Protocol
全ての動物は、国立衛生研究所のガイドラインに従って処理されました。アラバマ大学バーミンガム校で動物実験委員会は、動物の使用を承認しました。
1.全脳組織からのアストロサイトの選別（FACS）、蛍光活性化細胞を使用してエンリッチドアストロサイトの集団からRNAとDNAの取得
- 落ち着いた1分間のCO 2で、動物、その後急速に首を切ります。 アルバカーキらに記載されているように、皮質を解剖26。それは、髄膜を除去する必要はありません。
注意：S100β（アストロサイトマーカー）プロモーター下のeGFPを発現するトランスジェニックラットは27板倉らによって生成され、アストロサイトのFACSソーティングのために利用しました。 - 製造業者のプロトコルに従って、非無菌条件下でパパイン解離キットを用いて全脳ホモジネートを準備します。 10分間、水浴中で37℃でパパインを熱活性化します。注意：パパイン溶液は、製造業者によって提供され、L-システインおよびEDTA（材料の表を参照）が含まれています。
- 閉じたコニカルチューブ（ 図1A）内に供給される5％のCO 2：95％のO 2を運ぶチューブを可能にするために50 mlのコニカルチューブの頂部に穴を開け、またはドレメル。解離培地を含む10ミリメートル培養皿に解剖皮質を置き（MEMは、20mMのグルコースおよびペニシリン/ストレプトマイシン（500 U / ml）を補充し、95％O 2で平衡化：5％のCO 2）で1に組織をミンチする清潔なカミソリの刃を使用しX 1ミリメートル2枚。
- パパイン溶液を含有する50 mlのコニカルチューブに10 mlの手動ピペットマンを用いて転送組織。組織が引き継が解離媒体の量を最小限にするために排出する前に、転送ピペットの底に沈殿することを許可します。インキュベーションの間、表面ガス交換を経て、5％のCO 2：95％O 2に平衡化パパインソリューションをしてください。バブルパパインsolutiにしないでください上。 37℃の水浴中で20分間組織をインキュベートします。
- パパイン溶液中でのインキュベーション後、磨砕組織低速で10ミリリットルの転送ピペットで10回。 RTで5分間1,000×gで遠心濁った細胞懸濁液。
- 表面ガス交換を介して、（製造者によって提供される）、DNアーゼ/アルブミン阻害剤溶液を平衡化し、DNアーゼ/アルブミン阻害剤溶液3mlに細胞ペレットを再懸濁します。メーカーの指示に従って、商業不連続密度勾配を準備します。
- 6分、1000×gで不連続密度勾配をスピン。ピペットを用いたボトムペレットを吸引してチューブの底から解離した細胞を分離します。
- 0.02％のウシ血清アルブミンおよび1mg / mlのDNアーゼまたは培地HEPES緩衝好適にDPBSの2-3 ml中に解離した細胞を再懸濁します。 FACS（ 図2A）の前に40μmのフィルターを通過。ソートするまで氷上で細胞を保管してください。
- FACS 28を実行します 。</ LI>
- 4℃で5分間、2,000×gで1.5 mlの遠心管中で細胞をペレット化。
注：ペレット化した星状細胞は、直ちに利用またはDNA抽出まで-80℃で維持することができます。
- 好適な分離法29 30を使用して、RNAおよびDNAを抽出します。分光光度計とバイオアナライザ31を介して RNAとDNAの濃度と品質を評価します。
注意：以降の唯一の高品質のRNAとDNAを利用し、それぞれ280分の260 = 2.0〜2.2と1.8から1.9に、。バイオアナライザー分析は、RNAの分解またはDNA断片化のために評価することが不可欠です。 RNAまたはDNAは、それぞれ、その後の研究のため、すぐに利用または-80℃で保存するか、または-20℃できます。
2.メチル化感受性高分解能融解分析（MS-HRMA）を用いた遺伝子のDNAメチル化状態を評価します
- 遺伝子の任意のCpGアイランドを同定するために好適なオンラインメチルマッピングソフトウェアへの目的の遺伝子配列を入力します興味32の。
- 亜硫酸水素塩に対する設計プライマーは、DNA配列33に変換し、製造業者のプロトコルに従って、好ましいDNAポリメラーゼを用いて増幅します。 45分間、100Vで1％アガロースDNAゲルを実行することにより、増幅産物のサイズを確認します。 -20℃で20μMのストック濃度で保存するプライマー。
- 亜硫酸水素塩は、同じ動物種34から0〜100％の範囲で、各サンプルおよびメチル化DNA標準のDNAの500〜1,000 ngのを変換します。溶出サンプルは、20 ngの/μlの濃度を提供します。分光光度計31を介して重亜硫酸変換したDNAの濃度を確認してください。
- 表1および2に記載の 5μMの濃度で好ましいDNAポリメラーゼおよびプライマーを使用して、MS-HRM増幅のためのセットアップ20μlの反応は。三重で、FACSのDNAメチル化規格を含むすべてのサンプルを実行します。
- 解析ソフトウェアによっては、事前設定したパラメータを開始および停止後融解曲線の遷移の周り。 0.5℃ - 両者の差が0.2であるので、事前に溶融開始とプリメルト停止パラメータを設定します。ポスト溶融開始を設定し、同様に停止後の溶融。各サンプルのピーク温度差データを抽出します。
- ％のメチル化標準（y値）とそれに対応する平均ピーク温度差（x値）を使用すると、線形回帰方程式（ 図3A-B、表3-4）を生成します 。未知試料35のメチル化状態を推定するために、この線形回帰式を使用してください。
3.ルシフェラーゼアッセイの使用を介してハイパーメチル化プロモーター活性を評価します
- 標的遺伝子（ステップ2.1）のCpGアイランドを識別します。 PCRは、CpGアイランド-luc2プラスミド37を生成するために luc2ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に興味36クローンの領域を増幅します。
- 制限経由のCpGアイランドluc2プラスミド30μgのを線形酵素消化38。制限消化のための部位を確認し、好ましいカッターソフトウェア 38 を使用して二重のカットを避けます。製造業者のプロトコルに従って消化後に、適切な温度および時間で加熱不活性化する酵素。 DNAの最小限の損失が線形化工程の間に発生します。
- 30℃でのCpGメチラーゼ（M.Sssl）O / Nを使用するか、次の調整を除き、未処理の次のメーカーのプロトコルを残すメチル化線状化したプラスミド。
- 50μlの反応を行います。
- 線状プラスミドの700 ngのをメチル化するのCpGメチラーゼの5単位を使用してください。
- 13-19時間の反応O / Nを実行します。
- CpGメチラーゼ反応に続いて、標準を用いてDNAのクリーンアップを実行し、市販のシリカゲル膜製造業者のプロトコルに従ってキットをクリーンアップします。 DNAの大幅な損失が30〜60％の損失を以下のCpGメチラーゼ反応を生じます。
- Hpa II制限消化を介しプラスミドのメチル化を確認してください。 メチル化または非メチル化DNAの1μgのを取り、制限が37℃で1時間のHpa IIで消化。各μgのDNAのためのHpa IIの5〜10単位を使用してください。 Hpa II消化後、好適な、市販のシリカゲル膜クリーンアップキットを用いてDNAのクリーンアップを実行します。可視化のために45分（ 図4B）を100 VでTAEまたはTBE緩衝液中、1％アガロースゲル上でのDNAのCpGメチル化および非メチル化プラスミドの両方を実行します。
- 適切な制限酵素で二重消化の対象と両方メチル化および非メチル化プラスミドは、全長LUC 2（ベクトル）とCpGアイランド（挿入）38を断片化を解除します。製造業者のプロトコルに従って消化後に、適切な温度と熱不活性化する酵素で二重消化O / Nを実行します。 DNA濃度の最小の損失は、二重制限消化中に発生します。
- O分離を可能にするために1時間、100Vで1％のDNAのアガロースゲル上の二重消化したプラスミドを実行します。Fベクターと挿入した （図4C）。注意。保護のUVフェイスシールドを着用、バンドを可視化するために卓上ブラックライトにDNAゲルを配置します。きれいな外科用メスを用いたサイズに基づいて、消費税メチル化および非メチル化インサートと非メチル化ベクトル。
- 飽和フェノール、pHが6.6を使用してゲル抽出DNA。簡単に述べると、ベクターまたはインサートを含有するDNAゲルの重量を量ります。 DNAゲルの0.1グラムあたりフェノール100μlのを使用してください。ガラスダウンスホモジナイザーを用いてフェノールにDNAゲルをホモジナイズします。
- （フェノール量の1/5を使用して）、クロロホルムを加え、20秒間のサンプルを横に振ります。 2-3分間、室温でサンプルをインキュベートします。 4℃での最大速度（16.1 X千XG）で15分間遠心。
- 水溶液を削除し、3 M酢酸ナトリウムとエタノールの2.5倍の量の0.1Xボリュームを追加。 -80℃で1時間サンプルをインキュベートします。インキュベーション後、エタノールを除去し、好適な緩衝液30μlにDNAを再懸濁。 DNAの大幅な損失を挿入し、ベクトルの次の分離を発生し、30〜50％のLOssです。
- T4 DNAリガーゼ38を用いて、非メチル化ベクターを再ライゲーションメチル化及び非メチル化インサート。ライゲーション反応に挿入するためのベクターの4：1の比を使用してください。メーカーの指示に従ってセットアップ反応。反応のための50μlの総容量を使用してC°またはアイスバケットの上に蓋を氷上で-20℃でO / Nインキュベートします。
- 連結後、好適な、市販のシリカゲル膜クリーンアップキットを用いてDNAのクリーンアップを実行します。 DNAの有意な損失は、次のライゲーション反応、DNAのおよそ30-50％の損失を生じます。 45分間、100Vで1％アガロースゲル上でのDNA実行することにより、再連結を確認し、再連結したプラスミド（ 図4D）の濃度を評価します。
- 製造業者のプロトコルに従って商業トランスフェクション試薬を用いて、D54細胞にメチル化または非メチル化プラスミドをトランスフェクトします。よく0.14×10 6細胞 /で12ウェルプレート上にシードD54細胞。
- 24時間後、トランスフェクト細胞のwi（1）非methyatedのCpG-luc2プラスミド+ウミシイタケまたは他の制御ルシフェラーゼベクターまたは（2）メチル化CpG-luc2プラスミド+ウミシイタケまたは他の制御ルシフェラーゼベクターのいずれかの目等しい濃度。
- 細胞は、デュアルルシフェラーゼアッセイを行う前に24時間トランスフェクトすることを許可します。製造者の指示に従ってアッセイを行います。ルミノメーターを用いて測定値を実行します。三連で各ウェルをお読みください。
- ウミシイタケまたは他の制御ルシフェラーゼ活性に対してホタルルシフェラーゼ活性の比率を計算します。非メチルホタルに制御ルシフェラーゼ活性：メチル化されたホタルを正規化対照ルシフェラーゼ活性を、非メチル化ルシフェラーゼ活性によってメチル化ルシフェラーゼ活性を分割して
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Representative Results
アストロサイトの濃縮集団は、eGFPの-S100βトランスジェニック動物27のFACSソーティングを介して取得しました。生後50日目（P50）より古い動物から単離された細胞や分子の分子の品質を低下させるには、P0〜P40老化した動物は、そのような実験のために最適です。皮質組織は、これらの実験に使用しました。 2〜6匹の動物からの皮質を一緒にプールしました。 FACSは、UAB包括的フローサイトメトリーコア施設で行いました。ソートは、ベクトン・ディッキンソンFACSARIA IIで実施しました。 eGFPの励起は488nmのレーザーを用いて得ました。補償は必要ではなかったです。ゲートされた人口は、前方および側方散乱（ 図1B）に基づいて目標としました。生細胞の集団は、臭化エチジウム死細胞の指標とゲーティング（ 図1C）を用いて決定しました 。二つの異なる集団は、eGFPのプロファイル（ 図1D）に基づいて観察されました。経験的テスト、高いEGFPで細胞集団を通じプロファイルは、EGFP陽性細胞集団（ 図1F-F ''）と同定されました。下のeGFPプロファイルを有する第二集団の視覚分析は、おそらくアストロサイトのプロセス（ 図1G-G ''）から破片を表すのeGFPを発現する細胞の断片を明らかにしたが、核を欠いています。解離が、前（ 図2A）をソートすると（ 図2B）をソートした後に、次の解離のeGFP陽性のアストロサイトの代表的な画像が表示されます。単離されたeGFP陽性細胞集団はALDH1L1 mRNAを、星状細胞特異的マーカー39（ 図2C）の40倍の増加を示しました。さらに、NG2 +のOPCおよびアストロサイト39S100βの共有の発現にもかかわらず、我々は、濃縮された星状細胞集団（ 図2C-D）の単離を示す、39オリゴデンドロサイト前駆細胞をNG2 mRNAの4倍の低下、マーカーを観察しました。 RNAそしてFACSから単離されたDNAは、星状細胞は、その後のメチル化研究のために使用されるのに十分な質および量であったソート。様々な年齢や動物の数から単離した全RNAおよびDNAは、FACS（ 表5）以下の分子の分子の期待利回りの基準として表示されます。これは収率も使用動物数、インキュベーション時間、及び研究者の経験に基づいて変化することに留意すべきである。 表6は、利用動物およびインキュベーション期間の数に応じて取得されたイベントの変動を示しています。
メチル化研究のために、高品質とDNAの十分な量で開始することに成功し、下流のアプリケーションに不可欠です。 RNAまたはDNA抽出のための組織の十分な溶解を確実にするために、組織または細胞のすべての均質化は、溶解中に泡立てないように注意しながら、23G針7Xを使用して粉砕して行きました。いったん高品質のDNAを抽出し、重亜硫酸塩変換されedは、関心領域は、MS-HRMAの対象とすることができます。バイサルファイト変換したDNAの品質と濃度を評価する際に重亜硫酸塩は、DNAを一本鎖さに換算し、分光光度計は、33のOD率で読み取るように設定されるべきであることに注意してください。バイサルファイト変換したDNAのための260/280の値は2.20から2.70の範囲でした。
メチル化の研究を開始する前に、それが適切に選択して、MS-HRMA研究のためのサーマルサイクラーをキャリブレーションすることが重要です。さらに、1は、MS-HRMAから生成された生データをエクスポートし、活用する方法を決定する必要があります。 アプライドバイオシステムズ高解像度融解はガイドが 7900HTサーマルサイクラーを校正するのを支援するために利用された入門します 。最後に、データを抽出して、その後のデータ分析のためのHRM解析ソフトウェアにインポートしました。プロトコルに詳述されているように、前と後の起動と停止のパラメータは、融解曲線の遷移の近くに設定しました。ピーク温度の差は、未知のSAのメチル化状態を推定するために使用されましたmples。 MS-HRMAから取得した推定メチル化データ （ 図3C）、15（パイロシーケンシングデータは、MS-HRMプライマーと同じ領域を標的とするプライマーを使用して家の中で生成された）、パイロシーケンシングから生成されたメチル化データに密接に対応します。
デュアルルシフェラーゼアッセイは、目的の遺伝子（ 図4A）の過剰メチル化領域の転写活性を評価するために利用されました。各のCpGアイランドluc2プラスミドを直鎖状にした後、メチル化されていました。しかし、インサート（CpGアイランド）とベクトル（luc2）の両方が反応中にメチル化されているので、1は、メチル化のインサートを切除しなければならないし、再ライゲートした非メチル化ベクトルに。プラスミドの大規模な操作に、大きな損失が発生し、1は、十分な出発物質で開始する必要があります。 HpaII消化のHpaIIのみが非メチル化DNA（ 図4B）を消化するように、各プラスミドのメチル化状態を確認するために利用されました。これは、ことに留意すべきですO / Nメチル化が不十分である場合には、CpGメチラーゼの付加的なSAMの1×と1×30℃でのインキュベーションの1時間後に添加してもよいです。補足SAMおよびCpGメチラーゼを加えた後、O / Nインキュベーションを継続します。メチル化および非メチル化CpGアイランド-luc2プラスミドの生成は、ルシフェラーゼ活性の測定を介したDNAメチル化と転写活性の間の変更を直接評価することができます。
図1. FACS選別は、eGFPの+細胞popoulationを隔離する。50mlコニカルチューブの（A）の使用上の穴カットをパパイン消化の間に表面のガス交換を可能にします。 （B）選別された細胞は、前方および側方散乱プロットに基づいてゲーティングしました。死細胞インジケータベース（C）、臭化エチジウム、生細胞集団（赤）ゲートを利用しました。 （D）ライブCEL高eGFPのプロファイル（緑）と低eGFPのプロファイル（紫）と1 - リットルの人口は2つの集団を示しました。すべてのグラフは、y軸は側方散乱領域（SSC-A）を表します。 x軸は前方散乱面積（FSC-A）、緑色蛍光タンパク質の領域（GFP-A）、または臭化エチジウム（EtBrを）を表します。 （EG）細胞解離はヘキストでインキュベートし、解離した細胞の20μlのカバースリップ上に置き、画像化しました。大規模なプロセスと（E-E ''）のeGFP +アストロサイトは、（NS）をソートする前に可視化しました。並べ替え、高のeGFP +集団（POS）の後（FFは''）ヘキスト染色で局在共同のeGFP +細胞ソーマを示しています。 （G-G ''）低eGFPの人口はおそらく（すべての画像のため、スケール= 20μm）のアストロサイトの破片を表す、ヘキスト染色と共局在しなかったのeGFP +染色を実証してください。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
eGFP-S100のβトランスジェニック動物の仕分け図2、FACS、FACSの前に解離した細胞（NS）20μlのが示されているアストロサイトの濃縮集団を提供する。（A）、プロセスは（=50μmのスケール）無傷のまま。 （B）代表画像ポストFACS（FACS）細胞が示されています。星状細胞突起を除去し、細胞体のままである（スケール= 20μm）としています。 （C）のqPCRデータは、FACSでALDH1L1 mRNAにおける40倍の増加を示しているソートされていない人口（NS）に比べ細胞（FACS）を選別しました。 （D）NG2 mRNAは、FACSで4倍減少するが。ソートされていない人口（NS）と比較して、細胞をソートするには、ここをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
MS-HRM研究のための図3.サンプル・データと分析。メチル化の標準から生成された温度差プロットの（A）の例。対応パーセントのメチル化は、各曲線（B）ラットメチル化標準から生成された線形回帰式の例のために標識されます。 （C）（pyroseq、緑色のバー）とMS-HRMA（灰色のバー）をパイロシーケンシングから取得％のメチル化の比較は、KCNJ10の変化する領域についてのメチル化の同様のレベルを示しています。MS-HRMと同じ領域を標的とするプライマーを使用して、家の中で生成されたパイロシークエンスデータ分析。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.デュアルルシフェラーゼアッセイを差動メチル化遺伝子領域の転写活性の評価が可能になる。ルシフェラーゼ転写活性アッセイの（A）図は、プロトコルのワークフローを示しています。 （B）DNAゲルは、のHpaII消化後に非メチル化プラスミド対メチル化の違いを表示します。非メチル化DNAを容易にDNAプラスミドの成功したメチル化を実証し、メチル化DNAと比較してのHpaII消化後の消化されます。 （C）DNAゲルは、二重消化後、インサートからのベクトルの分離を示しています。 DNA分離に続いて、ベクターとインサートをゲル抽出しています。 （D）DNAゲルは、ベクターとインサートの成功の再連結を示しています。再連結されたプラスミドは、未処理のプラスミド（untx）と同様の分子量を有しています。 NM、非METhylated; M、メチル化; RL、再連結しました。未処理、untx。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 。 | 容量（μL） | ×3 + 10％過剰 | サンプルのX＃ |
| MeltDoc MM | 10μlの | 33μL | |
| プライマー1 | 1.2μL | 3.96μlの | |
| プライマー2 | 1.2μL | 3.96μlの | |
| gDNA | 1μL | --- | |
| dH 2 0 | 6.6μL | 21.78μlの |
MeltDoctorマスターミックスの表1計算例。各MS-HRMのREAを実行します。ピペッティングの誤差を補償するため、10％の過剰の三連でction。最後の列は、サンプルの複数の番号のために必要な計算を示しています。各反応の総容量は20μlです。
| サイクル | 温度（℃） | 時間（秒） | ランプ速度（％） |
| 95°C | ：15 | 100 | |
| 40倍 | 95°C | ：15 | 100 |
| 60°C | ：60 | 100 | |
| 融解パラメータ | 95°C | ：10 | 100 |
| 60°C | ：60 | 100 | |
| 95°C | ：15 | 1 | |
| 60°C | ：15 | 100 | |
| ホールド | 4 76; C |
表2：増幅のためのサンプルプロトコールは、融解曲線の増幅および生成の40サイクル、続いて10分間95℃でサンプルを変性。融解パラメータは、表の中に記載されています。高解像度融解温度の取得を可能にするランプ速度の変化に注意してください。
| パーセントメチル化（ラット標準） | ピーク温度差 |
| Y | X |
| 0 | 5.670116 |
| 5 | 10.70448 |
| 10 | 15.5044 |
| 25 | 25.52295 |
| 50 | 34.43047 |
| 75 | 43.80894 |
| 100 | 53.88717 |
| ピーク温度差 | 推定メチル化 |
| X | Y |
| サンプル1（N = 4） | |
| 47.450 | 81.115 |
| 46.292 | 78.657 |
| 41.694 | 68.894 |
| 47.292 | 80.779 |
| サンプル2（N = 4） | |
| 29.925 | 43.904 |
| 24.269 | 31.894 |
| 25.061 | 33.575 |
| 25.389 | 34.272 |
算出された推定パーセントのメチル化の例を表4。不明メチル化状態のサンプルのピーク温度の差は、線形回帰式を用いて％のメチル化を推定するために使用されます。 2つの異なる状態、サンプル1とサンプル2からの代表的なデータが示されています。 N =各条件について4。
| 年令 | 動物の数 | トータルRNA（NG） | 全DNA（NG） |
| P4-P10 | 3-6 | 455から868 | 265-1523 |
| P19-P22 | 1-2 | 220から680 | 583-1483 |
| P40-P50 | 3-4 | 198から260 | 578-1700 |
FACSから取得した表5の全RNAとDNAは、細胞を選別した。年齢とFAで使用される動物の数CS実験が記載されています。各N.全RNAとDNAが予想される収量の基準として表示されているため、両方の皮質を利用して、注意してください。
| 年令 | 動物の数 | 順位のイベント | NEGイベント | インキュベーション時間（37℃） |
| P26 | 1 | 2.18X10 ^ 6 | 1.15X10 ^ 6 | 20：00分 |
| P26 | 2 | 4.4X10 ^ 6 | 2.78X10 ^ 6 | 20：00分 |
| P26 | 2 | 9.2X10 ^ 6 | 3.3×10 ^ 6 | 30:00分 |
正（EGFP +）イベントや負のイベントのP26番号で生後26でFACSから取得したイベントの表6数を利用する動物の数およびインキュベーション期間によって異なります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| Methyl Primer | Applied Biosystems | online | software to localize CpG Islands |
| EZ DNA methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Rat Premixed Calibration Standard | EpiGenDx | 80-8060R-Premix | |
| CpG Methylase (M.Sssl) | Zymo Research | E2010 | |
| QIAquick Gel Extraction | QIagen | 28704 | Used for gel extraction and DNA cleanup |
| Restriction enzymes | New England BioLabs | ||
| NEB cutter | New England BioLabs | online | verify restriction digest sites |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Luc2 vector, pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| renilla vector, pGL4.74 | Promega | E2241 | |
| TD-20/20 Luminometer | Turner Designs | ||
| Lipofectamine LTX and Plus Reagent | Life Technologies | A12621 | |
| Phenol, saturated pH 6.6/6.9 | Fisher Scientific | BP 17501-100 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer | ThermoScientific | ||
| MeltDoctor Master Mix | Life Technologies | 4415440 | |
| High Resolution Melt (HRM) Software v2.0 | Life Technologies | 4397808 | |
| AB SDS software v2.3 | Life Technologies | online | |
| AB High Resolution Melting Getting Started Guide | Life Technologies | online | |
| AB 7900HT Fast Real-Time System | Life Technologies |
References
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