfitt konverterte DNA via spektrofotometer 31.
  3. Oppsett 20 ul reaksjoner for MS-HRM amplifikasjon ved anvendelse av foretrukket DNA-polymerase og primere ved 5 mM konsentrasjon i henhold til tabell 1 og 2. Kjør alle prøvene, inkludert DNA FACS og metylerte standarder i triplikat.
  4. Avhengig analyse programvare, sett for- og etter starte og stoppe parametererundt overgangene på smeltekurve. Set pre-smelte start og pre-smelte stop parametrene slik at forskjellen mellom de to er 0,2 - 0,5 ° C. Still post-smelte start og post-smelte stoppe på samme måte. Ekstraher topptemperaturforskjellen data for hver prøve.
  5. Bruke prosent denaturert standarder (y-verdi) og deres tilsvarende gjennomsnitts peak temperaturforskjeller (x-verdi) genererer en lineær regresjonsligning (figur 3A-B, Tabell 3-4). Bruk denne lineære regresjonsligningen å anslå metylering status for ukjente prøver 35.

3. Vurdere Hyper-metylert Arrangøren aktivitet via Bruk av Luciferase Assay

  1. Identifisere CpG øyene målgen (trinn 2.1). PCR amplifisere regioner av interesse 36 og klon oppstrøms for luc2 ildflueluciferase reportergenet for å fremstille CpG-øy-luc2 plasmider 37.
  2. Linearize 30 mikrogram av CpG-øya-luc2 plasmid via begrensningenzym fordøyelsen 38. Kontroller nettsteder for restriksjonskutting og unngå dobbelt kutt ved hjelp av foretrukne kutter programvare 38. Varme inaktivere enzymer ved riktig temperatur og varighet følgende fordøyelsen i henhold til produsentens protokoll. Minimalt tap av DNA finner sted i løpet av linearisetrinnet.
  3. Metilat linearisert plasmider ved hjelp av CpG metylase (M.Sssl) O / N ved 30 ° C eller la ubehandlet følgende produsenten protokoll med unntak av følgende justeringer.
  4. Utfør 50 ul reaksjoner.
  5. Bruk 5 enheter av CpG metylase å metilat 700 ng linearisert plasmid.
  6. Kjør reaksjoner O / N for 13-19 år hr.
  7. Etter CpG-metylase reaksjonen utføre DNA opprydding ved hjelp av standard, kommersielt tilgjengelige silika-gel membran rydde opp kit ifølge produsentens protokoll. Betydelige tap av DNA oppstå etter CpG metylase reaksjon, 30-60% tap.
  8. Kontroller metylering av plasmider via en Hpa II restriksjonskutting. Ta 1 ug metylert eller ikke-metylert DNA og restriksjonskutting med Hpa II i 1 time ved 37 ° C. Bruk 5-10 enheter av Hpa II for hvert mikrogram DNA. Etter Hpa II fordøyelsen, utføre DNA opprydding bruker foretrukket, kommersielt tilgjengelig silika-gel membran rydde opp kit. Kjøre både metylerte CpG og ikke-metylerte plasmider på en 1% agarose-gel i TAE-DNA eller TBE-buffer ved 100 V i 45 min for visualisering (figur 4B).
  9. Lagt både denaturert og ikke-denaturert plasmider til dobbelt fordøyelsen med passende restriksjonsenzymer for å frigjøre full lengde luc 2 (vektor) og CpG island (innsats) fragmenter 38. Utføre dobbelt fordøyelse O / N ved riktig temperatur og varme inaktiverer enzymer følgende fordøyelsen i henhold til produsentens protokoll. Minimalt tap av DNA konsentrasjon oppstår under dobbel restriksjonskutting.
  10. Kjør dobbel fordøyd plasmider på 1% DNA agarosegel ved 100 V i 1 time for å tillate separasjon of vektor og sett (Figur 4C). Forsiktighet. Iført verne UV visir, plasserer DNA gel på en tabletop svart lys til å visualisere band. Basert på størrelse, avgifts metylert og ikke-metylert innsats og ikke-metylert vektor med en ren kirurgisk kniv.
  11. Gel ekstrakt DNA ved hjelp av mettet fenol, pH 6,6. Kort, veie DNA gel som inneholder vektor eller innsatsen. Bruke 100 pl fenol per 0,1 g DNA gel. Homogen DNA gel i fenol bruker glass dounce homogenisator.
  12. Legg kloroform (ved bruk av 1/5 av fenol volum) og rist prøvene i 20 sekunder. Inkuber prøver ved RT i 2-3 min. Sentrifuger i 15 minutter ved maks hastighet (16,1 x 1000 x g) ved 4 ° C.
  13. Fjern vandig løsning og tilsett 0,1 X volum av 3 M natriumacetat og 2,5 ganger volumet etanol. Prøvene inkuberes i 1 time ved -80 ° C. Etter inkubering fjerne etanol og re-suspen DNA i 30 pl av foretrukne buffer. Betydelig tap av DNA skjer følgende isolering av innstikk og vektorer, 30-50% loss.
  14. Re-ligere denaturert og ikke-denaturert inserts til ikke-metylert vektor bruker T4 DNA ligase 38. Bruke et 1: 4 forhold av vektoren for å sette inn for ligeringsreaksjoner. Oppsett reaksjon i henhold til produsentens instruksjoner. Bruke et totalt volum på 50 ul for reaksjoner og inkuberes O / N ved -20 ° C eller på is med lokk over is bøtte.
  15. Etter ligering, utføre DNA opprydding bruker foretrukket, kommersielt tilgjengelig silika-gel membran rydde opp kit. Betydelig tap av DNA oppstå etter ligeringsreaksjon, en tilnærmet 30 til 50% tap av DNA. Kontroller re-ligation ved å kjøre på 1% agarose DNA gel ved 100 V i 45 min og vurdere konsentrasjon av religert plasmider (Figur 4D).
  16. Transfektere denaturert eller ikke-metylerte plasmider inn i D54 celler ved bruk av et kommersielt transfeksjon reagens i henhold til produsentens protokoll. Seed D54 celler bort på 12-brønns plate på en 0,14 x 10 6 celler / brønn.
  17. Etter 24 timer, transfektere celler with like konsentrasjoner av enten (1) ikke-methyated CpG-luc2 plasmid + Renilla eller annen kontroll luciferase vektor eller (2) metylert CpG-luc2 plasmid + Renilla eller annen kontroll luciferase-vektoren.
  18. Tillat å transfektere celler i 24 timer før det utføres to luciferase-assay. Utføre analysen i henhold til produsentens instruksjoner. Utføre målinger ved hjelp av en luminometer. Les hver brønn i triplikat.
  19. Beregn forholdet mellom Firefly luciferaseaktivitet å Renilla eller annen kontroll luciferaseaktivitet. Normal metylert Firefly: kontroll luciferaseaktivitet til ikke-metylert Firefly: kontroll luciferaseaktivitet ved å dele metylert luciferaseaktivitet av ikke-metylert luciferaseaktivitet

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En beriket befolkningen i astrocytter ble kjøpt via FACS sortering av EGFP-S100β transgene dyr 27. På grunn av synkende kvalitet på celler og molekylære molekyler isolert fra dyr som er eldre enn postnatal dag 50 (p50), dyr alderen p0-p40 er optimale for slike eksperimenter. Kortikale vev ble anvendt for disse forsøk. Kortekser fra to til seks dyr ble slått sammen. FACS ble utført ved UAB Omfattende flowcytometrisystemer Kjerne anlegget. Sortering ble utført på Becton Dickinson FacsAria II. EGFP eksitasjon ble oppnådd ved bruk av 488 nm laser; ingen kompensasjon var nødvendig. Et inngjerdet befolkningen ble målrettes basert på fremover og side scatter (figur 1B). En levende celle befolkning ble bestemt ved hjelp av en ethidiumbromid død celle indikator og inngjerdet (figur 1C). To forskjellige populasjoner ble observert basert på EGFP profilen (figur 1D). Gjennom empirisk testing, cellen befolkningen med høyere EGFPProfilen ble identifisert som den EGFP-positive cellepopulasjon (figur 1F-F ''). Visuell analyse av den andre populasjonen med en nedre profil EGFP viste cellefragmenter som uttrykker EGFP, men fri for kjerner, sannsynligvis representerte rusk fra astrocytic prosesser (figur 1G-G ''). Representative bilder av dissosierte EGFP positive astrocytter følgende dissosiasjon men før sortering (Figur 2A) og etter sortering (figur 2B) er vist. Isolert EGFP positive cellepopulasjon demonstrert en 40-dobling i ALDH1L1 mRNA, en astrocytic spesifikk markør 39 (Figur 2C). I tillegg, til tross for felles uttrykk for S100β i NG2 + OPCS og astrocytter 39, observerte vi en 4-gangers reduksjon av NG2 mRNA, en markør for oligodendrocytt forløperceller 39, som indikerer isolering av en anriket astrocytic cellepopulasjon (figur 2C-D). RNAog DNA isolert fra FACS-sortert astrocytter var av tilstrekkelig kvalitet og kvantitet som skal brukes for etterfølgende metylering studier. Total RNA og DNA isolert fra varierende alder og antall dyr er oppført som en referanse for forventet avkastning av molekylære molekyler følgende FACS (tabell 5). Det skal bemerkes at utbyttet vil også variere, avhengig av antall dyr benyttet, inkubasjonstiden, og opplevelse av forskeren. Tabell 6 viser variasjonen av hendelser ervervet avhengig av antall dyr benyttet og inkubasjonsperioder.

For metylering studier, som starter med høy kvalitet og tilstrekkelige mengder DNA er avgjørende for vellykkede nedstrøms applikasjoner. For å sikre tilstrekkelig lyse av vev for RNA eller DNA-ekstraksjon, ble alle homogenisering av vev eller celler etterfulgt av finmaling bruke en 23G nål 7x, ta vare å unngå skumming under lyse. Når høy kvalitet DNA ekstraheres og bisulfite konvertitted, kan regioner av interesse være målrettet for MS-HRMA. Legg merke til at ved vurdering av kvaliteten og konsentrasjonen av bisulfitt konvertert DNA, bør spektrofotometer settes til å lese på en OD faktor på 33 som bisulfitt omdannes DNA er enkelt-trådet. De 260/280 verdier for sulfitt konverterte DNA varierte 2,20 til 2,70.

Før du begynner metylering studier, er det avgjørende å hensiktsmessig velge og kalibrere en termosykler for MS-HRMA studier. I tillegg må man finne ut hvordan du eksporterer og utnytte rådata generert fra MS-HRMA. Applied Biosystems High Resolution Smelte Komme i gang ble benyttet til å bistå i å kalibrere 7900HT termosykler. Endelig data ble ekstrahert og importeres inn i HRM analyseprogramvare for etterfølgende dataanalyse. Som beskrevet i protokollen, før og etter start og stopp parametre ble satt nær overgangene på smeltekurve. Peak temperaturforskjeller ble brukt til å ekstrapolere metylering status av ukjent samples. Estimerte metylering data innhentet fra MS-HRMA tilsvarte nøye til metylering data generert fra pyrosekvensering (pyrosekvensering data ble generert i huset ved hjelp av primere rettet mot samme områdene som MS-HRM primere) (Figur 3C) 15.

En dobbel luciferase-analysen ble anvendt for å vurdere den transkripsjonelle aktivitet av hyper-metylerte regioner av genet av interesse (figur 4A). Hver CpG-island-luc2 plasmid var linearized og deretter denaturert. Imidlertid, fordi både innsatsen (CpG øy) og vektor (luc2) er denaturert under reaksjonen, må man skjære det metylerte innsatsen og re-ligere til et ikke-metylert vektor. På grunn av utstrakt manipulering av plasmidet oppstår betydelige tap, og man må begynne med tilstrekkelig utgangsmateriale. HpaII fordøyelse ble benyttet for å verifisere statusen for metylering hvert plasmid som HpaII kun fordøyer ikke-denaturert DNA (figur 4B). Det bør bemerkes atHvis O / N metylering er utilstrekkelig, kan en ytterligere 1x av SAM og 1x med CpG-metylase tilsettes etter 1 time med inkubering ved 30 ° C. Fortsett O / N inkubasjon følgende tillegg til supplerende SAM og CpG metylase. Generering av metylert og ikke-metylert CpG-island-luc2 plasmid gir mulighet for direkte vurdering av endringer mellom DNA metylering og transkripsjonen aktivitet via måling av luciferaseaktivitet.

Figur 1
Figur 1. FACS sortering isolerer EGFP + cellepopulasjons. (A) Bruk av en 50 ml konisk rør med hull skåret på toppen åpner for overflategassutveksling under papain fordøyelsen. (B) Sortert celler ble inngjerdet basert på termin og side spredningsplott. (C) En etidiumbromid basert død celle indikator ble anvendt for å separere en levende cellepopulasjon (rød). (D) Live-cell befolkningen demonstrert to populasjoner - en med en høy EGFP profil (grønn) og en lav EGFP profil (lilla). For alle grafer, representerer y-aksen side scatter område (SSC-A); X-aksen representerer fremre side scatter område (FSC-A), grønt fluorescerende protein område (GFP-A), eller etidiumbromid (EtBr). (EG) Dissosierte celler ble inkubert med Hoechst og 20 ul av dissosierte celler ble plassert på dekkglass og avbildes. (EE '') EGFP + astrocytter, med omfattende prosesser ble visualisert før sortering (NS). (FF '') Etter sortering, høy EGFP + befolkningen (POS) demonstrere EGFP + celle soma som co-lokalisere med Hoechst farging. (GG '') Lav EGFP befolkningen demonstrerer EGFP + flekker som ikke co-lokalisere med Hoechst flekker, sannsynligvis representerer astrocytic rusk (for alle bildene, skala = 20 mikrometer). VennligstKlikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. FACS sortering av EGFP-S100 betatransgene dyr gir beriket befolkningen i astrocytter. (A) 20 mL av dissosiert celler før FACS (NS) er vist, prosesser forbli intakt (skala = 50 mikrometer). (B) Representant bilde post-FACS (FACS) celler er vist; astrocytic prosessene er fjernet og celle soma restene (skala = 20 mikrometer). (C) qPCR data viser en 40-ganger økning i ALDH1L1 mRNA i FACS-sortert celler (FACS) sammenlignet med ikke sorteres populasjon (NS). (D) NG2 mRNA er redusert med 4 ganger i FACS sorterte celler sammenlignet med ikke sortert befolkningen (NS). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Eksempel på data og analyser for MS-HRM studier. (A) Eksempel på temperaturforskjellen tomter generert fra metylering standarder. Tilsvarende prosent metylering er merket for hver kurve (B) Eksempel på lineær regresjonsligning som genereres fra rotte-metylert standarder. (C) Sammenligning av prosent metylering kjøpt fra pyrosekvensering (pyroseq, grønne søyler) og MS-HRMA (grå søyler) viser tilsvarende nivåer av metylering for varierende regioner av KCNJ10. Pyrosekvensering data generert i huset ved hjelp av primere rettet mot samme områdene som MS-HRM analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

telt "fo: keep-together.within-side =" always "> Figur 4
Figur 4. Dobbel luciferase-analyse gjør det mulig for vurdering av transkripsjonen aktivitet av differensielt denaturert genområder. (A) Diagram av luciferase transkripsjonen aktivitet forsøk viser arbeidsflyten av protokollen. (B) DNA gel viser forskjeller i metylert versus ikke-metylert plasmider følgende HpaII fordøyelsen. Non-metylert DNA er lett fordøyd følgende HpaII fordøyelsen forhold til metylert DNA, viser vellykket metylering av DNA plasmid. (C) DNA-gel viser separasjon av vektor fra innsatsen følgende dobbel fordøyelse. Etter DNA separasjon, vektor og innsatsen er gel hentet. (D) DNA gel demonstrerer vellykket re-ligering av vektor og innsatsen. Religert plasmid besitter tilsvarende molekylvekt som ubehandlet plasmid (uNTx). NM, ikke-oppfylthylated; M, metylert; RL, re-ligert; uNTx, ubehandlet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

. Volum (mL) x3 + 10% overskudd x # av prøver
MeltDoc MM 10 mL 33 mL
Primer 1 1,2 mL 3.96 mL
Primer 2 1,2 mL 3.96 mL
gDNA 1 mL ---
dH 2 0 6.6 mL 21.78 ul

Tabell 1. Eksempel på beregning av MeltDoctor Mastermix. Kjør hver MS-HRM reaDette skjer i tre eksemplarer med 10% overskudd for å kompensere for pipetteringsfeil. Siste kolonne viser beregningen behov for flere numre av prøver. Totalt volum for hver reaksjon er 20 pl.

Cycle Temp (° C) Tid (sek) Ramp rate (%)
95 ° C 15 100
40x 95 ° C 15 100
60 ° C : 60 100
Smelte parametere 95 ° C : 10 100
60 ° C : 60 100
95 ° C 15 1
60 ° C 15 100
Hold 4 76; C

Tabell 2:. Prøve protokoll for amplifisering denaturerte prøver ved 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 40 sykluser med amplifikasjon og generering av smeltekurve. Smelte parametere er oppført i tabellen. Oppmerksom på endring i rampehastighet som gir mulighet for kjøp av høyoppløst smeltetemperatur.

Prosent Metylering (Rat Standard) Peak Temperature Difference
y x
0 5.670116
5 10,70448
10 15,5044
25 25,52295
50 34,43047
75 43,80894
100 53,88717
nt "> Tabell 3. Eksempel på topptemperaturforskjellsdata. Prosent metylering standard er merket som y-koordinat. Peak temperaturforskjellen data er angitt som x-koordinaten. Representative topptemperaturforskjell ble innsamlet ved hjelp av MS-HRM fra en gen-området.

Peak Temp Difference Estimert metylering
X Y
Prøve 1 (n = 4)
47,450 81,115
46,292 78,657
41,694 68,894
47,292 80,779
Prøve 2 (n = 4)
29,925 43,904
24,269 31,894
25,061 33,575
25,389 34,272

Tabell 4. Eksempel på beregnet beregnet prosent metylering. Peak temperaturforskjell på prøver av ukjent metylering status brukes for å beregne prosent metylering ved anvendelse av en lineær regresjon. Representative data fra to forskjellige tilstander, utvalg 1 og utvalg 2, vises; n = 4 for hver tilstand.

Alder Antall dyr Total RNA (ng) Total DNA (ng)
p4-p10 3-6 455-868 265-1523
p19-p22 1-2 220-680 583-1483
p40-p50 3-4 198-260 578-1700

Tabell 5. Total RNA og DNA kjøpt fra FACS sortert celler Age. Og antall dyr som brukes i FACS eksperimenter er oppført. Oppmerksom, ble begge cortices utnyttet for hver N. Total RNA og DNA er oppført som en referanse for forventet avkastning.

Alder Antall dyr Pos Hendelser Neg Hendelser Inkubasjonstid (ved 37 ° C)
p26 1 2.18X10 ^ 6 1.15X10 ^ 6 20:00 min
p26 2 4.4X10 ^ 6 2.78X10 ^ 6 20:00 min
p26 2 9.2X10 ^ 6 3.3X10 ^ 6 30:00 min

Tabell 6. Antall hendelser ervervet fra FACS på postnatal dag 26. På p26 rekke positive (EGFP +) hendelser og negative hendelser varierer avhengig av antall dyr som brukes og inkubasjonstid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150
AllPrep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204
Methyl Primer Applied Biosystems online software to localize CpG Islands
EZ DNA methylation Kit Zymo Research D5001
Rat Premixed Calibration Standard EpiGenDx 80-8060R-Premix
CpG Methylase (M.Sssl) Zymo Research E2010
QIAquick Gel Extraction  QIagen 28704 Used for gel extraction and DNA cleanup
Restriction enzymes New England BioLabs
NEB cutter New England BioLabs online verify restriction digest sites
Dual Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Luc2 vector, pGL4.10 Promega E6651
renilla vector, pGL4.74 Promega E2241
TD-20/20 Luminometer Turner Designs
Lipofectamine LTX and Plus Reagent Life Technologies A12621
Phenol, saturated pH 6.6/6.9 Fisher Scientific BP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer ThermoScientific
MeltDoctor Master Mix Life Technologies 4415440
High Resolution Melt (HRM) Software v2.0 Life Technologies 4397808
AB SDS software v2.3 Life Technologies online
AB High Resolution Melting Getting Started Guide  Life Technologies online
AB 7900HT Fast Real-Time System Life Technologies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16 (1), 6-21 (2002).
  2. Deaton, A. M., Bird, A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25, 1010-1022 (2011).
  3. Lorincz, M. C., Dickerson, D. R., Schmitt, M. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells. Nat Struct. Mol Biol. 11 (11), 1068-1075 (2004).
  4. Moore, L. D., Le, T. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacol. 38, 23-38 (2013).
  5. Santos, K. F., Mazzola, T. N. The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Braz.J.Med.Biol.Res. 38 (10), 1531-1541 (2005).
  6. Day, J. J., Sweatt, J. D. Cognitive neuroepigenetics: a role for epigenetic mechanisms in learning and memory. Neurobiol. Learn.Mem. 96, 2-12 (2011).
  7. Denk, F., McMahon, S. B. Chronic pain: emerging evidence for the involvement of epigenetics. Neuron. 73, 435-444 (2012).
  8. Endres, M., et al. DNA methyltransferase contributes to delayed ischemic brain injury. J. Neuroscience. 20 (9), 3175-3181 (2000).
  9. Qureshi, I. A., Mehler, M. F. Emerging role of epigenetics in stroke: part 1: DNA methylation and chromatin modifications. Arch.Neurol. 67, 1316-1322 (2010).
  10. Tian, R., et al. disease mutant glial fibrillary acidic protein compromises glutamate transport in astrocytes. J Neuropathol. Exp Neurol. 69, 335-345 (2010).
  11. Perisic, T., Holsboer, F., Rein, T. The CpG island shore of the GLT-1 gene acts as a methylation-sensitive enhancer. Glia. 60 (9), 1345-1355 (2012).
  12. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  13. Poopalasundaram, S., et al. Glial heterogeneity in expression of the inwardly rectifying K+ channel, Kir4.1, in adult rat CNS. Glia. 30, 362-372 (2000).
  14. Hibino, H., Fujita, A., Iwai, K., Yamada, M. Differential assembly of inwardly rectifying K+ channel subunits. Kir4.1 and Kir5.1, in brain astrocytes. 279, 44065-44073 (2004).
  15. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  16. Li, L., Head, V. Identification of an inward rectifier potassium channel gene expressed in mouse cortical astrocytes. Glia. 33, 57-71 (2001).
  17. Kucheryavykh, Y. V., et al. Downregulation of Kir4.1 inward rectifying potassium channel subunits by RNAi impairs potassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes. Glia. 55 (3), 274-281 (2007).
  18. Djukic, B., Casper, K. B., Philpot, B. D., Chin, L. S. Conditional knock-out of Kir4.1 leads to glial membrane depolarization, inhibition of potassium and glutamate uptake, and enhanced short-term synaptic potentiation. J. Neuroscience. 27, 11354-11365 (2007).
  19. Fujita, A., et al. Clustering of Kir4.1 at specialized compartments of the lateral membrane in ependymal cells of rat brain. Cell Tissue Res. 359 (2), 627-634 (2015).
  20. MacFarlane, S. N., Sontheimer, H. Electrophysiological changes that accompany reactive gliosis in vitro. J Neuroscience. 17 (19), 7316-7329 (1997).
  21. Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R. Impaired K(+) homeostasis and altered electrophysiological properties of post-traumatic hippocampal glia. J. Neuroscience. 19 (18), 8152-8162 (1999).
  22. Anderova, M., et al. Voltage-dependent potassium currents in hypertrophied rat astrocytes after a cortical stab wound. Glia. 48 (4), 311-326 (2004).
  23. Olsen, M. L., Campbell, S. C., McFerrin, M. B., Floyd, C. L. Spinal cord injury causes a wide-spread, persistent loss of Kir4.1 and glutamate transporter 1: benefit of 17 beta-oestradiol treatment. Brain. 133, 1013-1025 (2010).
  24. Koller, H., Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Time course of inwardly rectifying K(+) current reduction in glial cells surrounding ischemic brain lesions. Brain Res. 872, 1-2 (2000).
  25. Bordey, A., Lyons, S. A., Hablitz, J. J. Electrophysiological characteristics of reactive astrocytes in experimental cortical dysplasia. J Neurophysiol. 85 (4), 1719-1731 (2001).
  26. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P. plating, and maintenance of cortical astrocyte cultures. 8, Cold Spring. 10-1101 (2009).
  27. Itakura, E., et al. Generation of transgenic rats expressing green fluorescent protein in S-100beta-producing pituitary folliculo-stellate cells and brain astrocytes. Endocrinology. 148, 1518-1523 (2007).
  28. Foo, L. C. Purification of astrocytes from transgenic rodents by fluorescence-activated cell sorting. Cold Spring Harb.Protoc. 2013, 551-560 (2013).
  29. Smith, C., Otto, P., Bitner, R. A silica membrane-based method for the isolation of genomic DNA from tissues and cultured cells. CSH. Protoc. 2006, 2006-201 (2006).
  30. Sambrook, J., Russell, D. W. A Single-step Method for the Simultaneous Preparation. of DNA, RNA, and Protein from Cells and. 1, 2006-201 (2006).
  31. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K. Quantitation of DNA and. , (2007).
  32. Zhao, Z., Han, L. CpG islands: algorithms and applications in methylation studies. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 643-645 (2009).
  33. Srivastava, G. P., Guo, J., Shi, H. PRIMEGENS-v2: genome-wide primer design for analyzing DNA methylation patterns of CpG islands. Bioinformatics. 24, 1837-1842 (2008).
  34. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J.Vis.Exp.(56), doi:3170 [pii];10.3791/3170. , (2011).
  35. Drummond, G. B., Vowler, S. L. Categorized or continuous? Strength of an association-and linear regression. Adv.Physiol Educ. 36, 89-92 (2012).
  36. Sambrook, J., Russell, D. W. The basic polymerase chain reaction. CSH.Protoc. 1, (2006).
  37. Arpa, P. Strategies for cloning PCR products. Cold Spring Harb.Protoc. 8, (2009).
  38. Makovets, S. Basic DNA electrophoresis in molecular cloning: a comprehensive guide for beginners. Methods Mol.Biol. 1054, 11-43 (2013).
  39. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neuroscience. 28, 264-278 (2008).
  40. Maldonado, P. P., Velez-Fort, M., Levavasseur, F. Oligodendrocyte precursor cells are accurate sensors of local K+ in mature gray matter. J Neuroscience. 33, 2432-2442 (2013).
  41. Kalsi, A. S., Greenwood, K., Wilkin, G. Kir4.1 expression by astrocytes and oligodendrocytes in CNS white matter: a developmental study in the rat optic nerve. J.Anat. 204, 475-485 (2004).
  42. Higashi, K., et al. An inwardly rectifying K(+) channel, Kir4.1, expressed in astrocytes surrounds synapses and blood vessels in brain. Am.J.Physiol Cell Physiol. 281 (3), (2001).
  43. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  44. Neusch, C., Rozengurt, N., Jacobs, R. E., Lester, H. A. Kir4.1 Potassium Channel Subunit Is Crucial for Oligodendrocyte Development and In Vivo Myelination. J. Neuroscience. 21 (15), 5429-5438 (2001).
  45. Kofuji, P., et al. Genetic Inactivation of an Inwardly Rectifying Potassium Channel (Kir4.1 Subunit) in Mice: Phenotypic Impact in Retina. J. Neuroscience. 20 (15), 5733-5740 (2000).
  46. Kofuji, P., Connors, N. C. Molecular substrates of potassium spatial buffering in glial cells. Mol.Neurobiol. 28, 195-208 (2003).
  47. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  48. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high-resolution melting. Nat.Protoc. 3, 1903-1908 (2008).
  49. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res. 35, 10-1093 (2007).
  50. Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nat.Rev.Genet. 11, 191-203 (2010).

Tags

Molecular Biology DNA metylering MS-HRMA Luciferase promoter analysen FACS Astrocytter Kir4.1,
Korrelere genspesifikke DNA metylering Endringer med Expression og Transkripsjonell Aktivitet av astrocytic<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nwaobi, S. E., Olsen, M. L.More

Nwaobi, S. E., Olsen, M. L. Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1). J. Vis. Exp. (103), e52406, doi:10.3791/52406 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter