Protocol
Alla djur hanterades i enlighet med National Institutes of Health riktlinjer. Animal Care och användning kommittén vid University of Alabama i Birmingham godkända djur.
1. Skaffa RNA och DNA från en Enriched astrocytiska befolkningen som använder fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) astrocyter från hela hjärnvävnad
- Stillsam djur med CO2 under 1 min och sedan snabbt decapitate. Dissekera cortex som beskrivs i Albuquerque et al, 26. Det är inte nödvändigt att ta bort hjärnhinnorna.
Obs: Transgena råttor som uttrycker EGFP under S100β (en astrocyternas markör) promotorn genererades av Itakura et al 27 och utnyttjas för FACS sortering av astrocyter.. - Förbered hela hjämhomogenat med hjälp av en papain dissociation kit under icke-sterila förhållanden enligt tillverkarens protokoll. Värme aktivera papain vid 37 ° C i vattenbad i 10 minuter. Notera:Papainlösning tillhandahålls av tillverkaren och innehåller L-cystein och EDTA (se tabell of Materials).
- Skär eller Dremel ett hål i toppen av en 50 ml koniskt rör för att tillåta slangen bär 95% O 2: 5% CO 2 för att matas in i en sluten koniskt rör (Figur 1A). Placera dissekerade cortex i 10mm odlingsskål innehållande dissociation medium (MEM kompletterat med 20 mM glukos och penicillin / streptomycin (500 U / ml) och ekvilibrerades till 95% O 2: 5% CO2) och använda en ren rakblad för att mala vävnaden in i ett x 1 mm 2 st.
- Överföring vävnad med hjälp av 10 ml manuell pipetman till 50 ml koniska rör innehållande papain lösning. Tillåt vävnads sedimentera till botten av överföringspipett innan uttömning för att minimera mängden av dissociation medium som överförts. Håll papainlösning jämviktad till 95% O 2: 5% CO 2 via yta gasutbyte för varaktigheten av inkubationen. Inte bubbla papain solutividare. Inkubera vävnaden under 20 minuter i 37 ° C vattenbad.
- Efter inkubation i papain lösning, triturera vävnad 10 gånger med 10 ml överföringspipett med låg hastighet. Centrifugera grumlig cellsuspension vid 1000 xg under 5 min vid RT.
- Jämvikt inhibitorlösning DNas / albumin (tillhandahålls av tillverkaren) via ytan gasutbyte och återsuspendera pellet celler i 3 ml DNas / albumin inhibitorlösning. Förbered kommersiell diskontinuerliga densitetsgradient enligt tillverkarens instruktioner.
- Spin diskontinuerlig densitetsgradient vid 1000 xg under 6 min. Isolera dissocierade celler från botten av röret genom att suga botten pellets med hjälp av en pipett.
- Återsuspendera dissocierade celler i 2-3 ml DPBS med 0,02% bovint serumalbumin och 1 mg / ml DNas eller föredragna HEPES-buffrad odlingsmedier. Passera genom 40 um filter innan FACS (Figur 2A). Håll cellerna på is tills sortering.
- Utför FACS 28. </ li>
- Pellets celler i 1,5 ml centrifugrör vid 2000 xg under 5 min vid 4 ° C.
Obs: pellete astrocyter kan utnyttjas omedelbart eller förvaras i -80 ° C fram till DNA-extrahering.
- Utdrag RNA och DNA med användning av föredragna isoleringsmetoden 29 30. Utvärdera RNA och DNA-koncentration och kvalitet via spektrofotometer och Bioanalyzer 31.
Obs: Utnyttja hög kvalitet RNA och DNA i efterföljande steg, 260/280 = 2,0-2,2 och 1,8-1,9 respektive. Bioanalyzer analys är nödvändig för att bedöma för RNA-nedbrytning eller DNA-fragmentering. RNA eller DNA kan användas omedelbart eller förvaras i -80 ° C eller -20 ° C, respektive för efterföljande studier.
2. Bedöma DNA-metylering status av en gen med hjälp av metylering känsliga högupplöst Melt Analys (MS-HRMA)
- Ange gensekvens av intresse i föredrog online-metylering kartprogram för att identifiera eventuella CpG-öar i genenav intresse 32.
- Design primers mot bisulfit konverterade DNA-sekvens 33 och förstärker med hjälp av föredragna DNA-polymeras enligt tillverkarens protokoll. Verifiera amplifierad produkt storlek genom att köra en 1% agaros-DNA gel vid 100 V under 45 minuter. Förvara primrar vid stamkoncentration av 20 ^ M i -20 ° C.
- Bisulfite konvertera 500-1000 ng DNA från varje prov och denaturerad DNA-standarder som sträcker sig från 0-100% från samma djurart 34. Eluera prover för att ge en koncentration av 20 ng / ul. Verifiera koncentration av bisulfit konverterade DNA via spektrofotometer 31.
- Start 20 | il reaktioner för MS-HRM amplifiering med användning föredragna DNA-polymeras och primrar vid 5 pM koncentration enligt tabell 1 och 2. Kör alla prover, inklusive FACS DNA- och metylerade standarder i triplikat.
- Beroende på analysmjukvara, ange före och efter start- och stopp parametrarrunt övergångar i smältkurvan. Uppsättning pre-smälta start och pre-smältstoppparametrar så skillnaden mellan de två är 0,2-0,5 ° C. Ställ efter smält start och efter smälta sluta på samma sätt. Utdrag topptemperaturdifferensen data för varje prov.
- Använda procent metylerade standarder (y-värde) och deras motsvarande genomsnittliga topptemperaturskillnader (x-värde) generera en linjär regressionsekvation (Figur 3A-B, tabell 3-4). Använd denna linjära regressionsekvationen att uppskatta metylering status okända prover 35.
3. Bedöma Hyper-metylerade promotoraktivitet via användning av luciferas Assay
- Identifiera CpG-öar av målgen (steg 2,1). PCR förstärka områden av intresse 36 och klon uppströms luc2 Firefly luciferasreportergenen att producera CpG-ö-luc2 plasmider 37.
- Linjärisera 30 ng av CpG-ö-luc2 plasmid via begränsningenzymdigerering 38. Kontrollera ställen för restriktionsklyvning och undvika dubbel nedskärningar som använder föredragen fräs programvara 38. Värme inaktivera enzymer vid lämplig temperatur och varaktighet efter smältning enligt tillverkarens protokoll. Minimal förlust av DNA sker under linjärisering steget.
- Metylera linjäriserade plasmider med hjälp av CpG metylas (M.Sssl) O / N vid 30 ° C eller lämnar obehandlad följande tillverkare protokoll med undantag för följande justeringar.
- Utför 50 ^ reaktioner.
- Använd 5 enheter CpG metylas att metylera 700 ng lineariserad plasmid.
- Kör reaktioner O / N för 13-19 timmar.
- Efter CpG metylas reaktion utför DNA rensning med standard, kommersiellt tillgänglig kiseldioxid-gelmembran städa upp kit enligt tillverkarens protokoll. Betydande förluster av DNA inträffar efter CpG metylas reaktion, 30-60% förlust.
- Verifiera metylering av plasmider via en Hpall-restriktionsdigerering. Ta 1 ^ g metylerat eller icke metylerat DNA och restriktionsnedbrytning med Hpall för en timme vid 37 ° C. Använd 5-10 enheter Hpall för varje mikrogram DNA. Efter Hpall matsmältningen, utför DNA rensning med hjälp av föredragen, kommersiellt tillgänglig kiseldioxid-gelmembran städa upp kit. Köra båda CpG metylerade och icke-metylerade plasmider på en 1% agaros-DNA-gel i TAE eller TBE-buffert vid 100 V under 45 min för visualisering (Figur 4B).
- Subject både metylerade och icke-metylerade plasmider till dubbel digerering med lämpliga restriktionsenzymer för att frisätta fullängd luc 2 (vektor) och CpG-ö (insats) fragment 38. Utför dubbeluppslutning O / N vid lämplig temperatur och värme inaktivt enzymer efter digerering enligt tillverkarens protokoll. Minimal förlust av DNA-koncentration inträffar under dubbel restriktionsdigerering.
- Kör dubbla spjälkade plasmider på 1% DNA-agarosgel vid 100 V under 1 h för att medge separering of vektor och sätt (Figur 4C). Försiktighet. Bära skyddande UV ansiktsskydd, placera DNA gel på en bordsskiva svart ljus för att visualisera band. Baserat på storlek, punkt metylerade och icke-metylerade insatsen och icke-metylerade vektorn med användning av en ren kirurgiskt blad.
- Gel extrakt DNA med användning av mättad fenol, pH 6,6. I korthet, väger DNA gel innehållande vektor eller insert. Använd 100 il fenol per 0,1 gram DNA gel. Homogenisera DNA gel i fenol använda glas Dounce homogenisator.
- Lägg kloroform (med 1/5 av fenol volym) och skaka prover för 20 sek. Inkubera proverna vid rumstemperatur under 2-3 minuter. Centrifugera i 15 minuter vid max hastighet (16,1 x 1000 xg) vid 4 ° C.
- Avlägsna vattenlösning och tillsätt 0,1 X volym av 3 M natriumacetat och 2,5 X volym etanol. Inkubera prover för 1 h vid -80 ° C. Efter inkubering avlägsna etanol och återsuspendera DNA i 30 pl föredragen buffert. Betydande förlust av DNA sker följande isolering av insatser och vektorer, 30-50% loss.
- Åter Ligera metylerade och icke-metylerade skär till ometylerad vektor med användning av T4 DNA-ligas 38. Använd en 1: 4-förhållande av vektor för att infoga för ligeringsreaktioner. Inställnings reaktion enligt tillverkarens instruktioner. Använd en total volym av 50 pl för reaktioner och inkubera O / N vid -20 ° C eller på is med lock över ishink.
- Efter ligering utför DNA rensning med hjälp av föredragen, kommersiellt tillgänglig kiseldioxid-gelmembran städa upp kit. Betydande förlust av DNA inträffar efter ligeringsreaktion, en ungefärlig 30-50% förlust av DNA. Kontrollera återligation genom att köra på 1% -ig DNA gel vid 100 V under 45 minuter och bedöma koncentrationen av återligerades plasmider (Figur 4D).
- Transfektera metylerade eller icke-metylerade plasmider i D54-celler med användning av en kommersiell transfektionsreagens enligt tillverkarens protokoll. Seed D54 celler på 12-brunnar på en 0,14 x 10 6 celler / brunn.
- Efter 24 timmar, transfektera celler with lika koncentrationer av antingen (1) icke-methyated CpG-luc2 plasmid + Renilla eller annan luciferas kontrollvektor eller (2) metylerade CpG-luc2 plasmid + Renilla eller annan luciferas kontrollvektor.
- Låt cellerna att transfektera under 24 timmar innan du utför dubbla luciferasanalys. Utför analys enligt tillverkarens instruktioner. Gör avläsningar med hjälp av en luminometer. Läs varje brunn i triplikat.
- Beräkna förhållandet mellan Firefly luciferasaktiviteten att Renilla eller annan luciferas kontrollaktivitet. Normalisera denaturerad Firefly: kontroll luciferasaktiviteten till ometylerad Firefly: kontroll luciferasaktivitet genom att dividera denaturerad luciferasaktivitet av icke-metylerade luciferasaktivitet
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En berikad population av astrocyter förvärvades via FACS sortering av EGFP-S100β transgena djur 27. På grund av minskande kvalitet celler och molekylära molekyler isolerade från djur äldre än postnatal dag 50 (p50), djur som är äldre p0-p40 är optimala för sådana experiment. Kortikal vävnad användes för dessa experiment. Cortex från två till sex djur slogs samman. FACS utfördes vid UAB Omfattande flödescytometri Kärn anläggning. Sortering utfördes på Becton Dickinson FACSAria II. EGFP excitation erhölls med användning av 488 nm laser; ingen ersättning var nödvändigt. En gated befolkningen riktades baserat på framåt och sidospridning (figur 1B). En cell levande population bestämdes med användning av en ethidium indikator bromid död cell och gated (Figur 1C). Två olika populationer observerades baserat på EGFP profilen (figur 1D). Genom empiriska tester, cellpopulationen med högre EGFPprofil identifierades som den EGFP-positiva cellpopulationen (figur 1F-F ''). Visuell analys av den andra populationen med en lägre EGFP profil avslöjade cellfragment som uttrycker EGFP, men saknar kärnor, troligen representerande skräp från astrocytiska processer (figur 1G-G ''). Representativa bilder av dissocierade EGFP positiva astrocyter efter dissociation men före sortering (Figur 2A) och efter sortering (Figur 2B) visas. Isolerade EGFP positiv cellpopulation visade en 40-faldig ökning av ALDH1L1 mRNA en astrocytiska specifik markör 39 (figur 2C). Dessutom, trots delade uttryck av S100β i NG2 + OPCs och astrocyter 39, observerade vi en 4-faldig minskning av NG2 mRNA, en markör för oligodendrocyt prekursorceller 39, vilket indikerar isolering av en berikad astrocytisk cellpopulation (Figur 2C-D). RNAoch DNA isolerat från FACS sorteras astrocyter var av tillräcklig kvalitet och kvantitet som ska användas för efterföljande metylering studier. Total RNA och DNA som isolerats från olika åldrar och antal djur är listad som en referens för förväntad avkastning av molekylära molekyler efter FACS (tabell 5). Det bör noteras att utbytet också kommer att variera beroende på antalet djur som används, inkubationstiden, och erfarenhet av forskare. Tabell 6 visar variationen av händelser förvärvade beroende på antal djur som används och inkuberingsperioder.
För metylering studier, med början med hög kvalitet och tillräckliga mängder av DNA är en förutsättning för framgångsrika tillämpningar nedströms. För att säkerställa tillräcklig lys av vävnad för RNA eller DNA-extraktion, var alla homogenisering av vävnader eller celler följt av finfördelning med hjälp av en 23G nål 7x, var noga med att undvika skumning under lys. När hög kvalitet DNA extraheras och bisulfit konverteraed, regioner av intresse kan riktas för MS-HRMA. Observera att vid bedömningen av kvalitet och koncentration av bisulfit konverterade DNA, bör spektrofotometer ställas in för att läsa på en OD faktor på 33 som bisulfit konverterade DNA är enkelsträngad. De 260/280 värdena för bisulfit konverterade DNA varierade från 2,20 till 2,70.
Innan du börjar metylering studier, är det viktigt att på lämpligt sätt välja och kalibrera en termocykler för MS-HRMA studier. Dessutom måste man bestämma hur du exporterar och använder rådata som genererats från MS-HRMA. Applied Biosystems högupplöst Smält Komma igång användes för att hjälpa till att kalibrera 7900HT termocyklern. Slutligen uppgifter utvinns och importeras till HRM analysprogram för efterföljande dataanalys. Som framgår av protokollet, före och efter start och stopp parametrar ligger nära övergångar i smältkurvan. Peak temperaturskillnader användes för att extrapolera metylering status okänd samples. Nära Uppskattade metylering data som samlats in från MS-HRMA motsvarade metylering data som genereras från Pyrosequencing (Pyrosequencings data genereras i huset med hjälp av primers som riktar samma regioner som MS-HRM primers) (Figur 3C) 15.
En dubbel luciferasanalys användes för att bedöma den transkriptionella aktiviteten av hyper-metylerade regioner av genen av intresse (Figur 4A). Varje CpG-ö-luc2 plasmid var arise och sedan metyleras. Men eftersom både insatsen (CpG-ö) och vektor (luc2) metyleras under reaktionen, måste en excidera den metylerade insatsen och åter ligera till en icke-metylerad vektor. På grund av omfattande manipulation av plasmiden, stora förluster förekommer och en måste börja med tillräckligt utgångsmaterial. Hpall digestion användes för att verifiera metylering status för varje plasmid som Hpall smälter bara ometylerad DNA (Figur 4B). Det bör noteras attOm O / N-metylering är otillräcklig, kan en ytterligare 1x SAM och 1x i CpG metylas sättas efter 1 h inkubation vid 30 ° C. Fortsätt O / N inkubation efter tillsats av extra SAM och CpG metylas. Generation av denaturerad och icke-metylerade CpG-ö-luc2 plasmid möjliggör direkt bedömning av förändringar mellan DNA-metylering och transkriptionsaktivitet via mätning av luciferasaktivitet.
Figur 1. FACS sortering isolerar EGFP + cell antalet judar. (A) Användning av en 50 ml koniska rör med utskurna hålet på toppen medger ytan gasutbyte under papaindigestion. (B) Sorterade celler gated baserat på framåt och sidospridningsdiagram. (C) en etidiumbromid baserad döda indikatorcell användes för att grind en levande cellpopulation (röd). (D) Live cell befolkningen visade två populationer - en med en hög EGFP profil (grön) och en låg EGFP profil (lila). För alla grafer, representerar y-axeln sidospridning område (SSC-A); X-axeln representerar framåt sidospridning område (FSC-A), grönt fluorescerande protein område (GFP-A), eller etidiumbromid (EtBr). (EG) Dissocierade celler inkuberades med Hoechst och 20 pl av dissocierade celler placerades på täck och avbildas. (EE '') EGFP + astrocyter, med omfattande processer synliggjordes före sortering (NS). (FF '') Efter sortering, hög eGFP + befolkning (POS) visar EGFP + cell soma som samar lokalisera med Hoechst färgning. (GG '') Låg EGFP befolkningen visar EGFP + färgning som inte samar lokalisera med Hoechst färgning, troligen representerar astrocytisk skräp (för alla bilder, skala = 20 pm). VänligenKlicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. FACS sortering av EGFP-S100 p transgena djur ger anrikad population av astrocyter. (A) 20 pl dissocierade celler före FACS (NS) visas, processer förbli intakt (skala = 50 pm). (B) Representativa bild efter FACS (FACS) celler visas; astrocytiska processer avlägsnas och cell soma återstår (skala = 20 pm). (C) qPCR data visar en 40-faldig ökning av ALDH1L1 mRNA i FACS-sorterade celler (FACS) jämfört med ej sorterade populationen (NS). (D) NG2 mRNA minskade med 4 gånger i FACS sorterade celler jämfört med att inte sorterade populationen (NS). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Exempel på data och analyser för MS-HRM studier. (A) Exempel på temperaturskillnaden tomter genereras från metylering standarder. Motsvarande procent metylering är märkt för varje kurva (B) Exempel på linjära regressionsekvationen genereras från råtta denaturerad standarder. (C) Jämförelse av procent metylering förvärvats från Pyrosequencing (pyroseq, gröna staplar) och MS-HRMA (grå staplar) visar liknande nivåer av metylering för olika regioner av KCNJ10. Pyrosequencings data som genereras i huset med hjälp av primers som riktar samma regioner som MS-HRM analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Dual luciferasanalys möjliggör en bedömning av transkriptionsaktivitet av differentiellt metylerade genregioner. (A) Diagram av luciferas transkriptionsaktivitetsanalys visar arbetsflödet i protokollet. (B) DNA gel visar skillnader i denaturerad kontra icke-metylerade plasmider efter Hpall matsmältning. Icke-metylerade DNA lätt diger efter Hpall matsmältning jämfört med metylerat DNA, vilket visar framgångsrik metylering av DNA-plasmid. (C) DNA gel visar separation av vektor från insatsen efter dubbeluppslutning. Efter DNA-separation, vektor och insert är gel utvinns. (D) DNA gel visar framgångsrik re-ligering av vektor och insert. Återligerades plasmiden besitter liknande molekylvikt som obehandlad plasmid (untx). NM, icke-methylated; M, metanol; RL, återligerades; untx, obehandlade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| . | Volym (^ il) | x3 + 10% överskott | x # av prover |
| MeltDoc MM | 10 pl | 33 | il | |
| Primer 1 | 1,2 ^ il | 3.96 il | |
| Primer 2 | 1,2 ^ il | 3.96 il | |
| gDNA | 1 pl | --- | |
| dH 2 0 | 6,6 ^ il | 21,78 ^ il |
Tabell 1. Exempel på beräkning av MeltDoctor Mastermix. Kör varje MS-HRM reaInsatser i triplikat med 10% överskott för att kompensera för pipettering fel. Sista kolumnen visar beräkningar som behövs för flera nummer av prover. Total mängd för varje reaktion är 20 | il.
| Cykel | Temp (° C) | Tid (sek) | Ramphastighet (%) |
| 95 ° C | : 15 | 100 | |
| 40x | 95 ° C | : 15 | 100 |
| 60 ° C | : 60 | 100 | |
| Smältparametrar | 95 ° C | : 10 | 100 |
| 60 ° C | : 60 | 100 | |
| 95 ° C | : 15 | 1 | |
| 60 ° C | : 15 | 100 | |
| Håll | 4 76; C |
Tabell 2:. Prov protokoll för amplifiering Denaturera prover vid 95 ° C under 10 min följt av 40 cykler av amplifiering och generering av smältkurvan. Smält parametrar listas i tabellen. Notera förändringar i ramphastighet som möjliggör förvärv av högupplösta smälttemperatur.
| Procent Metylering (Råtta standard) | Topptemperatur Skillnad |
| y | X |
| 0 | 5.670116 |
| 5 | 10,70448 |
| 10 | 15,5044 |
| 25 | 25,52295 |
| 50 | 34,43047 |
| 75 | 43,80894 |
| 100 | 53,88717 |
| Topp temp Skillnad | Beräknad metylering |
| X | Y |
| Prov 1 (n = 4) | |
| 47,450 | 81,115 |
| 46,292 | 78,657 |
| 41,694 | 68,894 |
| 47,292 | 80,779 |
| Prov 2 (n = 4) | |
| 29,925 | 43,904 |
| 24,269 | 31,894 |
| 25,061 | 33,575 |
| 25,389 | 34,272 |
Tabell 4. Exempel på beräknad uppskattad procent metylering. Skillnad av prover av okänd metyleringsstatus Topptemperatur används för att uppskatta procent metylering med användning av en linjär regressionsekvation. Representativa data från två olika villkor, Sample 1 och Sample 2, är visade; n = 4 för varje tillstånd.
| Ålder | Antal djur | Totalt RNA (ng) | Totalt DNA (ng) |
| p4-p10 | 3-6 | 455-868 | 265-1523 |
| p19-p22 | 1-2 | 220-680 | 583-1483 |
| p40-p50 | 3-4 | 198-260 | 578-1700 |
Tabell 5. Total RNA och DNA förvärvats från FACS sorterade celler. Ålder och antal djur som används i FACS experiment listas. Observera, båda cortex används för varje N. Total RNA och DNA är listad som en referens för förväntad avkastning.
| Ålder | Antal djur | Pos Händelser | Neg Händelser | Inkubationstid (vid 37 ° C) |
| p26 | 1 | 2.18X10 ^ 6 | 1.15X10 ^ 6 | 20:00 min |
| p26 | 2 | 4.4X10 ^ 6 | 2.78X10 ^ 6 | 20:00 min |
| p26 | 2 | 9.2X10 ^ 6 | 3.3X10 ^ 6 | 30:00 min |
Tabell 6. Antal händelser som förvärvats från FACS på postnatal dag 26. Vid p26 antal positiva (EGFP +) händelser och negativa händelser varierar beroende på antalet djur som används och inkubationstiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| Methyl Primer | Applied Biosystems | online | software to localize CpG Islands |
| EZ DNA methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Rat Premixed Calibration Standard | EpiGenDx | 80-8060R-Premix | |
| CpG Methylase (M.Sssl) | Zymo Research | E2010 | |
| QIAquick Gel Extraction | QIagen | 28704 | Used for gel extraction and DNA cleanup |
| Restriction enzymes | New England BioLabs | ||
| NEB cutter | New England BioLabs | online | verify restriction digest sites |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Luc2 vector, pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| renilla vector, pGL4.74 | Promega | E2241 | |
| TD-20/20 Luminometer | Turner Designs | ||
| Lipofectamine LTX and Plus Reagent | Life Technologies | A12621 | |
| Phenol, saturated pH 6.6/6.9 | Fisher Scientific | BP 17501-100 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer | ThermoScientific | ||
| MeltDoctor Master Mix | Life Technologies | 4415440 | |
| High Resolution Melt (HRM) Software v2.0 | Life Technologies | 4397808 | |
| AB SDS software v2.3 | Life Technologies | online | |
| AB High Resolution Melting Getting Started Guide | Life Technologies | online | |
| AB 7900HT Fast Real-Time System | Life Technologies |
References
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16 (1), 6-21 (2002).
- Deaton, A. M., Bird, A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25, 1010-1022 (2011).
- Lorincz, M. C., Dickerson, D. R., Schmitt, M. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells. Nat Struct. Mol Biol. 11 (11), 1068-1075 (2004).
- Moore, L. D., Le, T. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacol. 38, 23-38 (2013).
- Santos, K. F., Mazzola, T. N. The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Braz.J.Med.Biol.Res. 38 (10), 1531-1541 (2005).
- Day, J. J., Sweatt, J. D. Cognitive neuroepigenetics: a role for epigenetic mechanisms in learning and memory. Neurobiol. Learn.Mem. 96, 2-12 (2011).
- Denk, F., McMahon, S. B. Chronic pain: emerging evidence for the involvement of epigenetics. Neuron. 73, 435-444 (2012).
- Endres, M., et al. DNA methyltransferase contributes to delayed ischemic brain injury. J. Neuroscience. 20 (9), 3175-3181 (2000).
- Qureshi, I. A., Mehler, M. F. Emerging role of epigenetics in stroke: part 1: DNA methylation and chromatin modifications. Arch.Neurol. 67, 1316-1322 (2010).
- Tian, R., et al. disease mutant glial fibrillary acidic protein compromises glutamate transport in astrocytes. J Neuropathol. Exp Neurol. 69, 335-345 (2010).
- Perisic, T., Holsboer, F., Rein, T. The CpG island shore of the GLT-1 gene acts as a methylation-sensitive enhancer. Glia. 60 (9), 1345-1355 (2012).
- Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
- Poopalasundaram, S., et al. Glial heterogeneity in expression of the inwardly rectifying K+ channel, Kir4.1, in adult rat CNS. Glia. 30, 362-372 (2000).
- Hibino, H., Fujita, A., Iwai, K., Yamada, M. Differential assembly of inwardly rectifying K+ channel subunits. Kir4.1 and Kir5.1, in brain astrocytes. 279, 44065-44073 (2004).
- Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
- Li, L., Head, V. Identification of an inward rectifier potassium channel gene expressed in mouse cortical astrocytes. Glia. 33, 57-71 (2001).
- Kucheryavykh, Y. V., et al. Downregulation of Kir4.1 inward rectifying potassium channel subunits by RNAi impairs potassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes. Glia. 55 (3), 274-281 (2007).
- Djukic, B., Casper, K. B., Philpot, B. D., Chin, L. S. Conditional knock-out of Kir4.1 leads to glial membrane depolarization, inhibition of potassium and glutamate uptake, and enhanced short-term synaptic potentiation. J. Neuroscience. 27, 11354-11365 (2007).
- Fujita, A., et al. Clustering of Kir4.1 at specialized compartments of the lateral membrane in ependymal cells of rat brain. Cell Tissue Res. 359 (2), 627-634 (2015).
- MacFarlane, S. N., Sontheimer, H. Electrophysiological changes that accompany reactive gliosis in vitro. J Neuroscience. 17 (19), 7316-7329 (1997).
- Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R. Impaired K(+) homeostasis and altered electrophysiological properties of post-traumatic hippocampal glia. J. Neuroscience. 19 (18), 8152-8162 (1999).
- Anderova, M., et al. Voltage-dependent potassium currents in hypertrophied rat astrocytes after a cortical stab wound. Glia. 48 (4), 311-326 (2004).
- Olsen, M. L., Campbell, S. C., McFerrin, M. B., Floyd, C. L. Spinal cord injury causes a wide-spread, persistent loss of Kir4.1 and glutamate transporter 1: benefit of 17 beta-oestradiol treatment. Brain. 133, 1013-1025 (2010).
- Koller, H., Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Time course of inwardly rectifying K(+) current reduction in glial cells surrounding ischemic brain lesions. Brain Res. 872, 1-2 (2000).
- Bordey, A., Lyons, S. A., Hablitz, J. J. Electrophysiological characteristics of reactive astrocytes in experimental cortical dysplasia. J Neurophysiol. 85 (4), 1719-1731 (2001).
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P. plating, and maintenance of cortical astrocyte cultures. 8, Cold Spring. 10-1101 (2009).
- Itakura, E., et al. Generation of transgenic rats expressing green fluorescent protein in S-100beta-producing pituitary folliculo-stellate cells and brain astrocytes. Endocrinology. 148, 1518-1523 (2007).
- Foo, L. C. Purification of astrocytes from transgenic rodents by fluorescence-activated cell sorting. Cold Spring Harb.Protoc. 2013, 551-560 (2013).
- Smith, C., Otto, P., Bitner, R. A silica membrane-based method for the isolation of genomic DNA from tissues and cultured cells. CSH. Protoc. 2006, 2006-201 (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. A Single-step Method for the Simultaneous Preparation. of DNA, RNA, and Protein from Cells and. 1, 2006-201 (2006).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K. Quantitation of DNA and. , (2007).
- Zhao, Z., Han, L. CpG islands: algorithms and applications in methylation studies. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 643-645 (2009).
- Srivastava, G. P., Guo, J., Shi, H. PRIMEGENS-v2: genome-wide primer design for analyzing DNA methylation patterns of CpG islands. Bioinformatics. 24, 1837-1842 (2008).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J.Vis.Exp.(56), doi:3170 [pii];10.3791/3170. , (2011).
- Drummond, G. B., Vowler, S. L. Categorized or continuous? Strength of an association-and linear regression. Adv.Physiol Educ. 36, 89-92 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. The basic polymerase chain reaction. CSH.Protoc. 1, (2006).
- Arpa, P. Strategies for cloning PCR products. Cold Spring Harb.Protoc. 8, (2009).
- Makovets, S. Basic DNA electrophoresis in molecular cloning: a comprehensive guide for beginners. Methods Mol.Biol. 1054, 11-43 (2013).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neuroscience. 28, 264-278 (2008).
- Maldonado, P. P., Velez-Fort, M., Levavasseur, F. Oligodendrocyte precursor cells are accurate sensors of local K+ in mature gray matter. J Neuroscience. 33, 2432-2442 (2013).
- Kalsi, A. S., Greenwood, K., Wilkin, G. Kir4.1 expression by astrocytes and oligodendrocytes in CNS white matter: a developmental study in the rat optic nerve. J.Anat. 204, 475-485 (2004).
- Higashi, K., et al. An inwardly rectifying K(+) channel, Kir4.1, expressed in astrocytes surrounds synapses and blood vessels in brain. Am.J.Physiol Cell Physiol. 281 (3), (2001).
- Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
- Neusch, C., Rozengurt, N., Jacobs, R. E., Lester, H. A. Kir4.1 Potassium Channel Subunit Is Crucial for Oligodendrocyte Development and In Vivo Myelination. J. Neuroscience. 21 (15), 5429-5438 (2001).
- Kofuji, P., et al. Genetic Inactivation of an Inwardly Rectifying Potassium Channel (Kir4.1 Subunit) in Mice: Phenotypic Impact in Retina. J. Neuroscience. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Kofuji, P., Connors, N. C. Molecular substrates of potassium spatial buffering in glial cells. Mol.Neurobiol. 28, 195-208 (2003).
- Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
- Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high-resolution melting. Nat.Protoc. 3, 1903-1908 (2008).
- Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res. 35, 10-1093 (2007).
- Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nat.Rev.Genet. 11, 191-203 (2010).
