Protocol
Todos los animales fueron tratados de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud. El Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Alabama en Birmingham aprobó el uso de animales.
1. La obtención de ARN y ADN de un Enriquecido astrocíticos Población que utiliza fluorescente clasificación de células activadas (FACS) de astrocitos del tejido cerebral entera
- Animales tranquilo con CO 2 durante 1 minuto y luego decapitar rápidamente. Diseccionar cortezas como se describe en Albuquerque et al, 26.; no es necesario para eliminar meninges.
Nota: Las ratas transgénicas que expresan eGFP bajo la S100β (un marcador de astrocitos) promotor se generaron por Itakura et al 27 y se utilizan para FACS clasificación de los astrocitos.. - Preparar homogeneizado de todo el cerebro usando un kit de disociación de papaína bajo condiciones no estériles de acuerdo con el protocolo del fabricante. Calor a activar la papaína a 37 ° C en baño de agua durante 10 minutos. Nota:Solución de papaína es proporcionada por el fabricante y contiene L-cisteína y EDTA (Ver Tabla de Materiales).
- Cortar o dremel un agujero en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml para permitir que la tubería que lleva 95% O 2: 5% de CO 2 que se introduce en un tubo cónico de cerrada (figura 1A). Coloque cortezas disecados en 10 mm placa de cultivo que contienen medios de disociación (MEM suplementado con glucosa 20 mM y penicilina / estreptomicina (500 U / ml) y se equilibró a 95% O 2: 5% de CO 2) y el uso de una hoja de afeitar limpia para picar el tejido en 1 x 1 mm 2 piezas.
- Tejido de transferencia utilizando 10 ml Pipetman manual de 50 ml tubo cónico que contienen solución de papaína. Permitir que el tejido se asiente a la parte inferior de la pipeta de transferencia antes de la descarga para minimizar la cantidad de medios de disociación prorrogados. Mantenga solución de papaína se equilibró a 95% O 2: 5% de CO 2 a través de la superficie de intercambio de gases durante la duración de la incubación. No burbuja papaína solutien. Incubar el tejido durante 20 minutos en 37 ° C baño de agua.
- Después de la incubación en solución de papaína, el tejido triturado 10 veces con una pipeta 10 ml de transferencia a baja velocidad. Centrifugar la suspensión celular nublado en 1000 xg durante 5 min a TA.
- Equilibrar solución de inhibidor de ADNasa / albúmina (proporcionado por el fabricante) a través de intercambio de gas de la superficie y volver a suspender las células sedimentadas en 3 ml de solución de inhibidor / albúmina de DNasa. Preparar gradiente comercial de densidad discontinuo, siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Girar gradiente de densidad discontinua en 1000 xg durante 6 min. Aislar las células disociadas a partir de la parte inferior del tubo por la succión pellet parte inferior usando una pipeta.
- Vuelva a suspender las células disociadas en 2-3 ml de DPBS con 0,02% de albúmina de suero bovino y 1 mg / ml de DNasa o HEPES preferidos tamponadas medios de cultivo. Pasar a través de 40 micras filtro antes de FACS (Figura 2A). Mantener las células en hielo hasta la clasificación.
- Realizar FACS 28. </ li>
- Células de pellets de 1,5 ml tubos de centrifugación a 2.000 xg durante 5 min a 4 ° C.
Nota: los astrocitos sedimentaron se pueden utilizar inmediatamente o mantenerse en -80 ° C hasta la extracción de ADN.
- Extracto de ARN y el ADN utilizando el método de aislamiento preferido 29 30. Evaluar ARN y la concentración de ADN y la calidad a través de espectrofotómetro y bioanalizador 31.
Nota: Utilizar únicamente ARN de alta calidad y de ADN en los pasos siguientes, 260/280 = 2,0 a 2,2 y 1,8 a 1,9, respectivamente. Análisis Bioanalyzer es esencial para evaluar la degradación del ARN o la fragmentación del ADN. ARN o ADN pueden ser utilizados inmediatamente o almacenados en -80 ° C o -20 ° C, respectivamente, para estudios posteriores.
2. La evaluación de metilación del ADN de estado de un gen utilizando Análisis Melt metilación sensible a alta resolución (MS-HRMA)
- Introduzca la secuencia del gen de interés en software de mapas de metilación en línea preferido para identificar cualquier islas CpG en el gende interés 32.
- Diseño cebadores contra bisulfito convierten secuencia de ADN 33 y amplifican utilizando ADN polimerasa preferida de acuerdo con el protocolo del fabricante. Verificar el tamaño del producto amplificado mediante la ejecución de un gel de agarosa al 1% de ADN a 100 V durante 45 min. Cebadores Tienda en concentración madre de 20 micras de -20 ° C.
- Bisulfito convertir 500-1.000 ng de ADN de cada muestra y de ADN metilado normas que van desde 0 hasta 100% de la misma especie animal 34. Eluir las muestras para proporcionar una concentración de 20 ng / l. Verifique concentración de ADN convertida bisulfito mediante espectrofotómetro 31.
- Configuración 20 reacciones mu l para la amplificación de MS-GRH usando ADN polimerasa preferido y cebadores a las 5 de la concentración micras, de conformidad con la Tabla 1 y 2. Ejecute todas las muestras, incluyendo ADN y metilados normas FACS, por triplicado.
- Dependiendo de software de análisis, ajuste antes y después de iniciar y detener parámetrosalrededor de las transiciones de la curva de fusión. Set de inicio pre-fusión y los parámetros de parada antes de la fusión en lo que la diferencia entre los dos es desde 0,2 hasta 0,5 ° C. Establecer inicio posterior a la fusión y posterior a la fusión detener de manera similar. Extraer datos de diferencia de temperatura máxima para cada muestra.
- El uso de estándares ciento metilados (y-valor) y sus correspondientes diferencias de temperatura pico promedio (x-valor) generar una ecuación de regresión lineal (Figura 3A-B, Tabla 3.4). Utilice esta ecuación de regresión lineal para estimar el estado de metilación de muestras desconocidas 35.
3. Evaluar-metilado Hyper Promotor Actividad través Uso de ensayo de luciferasa
- Identificar las islas CpG de gen diana (Paso 2.1). Amplificar por PCR las regiones de interés 36 y el clon aguas arriba del gen informador de la luciferasa de la luciérnaga luc2 para producir plásmidos CpG-island-luc2 37.
- Linealizar 30 g de plásmido CpG isla luc2 través de la restriccióndigestión con enzimas de 38. Verificar los sitios de digestión de restricción y evitar cortes dobles utilizando el software de corte preferido 38. Heat-inactivar enzimas a temperatura y duración adecuada digestión siguientes de acuerdo con el protocolo del fabricante. Pérdida mínima de ADN se produce durante el paso de linealización.
- Metilato plásmidos linealizadas utilizando CpG metilasa (M.Sssl) O / N a 30 ° C o dejar sin tratar fabricante de protocolo siguiente a excepción de los siguientes ajustes.
- Realizar 50 reacciones mL.
- Utilice 5 unidades de CpG metilasa para metilar 700 ng de plásmido linealizado.
- Ejecute reacciones O / N de 13 a 19 h.
- Después de la reacción metilasa de CpG, realice la limpieza de ADN utilizando estándar, comercialmente membrana de gel de sílice disponibles limpiar kit de acuerdo con el protocolo del fabricante. Pérdidas significativas de ADN ocurren siguiente reacción metilasa de CpG, la pérdida de 30 a 60%.
- Verificar la metilación de los plásmidos a través de una digestión de restricción Hpa II. Tome 1 g de ADN metilado o no metilado y digestión de restricción con Hpa II durante 1 hora a 37 ° C. Utilice 5-10 unidades de Hpa II para cada g de ADN. Después de la digestión Hpa II, realice la limpieza de ADN utilizando preferido membrana disponible comercialmente de gel de sílice limpiar kit. Ejecutar ambos plásmidos metiladas y no metiladas CpG DNA en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE o TBE a 100 V durante 45 min para la visualización (Figura 4B).
- Asunto tanto metilado y no metilado plásmidos a doble digestión con enzimas de restricción apropiadas para liberar de larga duración luc 2 (vector) y la isla CpG (inserto) fragmentos 38. Realice doble digestión O / N a la temperatura adecuada y enzimas que inactivan calor después de la digestión de acuerdo con el protocolo del fabricante. Mínima pérdida de la concentración de ADN se produce durante la restricción doble digestión.
- Ejecutar plásmidos digeridos doble sobre 1% gel de agarosa de ADN a 100 V durante 1 h para permitir la separación of vector e inserte (Figura 4C). Precaución. El uso de protección UV protector de cara, coloque gel de ADN en una luz negro mesa para visualizar las bandas. Basado en el tamaño, el consumo de inserción metilado y no metilado y no metilado vector utilizando una cuchilla quirúrgica limpia.
- Gel de ADN usando extracto de fenol saturado, pH 6,6. En pocas palabras, pesar gel de ADN que contiene vector o inserto. Utilice 100 l de fenol por 0,1 gramos de gel de ADN. Homogeneizar gel de ADN en fenol utilizando homogeneizador Dounce vidrio.
- Añadir cloroformo (usando un quinto del volumen de fenol) y agitar muestras durante 20 s. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 2-3 min. Centrifugar durante 15 minutos a velocidad máxima (16,1 x 1000 x g) a 4 ° C.
- Retire la solución acuosa y añadir volumen 0,1X de 3 M de acetato de sodio y el volumen 2,5X de etanol. Incubar las muestras durante 1 hora a -80 ° C. Después de la incubación, retirar el etanol y resuspender el ADN en 30 l de tampón preferido. Pérdida significativa de ADN se produce después del aislamiento de insertos y vectores, el 30-50% loss.
- Re-ligar las inserciones metilados y no metilados a vector no metilado utilizando ADN ligasa de T4 38. Utilice una proporción de 1: 4 de vector para insertar para reacciones de ligación. Reacción de instalación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Use un volumen total de 50 l para las reacciones e incubar O / N a -20 ° C o en hielo con tapa sobre el cubo de hielo.
- Después de la ligación, realice la limpieza de ADN utilizando preferido membrana disponible comercialmente de gel de sílice limpiar kit. Pérdida significativa de ADN ocurrir después de reacción de ligación, un aproximado de la pérdida de 30 a 50% de ADN. Verificar re-ligación mediante la ejecución en 1% de gel de agarosa de ADN a 100 V durante 45 min y evaluar la concentración de plásmidos re-ligado (Figura 4D).
- Transfectar plásmidos metiladas o no metiladas en células D54 usando un reactivo de transfección comercial según el protocolo del fabricante. Células D54 semilla sobre la placa de 12 pocillos en un 0.14 x 10 6 células / pocillo.
- Después de 24 horas, las células transfectar wiconcentraciones iguales th de cualquiera de (1) plásmido no methyated CpG-luc2 + Renilla luciferasa u otro vector de control o (2) metilado CpG-plásmido luc2 + Renilla luciferasa u otro vector de control.
- Permitir a las células para transfectar durante 24 horas antes de realizar el ensayo de luciferasa dual. Realizar ensayo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Realizar lecturas utilizando un luminómetro. Lea cada pocillo por triplicado.
- Calcular la relación de la actividad luciferasa de la luciérnaga de Renilla u otra actividad luciferasa control. Normalizar metilado Firefly: actividad luciferasa control para Firefly no metilado: actividad de la luciferasa de control al dividir la actividad luciferasa metilado por la actividad de la luciferasa no metilado
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Una población enriquecida de astrocitos fue adquirida a través de FACS clasificación de eGFP-S100β animales transgénicos 27. Debido a la disminución de la calidad de las células y moléculas moleculares aisladas de animales mayores de postnatal día 50 (p50), animales p0-p40 edades son óptimas para este tipo de experimentos. Tejido cortical se utilizó para estos experimentos. Cortezas de dos a seis animales se agruparon juntos. FACS se realizó en las instalaciones de la UAB Integral de Citometría de Flujo. Ordenando se realizó en Becton Dickinson FACSAria II. eGFP de excitación se obtuvo utilizando láser 488 nm; sin compensación era necesaria. Una población cerrada fue blanco basado en dispersión frontal y lateral (Figura 1B). Una población de células vivas se determinó usando un indicador de bromuro de etidio de células muertas y cerrada (Figura 1C). Se observaron dos poblaciones diferentes basado en el perfil eGFP (Figura 1D). A través de pruebas empíricas, la población de células con una mayor eGFPel perfil se identificó como la población de células eGFP-positivo (Figura 1F-F ''). El análisis visual de la segunda población con un perfil más bajo eGFP reveló fragmentos de células que expresan eGFP, pero desprovisto de núcleos, es probable que representa los residuos de procesos astrocíticos (Figura 1G-G ''). Imágenes representativas de disociadas astrocitos positivos eGFP siguientes disociación pero antes de la clasificación (Figura 2A) y después de la clasificación (Figura 2B) se muestran. Aislada población de células positivas eGFP demostró un aumento de 40 veces en ALDH1L1 ARNm, un marcador específico de astrocitos 39 (Figura 2C). Además, a pesar de la expresión compartida de S100β en NG2 + OPCs y astrocitos 39, se observó una reducción de 4 veces de NG2 mRNA, un marcador para las células precursoras de oligodendrocitos 39, lo que indica el aislamiento de una población de células astrocytic enriquecido (Figura 2C-D). ARNy ADN aislado de FACS ordenadas astrocitos fueron de calidad y en cantidad suficiente para ser utilizado para los estudios de metilación posteriores. Total RNA y el ADN aislado de distintas edades y número de animales aparece como una referencia para el rendimiento esperado de moléculas moleculares siguiente FACS (Tabla 5). Cabe señalar que el rendimiento también puede variar en función del número de animales utilizados, período de incubación, y la experiencia de investigador. Tabla 6 demuestra la variabilidad de los eventos adquiridos dependiendo del número de animales utilizados y los períodos de incubación.
Para los estudios de metilación, comenzando con alta calidad y cantidades suficientes de ADN es esencial para las aplicaciones posteriores de éxito. Para asegurar la lisis suficiente de tejido para el ARN o la extracción de ADN, todo homogeneización de tejido o células fue seguido por trituración usando una aguja 23G 7x, teniendo cuidado de evitar la formación de espuma durante la lisis. Una vez que el ADN de alta calidad se extrae y converso bisulfitoed, regiones de interés puede ser objeto de MS-HRMA. Tenga en cuenta que la hora de evaluar la calidad y la concentración de ADN convertido con bisulfito, espectrofotómetro debe ajustarse para leer en un factor de 33 OD como bisulfito convierte ADN es de cadena sencilla. Los valores de 260/280 para el ADN convertido con bisulfito variaron desde 2,20 hasta 2,70.
Antes de iniciar los estudios de metilación, es fundamental para seleccionar de manera adecuada y calibrar un termociclador para los estudios de MS-HRMA. Además, hay que determinar cómo exportar y utilizar los datos brutos generados desde MS-HRMA. Applied Biosystems alta resolución fusión Guía de inicio se utiliza para ayudar en la calibración del termociclador 7900HT. Por último, los datos se extrajo y se importa en el software de análisis de gestión de recursos humanos para el análisis posterior de los datos. Como se detalla en el protocolo, la validez y el inicio de correos y dejan de parámetros se establecieron cerca de las transiciones de la curva de fusión. Se utilizaron las diferencias de temperatura máximas para extrapolar estado de metilación de sa desconocidamples. Metilación de datos estimados adquiridos desde MS-HRMA correspondían estrechamente a los datos generados a partir de metilación pirosecuenciación (datos pirosecuenciación se generó en la casa utilizando cebadores dirigidos mismas regiones como cebadores MS-GRH) (Figura 3C) 15.
Un ensayo de luciferasa dual se utilizó para evaluar la actividad transcripcional de las regiones hiper-metilado del gen de interés (Figura 4A). Cada plásmido CpG isla luc2 fue linealizado y luego metilado. Sin embargo, debido a que tanto el inserto (isla CpG) y vector (luc2) están metilado durante la reacción, hay que escinden el inserto que metilado y re-ligado a un vector no metilado. Debido a la extensa manipulación del plásmido, se producen pérdidas importantes y hay que comenzar con el material de partida suficiente. Digestión HpaII se utilizó para verificar el estado de metilación de cada plásmido como HpaII solamente digiere ADN no metilado (Figura 4B). se debe notar queSi O / N metilación es insuficiente, una 1x adicional de SAM y 1x de CpG metilasa se pueden añadir después de 1 h de incubación a 30 ° C. Continuar O / N de incubación tras la adición de suplementos de metilasa SAM y CpG. Generación de plásmido CpG-island-luc2 metilado y no metilado permite la evaluación directa de los cambios entre la metilación del ADN y la actividad transcripcional a través de medición de la actividad de luciferasa.
Figura 1. FACS clasificación aísla popoulation células eGFP +. (A) El uso de un tubo cónico de 50 ml con el corte del agujero en la parte superior permite el intercambio de gases superficie durante la digestión con papaína. (B) Las células clasificadas fueron cerrada basado en dispersión frontal y lateral parcelas. (C) Un indicador de bromuro de etidio de células muertas basado se utilizó para puerta de una población de células vivas (rojo). (D) cel Vivol población demostró dos poblaciones - uno con un alto perfil eGFP (verde) y un perfil bajo eGFP (morado). Para todos los gráficos, eje y representa el área de dispersión lateral (SSC-A); eje x representa área delantera dispersión lateral (FSC-A), zona verde proteína fluorescente (GFP-A), o bromuro de etidio (EtBr). (EG) las células disociadas se incubaron con Hoechst y 20 l de células disociadas se colocó en cubreobjetos y la imagen. (EE '') eGFP + astrocitos, con los procesos extensos se visualizaron antes de la clasificación (NS). (FF '') Después de la clasificación, alta eGFP + población (POS) demuestran soma celular eGFP + que co-localizar con la tinción de Hoechst. (GG '') Población bajo eGFP demuestra tinción eGFP + que no co-localizar con la tinción de Hoechst, es probable que representan los desechos astrocítica (para todas las imágenes, escala = 20 micras). Por favor,haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. FACS clasificación de EGFP-S100 ß animales transgénicos proporcionan población enriquecida de los astrocitos. (A) se muestran 20 l de células disociadas antes FACS (NS), procesos permanecen intactos (escala = 50 micras). (B) Imagen Representante post-FACS células (FACS) se muestran; procesos astrocíticos se retiran y restos soma celular (escala = 20 micras). De datos (C) qPCR demuestra un aumento de 40 veces en ALDH1L1 mRNA en células ordenadas FACS (FACS) en comparación con la población no ordenados (NS). (D) mRNA NG2 se reduce en 4 veces en la FACS ordenados células en comparación con la población no ordenados (NS). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Los datos y análisis de muestras para estudios de MS-GRH. (A) Ejemplo de parcelas de diferencia de temperatura generados a partir de las normas de metilación. Correspondiente ciento metilación está marcado para cada curva (B) Ejemplo de ecuación de regresión lineal generada a partir de estándares de rata metilado. (C) La comparación del porcentaje de metilación adquirido de pirosecuenciación (pyroseq, barras verdes) y MS-HRMA (barras grises) demuestra niveles similares de metilación para variar regiones de KCNJ10. Datos Pyrosequencing generados en casa utilizando cebadores dirigidos mismas regiones como MS-GRH análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. ensayo de luciferasa Dual permite la evaluación de la actividad transcripcional de las regiones de genes diferencialmente metilado. (A) Diagrama de luciferasa transcripcional ensayo de actividad demuestra el flujo de trabajo de protocolo. Muestra (B) de gel de ADN metilado frente a las diferencias en los plásmidos no metilado siguientes digestión HpaII. ADN no metilado se digiere fácilmente después de la digestión HpaII en comparación con el ADN metilado, demostrando el éxito de metilación del ADN del plásmido. (C) de gel de ADN demuestra la separación de vector de inserción siguiente doble digestión. Después de la separación de ADN, el vector y el inserto son de gel extraído. (D) en gel de ADN demuestra exitosa re-ligación del vector y el inserto. Re-plásmido se ligó posee peso molecular similar como un plásmido sin tratar (uNTx). NM no cumplen,hylated; M, metilada; RL, re-ligado; uNTx, sin tratar. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| . | Volumen (l) | x3 + 10% de exceso | x # de muestras |
| MeltDoc MM | 10 l | 33 l | |
| Primer 1 | 1.2 l | 3,96 l | |
| Primer 2 | 1.2 l | 3,96 l | |
| gDNA | 1 l | --- | |
| dH 2 0 | 6.6 l | 21.78 l |
Tabla 1. Ejemplo de cálculo de MeltDoctor Mastermix. Ejecutar cada rea de MS-GRHcción por triplicado con 10% de exceso para compensar el error de pipeteado. Última columna indica el cálculo necesario para múltiples números de muestras. Volumen total para cada reacción es de 20 l.
| Ciclo | Temperatura (° C) | Tiempo (seg) | Tasa de rampa (%) |
| 95 ° C | :15 | 100 | |
| 40x | 95 ° C | :15 | 100 |
| 60 ° C | : 60 | 100 | |
| Parámetros de fusión | 95 ° C | : 10 | 100 |
| 60 ° C | : 60 | 100 | |
| 95 ° C | :15 | 1 | |
| 60 ° C | :15 | 100 | |
| Mantener | 4 76; C |
Tabla 2:. Protocolo de muestra para la amplificación desnaturalizan las muestras a 95 ° C durante 10 min seguido de 40 ciclos de amplificación y la generación de la curva de fusión. Parámetros de fusión se enumeran en la tabla. Nota cambio en la velocidad de rampa que permite la adquisición de alta temperatura de fusión resolución.
| La metilación Porcentaje (rata del estándar) | Pico Diferencia de temperatura |
| y | X |
| 0 | 5.670116 |
| 5 | 10.70448 |
| 10 | 15.5044 |
| 25 | 25.52295 |
| 50 | 34.43047 |
| 75 | 43.80894 |
| 100 | 53.88717 |
| Diferencia de temperatura pico | Metilación estimado |
| X | Y |
| Muestra 1 (n = 4) | |
| 47.450 | 81.115 |
| 46.292 | 78.657 |
| 41.694 | 68.894 |
| 47.292 | 80.779 |
| Muestra 2 (n = 4) | |
| 29.925 | 43.904 |
| 24.269 | 31.894 |
| 25.061 | 33.575 |
| 25.389 | 34.272 |
Tabla 4. Ejemplo de metilación calculado por ciento estimado. Diferencia de temperatura pico de muestras de estado de metilación desconocido se utiliza para estimar ciento metilación usando una ecuación de regresión lineal. Los datos representativos de dos condiciones diferentes, muestra 1 y muestra 2, se muestran; n = 4 para cada condición.
| Años | Número de animales | El ARN total (ng) | El ADN total (ng) |
| p4-p10 | 3.6 | 455 hasta 868 | 265-1523 |
| p19-p22 | 1-2 | 220 a 680 | 583-1483 |
| p40-p50 | 3.4 | 198 hasta 260 | 578-1700 |
Tabla 5. Total de ARN y ADN adquirido de FACS ordenados células. La edad y el número de animales utilizados en la FAExperimentos CS se enumeran. Tenga en cuenta, ambas corticales se utilizaron para cada N. total de ARN y ADN aparece como una referencia para el rendimiento esperado.
| Años | Número de animales | Pos Eventos | Neg Eventos | El tiempo de incubación (a 37 ° C) |
| p26 | 1 | 2.18X10 ^ 6 | 1.15X10 ^ 6 | 20:00 min |
| p26 | 2 | 4.4X10 ^ 6 | 2.78X10 ^ 6 | 20:00 min |
| p26 | 2 | 9.2X10 ^ 6 | 3.3X10 ^ 6 | 30:00 min |
Tabla 6. Número de eventos adquiridos de FACS en el día postnatal 26. En el número de p26 (EGFP +) acontecimientos positivos y los acontecimientos negativos varía dependiendo del número de animales utilizados y período de incubación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| Methyl Primer | Applied Biosystems | online | software to localize CpG Islands |
| EZ DNA methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Rat Premixed Calibration Standard | EpiGenDx | 80-8060R-Premix | |
| CpG Methylase (M.Sssl) | Zymo Research | E2010 | |
| QIAquick Gel Extraction | QIagen | 28704 | Used for gel extraction and DNA cleanup |
| Restriction enzymes | New England BioLabs | ||
| NEB cutter | New England BioLabs | online | verify restriction digest sites |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Luc2 vector, pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| renilla vector, pGL4.74 | Promega | E2241 | |
| TD-20/20 Luminometer | Turner Designs | ||
| Lipofectamine LTX and Plus Reagent | Life Technologies | A12621 | |
| Phenol, saturated pH 6.6/6.9 | Fisher Scientific | BP 17501-100 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer | ThermoScientific | ||
| MeltDoctor Master Mix | Life Technologies | 4415440 | |
| High Resolution Melt (HRM) Software v2.0 | Life Technologies | 4397808 | |
| AB SDS software v2.3 | Life Technologies | online | |
| AB High Resolution Melting Getting Started Guide | Life Technologies | online | |
| AB 7900HT Fast Real-Time System | Life Technologies |
References
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16 (1), 6-21 (2002).
- Deaton, A. M., Bird, A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25, 1010-1022 (2011).
- Lorincz, M. C., Dickerson, D. R., Schmitt, M. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells. Nat Struct. Mol Biol. 11 (11), 1068-1075 (2004).
- Moore, L. D., Le, T. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacol. 38, 23-38 (2013).
- Santos, K. F., Mazzola, T. N. The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Braz.J.Med.Biol.Res. 38 (10), 1531-1541 (2005).
- Day, J. J., Sweatt, J. D. Cognitive neuroepigenetics: a role for epigenetic mechanisms in learning and memory. Neurobiol. Learn.Mem. 96, 2-12 (2011).
- Denk, F., McMahon, S. B. Chronic pain: emerging evidence for the involvement of epigenetics. Neuron. 73, 435-444 (2012).
- Endres, M., et al. DNA methyltransferase contributes to delayed ischemic brain injury. J. Neuroscience. 20 (9), 3175-3181 (2000).
- Qureshi, I. A., Mehler, M. F. Emerging role of epigenetics in stroke: part 1: DNA methylation and chromatin modifications. Arch.Neurol. 67, 1316-1322 (2010).
- Tian, R., et al. disease mutant glial fibrillary acidic protein compromises glutamate transport in astrocytes. J Neuropathol. Exp Neurol. 69, 335-345 (2010).
- Perisic, T., Holsboer, F., Rein, T. The CpG island shore of the GLT-1 gene acts as a methylation-sensitive enhancer. Glia. 60 (9), 1345-1355 (2012).
- Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
- Poopalasundaram, S., et al. Glial heterogeneity in expression of the inwardly rectifying K+ channel, Kir4.1, in adult rat CNS. Glia. 30, 362-372 (2000).
- Hibino, H., Fujita, A., Iwai, K., Yamada, M. Differential assembly of inwardly rectifying K+ channel subunits. Kir4.1 and Kir5.1, in brain astrocytes. 279, 44065-44073 (2004).
- Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
- Li, L., Head, V. Identification of an inward rectifier potassium channel gene expressed in mouse cortical astrocytes. Glia. 33, 57-71 (2001).
- Kucheryavykh, Y. V., et al. Downregulation of Kir4.1 inward rectifying potassium channel subunits by RNAi impairs potassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes. Glia. 55 (3), 274-281 (2007).
- Djukic, B., Casper, K. B., Philpot, B. D., Chin, L. S. Conditional knock-out of Kir4.1 leads to glial membrane depolarization, inhibition of potassium and glutamate uptake, and enhanced short-term synaptic potentiation. J. Neuroscience. 27, 11354-11365 (2007).
- Fujita, A., et al. Clustering of Kir4.1 at specialized compartments of the lateral membrane in ependymal cells of rat brain. Cell Tissue Res. 359 (2), 627-634 (2015).
- MacFarlane, S. N., Sontheimer, H. Electrophysiological changes that accompany reactive gliosis in vitro. J Neuroscience. 17 (19), 7316-7329 (1997).
- Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R. Impaired K(+) homeostasis and altered electrophysiological properties of post-traumatic hippocampal glia. J. Neuroscience. 19 (18), 8152-8162 (1999).
- Anderova, M., et al. Voltage-dependent potassium currents in hypertrophied rat astrocytes after a cortical stab wound. Glia. 48 (4), 311-326 (2004).
- Olsen, M. L., Campbell, S. C., McFerrin, M. B., Floyd, C. L. Spinal cord injury causes a wide-spread, persistent loss of Kir4.1 and glutamate transporter 1: benefit of 17 beta-oestradiol treatment. Brain. 133, 1013-1025 (2010).
- Koller, H., Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Time course of inwardly rectifying K(+) current reduction in glial cells surrounding ischemic brain lesions. Brain Res. 872, 1-2 (2000).
- Bordey, A., Lyons, S. A., Hablitz, J. J. Electrophysiological characteristics of reactive astrocytes in experimental cortical dysplasia. J Neurophysiol. 85 (4), 1719-1731 (2001).
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P. plating, and maintenance of cortical astrocyte cultures. 8, Cold Spring. 10-1101 (2009).
- Itakura, E., et al. Generation of transgenic rats expressing green fluorescent protein in S-100beta-producing pituitary folliculo-stellate cells and brain astrocytes. Endocrinology. 148, 1518-1523 (2007).
- Foo, L. C. Purification of astrocytes from transgenic rodents by fluorescence-activated cell sorting. Cold Spring Harb.Protoc. 2013, 551-560 (2013).
- Smith, C., Otto, P., Bitner, R. A silica membrane-based method for the isolation of genomic DNA from tissues and cultured cells. CSH. Protoc. 2006, 2006-201 (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. A Single-step Method for the Simultaneous Preparation. of DNA, RNA, and Protein from Cells and. 1, 2006-201 (2006).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K. Quantitation of DNA and. , (2007).
- Zhao, Z., Han, L. CpG islands: algorithms and applications in methylation studies. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 643-645 (2009).
- Srivastava, G. P., Guo, J., Shi, H. PRIMEGENS-v2: genome-wide primer design for analyzing DNA methylation patterns of CpG islands. Bioinformatics. 24, 1837-1842 (2008).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J.Vis.Exp.(56), doi:3170 [pii];10.3791/3170. , (2011).
- Drummond, G. B., Vowler, S. L. Categorized or continuous? Strength of an association-and linear regression. Adv.Physiol Educ. 36, 89-92 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. The basic polymerase chain reaction. CSH.Protoc. 1, (2006).
- Arpa, P. Strategies for cloning PCR products. Cold Spring Harb.Protoc. 8, (2009).
- Makovets, S. Basic DNA electrophoresis in molecular cloning: a comprehensive guide for beginners. Methods Mol.Biol. 1054, 11-43 (2013).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neuroscience. 28, 264-278 (2008).
- Maldonado, P. P., Velez-Fort, M., Levavasseur, F. Oligodendrocyte precursor cells are accurate sensors of local K+ in mature gray matter. J Neuroscience. 33, 2432-2442 (2013).
- Kalsi, A. S., Greenwood, K., Wilkin, G. Kir4.1 expression by astrocytes and oligodendrocytes in CNS white matter: a developmental study in the rat optic nerve. J.Anat. 204, 475-485 (2004).
- Higashi, K., et al. An inwardly rectifying K(+) channel, Kir4.1, expressed in astrocytes surrounds synapses and blood vessels in brain. Am.J.Physiol Cell Physiol. 281 (3), (2001).
- Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
- Neusch, C., Rozengurt, N., Jacobs, R. E., Lester, H. A. Kir4.1 Potassium Channel Subunit Is Crucial for Oligodendrocyte Development and In Vivo Myelination. J. Neuroscience. 21 (15), 5429-5438 (2001).
- Kofuji, P., et al. Genetic Inactivation of an Inwardly Rectifying Potassium Channel (Kir4.1 Subunit) in Mice: Phenotypic Impact in Retina. J. Neuroscience. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Kofuji, P., Connors, N. C. Molecular substrates of potassium spatial buffering in glial cells. Mol.Neurobiol. 28, 195-208 (2003).
- Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
- Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high-resolution melting. Nat.Protoc. 3, 1903-1908 (2008).
- Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res. 35, 10-1093 (2007).
- Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nat.Rev.Genet. 11, 191-203 (2010).
