Protocol
Alle dyr blev behandlet i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer. Animal Care og brug Udvalg ved University of Alabama i Birmingham godkendte anvendelsen af dyr.
1. Opnåelse af RNA og DNA fra en beriget astrocytisk Population anvendelse af fluorescerende aktiveret cellesortering (FACS) astrocytters fra Whole Brain Tissue
- Adstadige dyr med CO 2 i 1 min og derefter hurtigt halshugge. Dissekere cortex som beskrevet i Albuquerque et al, 26.; Det er ikke nødvendigt at fjerne meninges.
Bemærk: Transgene rotter, der udtrykker eGFP under S100β (en astrocyt markør) promotor blev dannet ved Itakura et al 27 og anvendes til FACS-sortering af astrocytter.. - Forbered hele hjernen homogenat ved hjælp af en papain dissociation kit under ikke-sterile betingelser i overensstemmelse med producentens protokol. Heat-aktivere papain ved 37 ° C i vandbad i 10 minutter. Note:Papain løsning er leveret af producenten og indeholder L-cystein og EDTA (se tabel Materialer).
- Skåret eller Dremel et hul i toppen af en 50 ml konisk rør for at tillade slangen bærer 95% O 2: 5% CO 2, der skal føres ind i en lukket konisk rør (figur 1A). Placer dissekerede cortex i 10mm dyrkningsskål indeholdende dissociation media (MEM suppleret med 20 mM glucose og penicillin / streptomycin (500 U / ml) og ækvilibreret til 95% O 2: 5% CO2) og bruge en rent barberblad til hakke vævet i 1 x 1 mm 2 stk.
- Transfer væv under anvendelse af 10 ml manuel Pipetman til 50 ml koniske rør indeholdende papainopløsning. Tillad væv at bosætte til bund overførsel pipette før afladning at minimere mængden af dissociation medier fremføres. Hold papainopløsning ækvilibreret til 95% O 2: 5% CO 2 via overfladen gasudveksling for varigheden af inkubationen. Må ikke boble papain solutipå. Inkuber væv i 20 minutter i 37 ° C vandbad.
- Efter inkubering i papainopløsning, tritureres vævet 10 gange med en 10 ml pipette transfer ved lav hastighed. Centrifuge overskyet cellesuspension ved 1.000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Ækvilibrer DNase / albumin inhibitoropløsning (leveret af producenten) via overfladen gasudveksling og re-suspendere pelleterede celler i 3 ml DNase / albumin inhibitoropløsning. Forbered kommercielle diskontinuerlig densitetsgradient ved at følge producentens instruktioner.
- Spin diskontinuerlig densitetsgradient ved 1.000 xg i 6 min. Isoler dissocierede celler fra bunden af røret ved at suge bunden pellet ved hjælp af en pipette.
- Resuspender celler i dissocierede 2-3 ml DPBS med 0,02% bovint serumalbumin og 1 mg / ml DNase eller foretrukne HEPES bufret kulturmedier. Passere gennem 40 um filter før FACS (figur 2A). At holde cellerne på is indtil sortering.
- Udfør FACS 28. </ li>
- Pellet celler i 1,5 ml centrifugerør ved 2.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
Bemærk: Pelleteret astrocytter kan anvendes straks eller opbevares i -80 ° C indtil DNA-ekstraktion.
- Uddrag RNA og DNA under anvendelse af foretrukne isoleringsmetode 29 30. Vurdere RNA og DNA koncentration og kvalitet via spektrofotometer og Bioanalyzer 31.
Bemærk: Udnyt kun høj RNA kvalitet og DNA i efterfølgende trin, 260/280 = 2,0-2,2 og 1,8-1,9 hhv. Bioanalyzer analyse er nødvendig til vurdering for RNA nedbrydning eller DNA-fragmentering. RNA eller DNA kan anvendes straks eller opbevares i -80 ° C eller -20 ° C, henholdsvis til efterfølgende undersøgelser.
2. Vurdering DNA methyleringsstatus af et gen ved hjælp Methylering-sensitive High Resolution Melt Analyse (MS-HRMA)
- Indtast gensekvens af interesse i foretrukne online methylering mapping software til at identificere eventuelle CpG øer i genaf interesse 32.
- Design primere mod bisulfit omdannet DNA-sekvens 33 og forstærke bruger foretrukket DNA-polymerase ifølge producentens protokol. Kontroller amplificeret produkt størrelse ved at køre en 1% agarose gel ved DNA 100 V i 45 minutter. Store primere ved stamkoncentration på 20 uM i -20 ° C.
- Bisulfit konvertere 500-1.000 ng DNA fra hver prøve, og methyleret DNA standarder i området fra 0-100% fra samme dyreart 34. Eluere prøver at tilvejebringe en koncentration på 20 ng / pl. Kontroller koncentrationen af bisulfit omdannede DNA via spektrofotometer 31.
- 20 reaktioner for MS-HRM forstærkning ved hjælp af foretrukne DNA-polymerase og primere ved 5 uM koncentrationen i henhold til tabel 1 og 2 Setup ul. Kør alle prøver, herunder FACS DNA- og methylerede standarder, i tre eksemplarer.
- Afhængig af analysen software, sæt før og efter starte og stoppe parametreomkring overgange i smelten kurven. Set pre-melt start og pre-melt stop-parametre, således at forskellen mellem de to er 0,2 - 0,5 ° C. Set post-melt start og post-melt stoppe på lignende måde. Uddrag peak temperaturforskel data for hver prøve.
- Brug procent methylerede standarder (y-værdi) og deres tilsvarende gennemsnitlige peak temperaturforskelle (x-værdi) generere en lineær regression ligning (figur 3A-B, tabel 3-4). Brug denne lineære regressionsligning at estimere metyleringsstatus af ukendte prøver 35.
3. Vurdering Hyper-methylerede promotoraktivitet via brug af Luciferase Assay
- Identificer CpG øer af target genet (trin 2.1). PCR amplifikation områder af interesse 36 og klon opstrøms for luc2 ildflueluciferasereportergen at producere CpG-ø-luc2 plasmider 37.
- Linearisere 30 ug CpG-ø-luc2 plasmid via begrænsningenzymfordøjelse 38. Kontroller sites for restriktionsfordøjelse og undgå dobbelt nedskæringer hjælp foretrukne fræser software 38. Heat-inaktivere enzymer ved passende temperatur og varighed efter spaltning ifølge producentens protokol. Minimalt tab af DNA sker under linearisering trin.
- Methylat lineariserede plasmider hjælp CpG methylase (M.Sssl) O / N ved 30 ° C eller forlade ubehandlet følgende producent protokol undtagen følgende justeringer.
- Udfør 50 pi reaktioner.
- Brug 5 enheder af CpG methylase at methylere 700 ng lineariseret plasmid.
- Kør reaktioner O / N for 13-19 timer.
- Efter CpG methylase reaktionen udføre DNA oprydning anvendelse af standard, kommercielt tilgængelig silica-gel membran rense Kit ifølge producentens protokol. Betydelige tab på DNA opstår efter CpG methylase reaktion, 30-60% tab.
- Kontroller methylering af plasmider via en HpaII restriktionsfordøjelse. Tag 1 ug methyleret eller ikke-methyleret DNA og restriktionsfordøjelse med Hpa II i 1 time ved 37 ° C. Brug 5-10 enheder af Hpa II for hver ug DNA. Efter HpaII fordøjelse, udføre DNA oprydning bruger foretrukket, kommercielt tilgængeligt silica-gel membran rense kit. Køre både CpG methylerede og ikke-methylerede plasmider på en 1% agarose gel DNA i TAE eller TBE-buffer ved 100 V i 45 minutter til visualisering (figur 4B).
- Underlagt både methylerede og ikke-methylerede plasmider til dobbelt fordøjelse med passende restriktionsenzymer til at frigive fuld længde luc 2 (vektor) og CpG øen (indsæt) fragmenter 38. Udfør dobbelt fordøjelse O / N ved passende temperatur og varme-inaktivere enzymer efter fordøjelse ifølge producentens protokol. Minimalt tab af DNA-koncentrationen forekommer under dobbelt restriktionsfordøjelse.
- Kør dobbelt spaltede plasmider på 1% DNA agarosegel ved 100 V i 1 time for at tillade separation of vektor og indsætte (figur 4C). Forsigtighed. Iført beskyttende UV ansigtsskærm, placere DNA gel på en bordplade sort lys til at visualisere bands. Baseret på størrelse, punktafgifter methyleret og ikke-methyleret insert og ikke-methyleret vektor med en ren kirurgisk kniv.
- Gel ekstrakt DNA under anvendelse af mættet phenol, pH 6,6. Kort fortalt afvejes DNA gel indeholdende vektor eller insert. Brug 100 pi phenol pr 0,1 gram DNA gel. Homogeniseres DNA gel i phenol hjælp af glas dounce homogenisator.
- Tilføj chloroform (ved hjælp af 1/5 af phenol volumen) og omrystes prøver til 20 sek. Inkuber prøver ved stuetemperatur i 2-3 min. Centrifuge i 15 min ved maks hastighed (16,1 x 1.000 xg) ved 4 ° C.
- Fjern vandig opløsning, og der tilsættes 0,1 x volumen 3 M natriumacetat og 2.5x volumen ethanol. Inkuber prøver i 1 time ved -80 ° C. Efter inkubation fjernes ethanol og resuspender DNA'et i 30 pi foretrukne puffer. Betydeligt tab af DNA forekommer efter isolering af skær og vektorer, 30-50% loss.
- Re-afsnøre methylerede og ikke-methylerede skær til ikke-methylerede vektor under anvendelse af T4 DNA-ligase 38. Brug en 1: 4 forhold mellem vektor indsætte for ligeringsreaktioner. Setup reaktion ifølge producentens instruktioner. Brug et samlet volumen på 50 pi til reaktioner og inkuberes O / N ved -20 ° C eller på is med låg over is spand.
- Efter ligering udføre DNA oprydning bruger foretrukket, kommercielt tilgængeligt silica-gel membran rense kit. Betydeligt tab af DNA opstå som følge ligeringsreaktionen en omtrentlig 30-50% tab af DNA. Kontroller religering ved at køre på 1% agarose gel ved DNA 100 V i 45 minutter og vurdere koncentrationen af religeret plasmider (figur 4D).
- Transficere methylerede eller ikke-methylerede plasmider i D54 celler under anvendelse af et kommercielt transfektion reagens ifølge producentens protokol. Seed D54 celler på plade med 12 brønde på en 0,14 x 10 6 celler / brønd.
- Efter 24 timer, transfektion celler with lige koncentrationer af enten (1) ikke-methyated CpG-luc2 plasmid + Renilla eller anden kontrol luciferase vektor eller (2) methylerede CpG-luc2 plasmid + Renilla eller anden kontrol luciferase vektor.
- Tillad celler til transfektion i 24 timer før udførelse dual luciferase assay. Udfør assay ifølge producentens instruktioner. Udfør aflæsninger under anvendelse af et luminometer. Læs hver brønd i tre eksemplarer.
- Beregn forholdet mellem Firefly luciferaseaktiviteten at Renilla eller anden kontrol luciferaseaktiviteten. Normalisere methyleret Firefly: kontrol luciferaseaktivitet til ikke-methylerede Firefly: kontrol luciferaseaktivitet ved at dividere methyleret luciferaseaktivitet af ikke-methylerede luciferaseaktivitet
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En beriget population af astrocytter blev erhvervet via FACS sortering af eGFP-S100β transgene dyr 27. På grund af faldende kvalitet af celler og molekylære molekyler er isoleret fra dyr ældre end postnatal dag 50 (p50), dyr på p0-p40 er optimale for sådanne forsøg. Cortexvæv blev anvendt til disse eksperimenter. Cortex fra to til seks dyr blev samlet sammen. FACS blev udført ved UAB Omfattende flowcytometri Core facilitet. Sortering blev udført på Becton Dickinson FacsAria II. eGFP excitation opnåedes ved hjælp af 488 nm laser; ingen kompensation var nødvendigt. En gated population var målrettet baseret på forward og side scatter (figur 1B). En levende cellepopulation blev bestemt ved anvendelse af en ethidiumbromid døde celler indikator og gated (figur 1C). To forskellige populationer blev observeret baseret på EGFP profil (figur 1D). Gennem empirisk testning, cellepopulationen med højere eGFPprofil blev identificeret som EGFP-positive cellepopulation (fig 1F-F '). Visuel analyse af den anden population med en lavere eGFP profil afslørede cellefragmenter udtrykker eGFP, men blottet for kerner, sandsynligvis repræsenterer rester fra astrocytiske processer (figur 1G-G '). Repræsentative billeder af dissocierede eGFP positive astrocytter efter dissociation, men før sortering (figur 2A) og efter sortering (figur 2B) er vist. Isoleret eGFP positive cellepopulation viste en 40-fold stigning i ALDH1L1 mRNA, en astrocytisk specifik markør 39 (Figur 2C). Derudover trods fælles ekspression af S100β i NG2 + OPCs og astrocytter 39, observerede vi en 4-fold reduktion af NG2 mRNA, en markør for oligodendrocyt precursorceller 39, hvilket indikerer isolering af en beriget astrocytisk cellepopulation (figur 2C-D). RNAog DNA isoleret fra FACS sorteres astrocytter var af tilstrækkelig kvalitet og mængde, der skal bruges til efterfølgende methylering studier. Total RNA og DNA isoleret fra forskellige aldre og antallet af dyr er opført som en reference for forventet udbytte af molekylære molekyler efter FACS (tabel 5). Det skal bemærkes, at udbyttet også vil variere baseret på antal dyr udnyttet, inkubationstid, og erfaring med forsker. Tabel 6 viser variationen af begivenhederne erhvervet afhængigt af antallet af anvendte dyr og inkubationsperioder.
For methylering undersøgelser, begyndende med høj kvalitet og tilstrækkelige mængder DNA er afgørende for en vellykket efterfølgende anvendelser. For at sikre tilstrækkelig lysis af væv til RNA eller DNA ekstraktion blev alle homogenisering af væv eller celler efterfulgt af triturering hjælp af en 23G nål 7x, idet man for at undgå skumdannelse under lyse. Når høj kvalitet DNA ekstraheres og bisulfit konvertereed, kan regioner af interesse målrettes til MS-HRMA. Bemærk, at ved vurderingen af kvaliteten og koncentration af bisulfit konverterede DNA, bør spektrofotometer sættes til at læse på en OD faktor på 33, som bisulfit omdannet DNA er enkeltstrenget. De 260/280 værdier for bisulfit omdannede DNA varierede fra 2.20-2.70.
Før påbegyndelse af methylering undersøgelser, er det vigtigt at vælge passende og kalibrere en thermocycler for MS-HRMA undersøgelser. Derudover skal man bestemme, hvordan du eksporterer og udnytte rådata fra MS-HRMA. Applied Biosystems High Resolution Melting Kom godt i gang blev anvendt til at hjælpe med kalibrering af 7900HT termiske cycler. Endelig blev ekstraheret data og importeres til HRM analyse software til efterfølgende analyse af data. Som beskrevet i protokollen, før og efter start og stop parametre blev sat i nærheden af overgange i smelte kurven. Peak temperaturforskelle blev anvendt til at ekstrapolere metyleringsstatus af ukendt samples. Anslået methylering data indhentet fra MS-HRMA nøje svarede til methylering data fra pyrosekventering (pyrosekventering data blev genereret i huset ved hjælp af primere rettet mod samme regioner som MS-HRM primere) (figur 3C) 15.
En dobbelt luciferase assay blev anvendt til at vurdere den transkriptionelle aktivitet af hyper-methylerede regioner af genet af interesse (figur 4A). Hver CpG-ø-luc2 plasmid blev lineariseret og derefter methyleret. Men fordi både indsatsen (CpG øen) og vektor (luc2) methyleres under reaktionen, må man udskære den methylerede insert og re-ligeres til en vektor ikke-methyleret. På grund af omfattende manipulering af plasmidet, forekommer betydelige tab, og man skal begynde med tilstrækkelig udgangsmateriale. HpaII fordøjelse blev anvendt til at kontrollere status for methylering af hvert plasmid som HpaII kun fordøjer ikke-methyleret DNA (figur 4B). Det skal bemærkes, atHvis O / N-methylering er utilstrækkelig, kan en supplerende 1x SAM og 1x CpG methylase tilføjes efter 1 time inkubation ved 30 ° C. Fortsæt O / N inkubation efter tilsætning af supplerende SAM og CpG methylase. Generering af methyleret og ikke-methyleret CpG-ø-luc2 plasmid giver mulighed for direkte vurdering af ændringer mellem DNA-methylering og transkriptionel aktivitet via måling af luciferaseaktivitet.
Figur 1. FACS sortering isolerer eGFP + celle popoulation. (A) Anvendelse af en 50 ml konisk rør med hul skåret på toppen giver mulighed for overfladen gasudveksling under papainspaltning. (B) Sorteret celler blev gated baseret på forward og side scatter plots. (C) En ethidiumbromid baseret døde celler indikator blev anvendt til gate en levende cellepopulation (rød). (D) Levende cell demonstrerede to populationer - en med en høj eGFP profil (grøn) og en lav eGFP profil (lilla). For alle grafer, y-aksen repræsenterer sidespredning område (SSC-A); X-aksen repræsenterer frem sidespredning område (FSC-A), grønt fluorescerende protein området (GFP-A), eller ethidiumbromid (EtBr). (EG) dissocierede celler blev inkuberet med Hoechst og 20 pi dissocierede celler blev placeret på dækglas og afbildes. (EE ') eGFP + astrocytter, med omfattende processer blev visualiseret før sorteringen (NS). (FF '') Efter sortering, høj eGFP + populationen (POS) demonstrerer eGFP + celle soma som co-lokalisere med Hoechst farvning. (GG '') Lav eGFP befolkning demonstrerer eGFP + farvning, som ikke samarbejdede lokalisere med Hoechst farvning, sandsynligvis repræsenterer astrocytisk vragrester (for alle billeder, skala = 20 pm). Venligstklik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. FACS-sortering af eGFP-S100 p transgene dyr giver beriget population af astrocytter. (A) 20 pi dissocierede celler før FACS (NS) er vist, processer forbliver intakte (skala = 50 um). (B) repræsentativt billede post-FACS (FACS) celler er vist; astrocytiske processer fjernes og celle soma rester (skala = 20 um). (C) qPCR data viser en 40-fold stigning i ALDH1L1 mRNA i FACS sorteret celler (FACS) sammenlignet med ikke sorteret population (NS). (D) NG2 mRNA reduceret med 4 gange i FACS sorterede celler i forhold til ikke sorteres befolkning (NS). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Sample data og analyser til MS-HRM undersøgelser. (A) Eksempel på temperatur forskel grunde genereret fra methylering standarder. Svarende procent methylering er mærket til hver kurve (B) Eksempel på lineære regressionsligning genereret fra rotte methyleret standarder. (C) Sammenligning af procent methylering erhvervet fra pyrosekventering (pyroseq, grønne søjler) og MS-HRMA (grå søjler) demonstrerer tilsvarende niveauer af methylering til varierende regioner af KCNJ10. Pyrosequencing data genereret i hus ved hjælp af primere rettet mod samme regioner som MS-HRM analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Dobbelt luciferaseassayet muliggør vurdering af transkriptionsaktivitet af differentielt methylerede genregioner. (A) Diagram over luciferase transkriptionsaktivitet assay demonstrerer workflow af protokollen. (B) DNA gel viser forskelle i methyleret versus ikke-methylerede plasmider følgende HpaII fordøjelse. Ikke-methyleret DNA let fordøjes efter HpaII fordøjelse sammenlignet med methyleret DNA, hvilket viser vellykket methylering af DNA-plasmid. (C) DNA gel viser adskillelse af vektor fra insert efter dobbelt fordøjelse. Efter DNA separation, vektor og insert er gel ekstraheret. (D) DNA gel demonstrerer succesfuld re-ligering af vektor og insert. Religeret plasmid har tilsvarende molekylvægt som ubehandlet plasmid (untx). NM, ikke-opfyldthylated; M, methyleret; RL, re-ligeret; untx, ubehandlet. Klik her for at se en større version af dette tal.
| . | Volumen (pi) | x3 + 10% overskud | x # af prøver |
| MeltDoc MM | 10 pi | 33 pi | |
| Primer 1 | 1.2 pi | 3,96 pi | |
| Primer 2 | 1.2 pi | 3,96 pi | |
| gDNA | 1 pi | --- | |
| dH 2 0 | 6.6 pi | 21.78 pi |
Tabel 1. Eksempel på beregning af MeltDoctor Mastermix. Kør hver MS-HRM reaIndsatsen i tre eksemplarer med 10% overskud til at kompensere for pipettering fejl. Sidste kolonne angiver beregning nødvendig for flere antal prøver. Samlet volumen for hver reaktion er 20 pi.
| Cycle | (° C) | Tid (sek) | Stigningsgrad (%) |
| 95 ° C | : 15 | 100 | |
| 40x | 95 ° C | : 15 | 100 |
| 60 ° C | : 60 | 100 | |
| Smeltende parametre | 95 ° C | : 10 | 100 |
| 60 ° C | : 60 | 100 | |
| 95 ° C | : 15 | 1 | |
| 60 ° C | : 15 | 100 | |
| Hold | 4 76; C |
Tabel 2:. Sample protokol for amplifikation Denaturer prøver ved 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 40 cykler af amplifikation og generering af smelte kurve. Smeltepunkter parametre er angivet i tabellen. Bemærk ændring i rampe sats, der giver mulighed for erhvervelse af høj opløsning smeltetemperatur.
| Procent Methylering (Rat Standard) | Peak temperaturforskel |
| y | x |
| 0 | 5.670116 |
| 5 | 10,70448 |
| 10 | 15,5044 |
| 25 | 25,52295 |
| 50 | 34,43047 |
| 75 | 43,80894 |
| 100 | 53,88717 |
| Peak Temp Forskel | Anslået methylering |
| X | Y |
| Prøve 1 (n = 4) | |
| 47,450 | 81,115 |
| 46,292 | 78,657 |
| 41,694 | 68,894 |
| 47,292 | 80,779 |
| Prøve 2 (n = 4) | |
| 29,925 | 43,904 |
| 24,269 | 31,894 |
| 25,061 | 33,575 |
| 25,389 | 34,272 |
Tabel 4. Eksempel på beregnede estimerede procent methylering. Peak temperaturforskel på prøver af ukendt metyleringsstatus anvendes til at estimere procent methylering under anvendelse af en lineær regressionsligning. Repræsentative data fra to forskellige forhold, Sample 1 og Prøve 2, er vist; n = 4 for hver tilstand.
| Alder | Antal dyr | Totalt RNA (ng) | Totalt DNA (ng) |
| p4-p10 | 3-6 | 455-868 | 265-1523 |
| p19-p22 | 1-2 | 220-680 | 583-1483 |
| p40-P50 | 3-4 | 198-260 | 578-1700 |
Tabel 5. Total RNA og DNA erhvervet fra FACS sorteres cellerne. Alder og antal dyr, der anvendes i FACS eksperimenter er angivet. Bemærk blev begge cortex udnyttet for hver N. Total RNA og DNA er opført som en reference for forventet udbytte.
| Alder | Antal dyr | Pos Begivenheder | Neg Begivenheder | Inkubationstid (ved 37 ° C) |
| P26 | 1 | 2.18X10 ^ 6 | 1.15X10 ^ 6 | 20:00 min |
| P26 | 2 | 4.4X10 ^ 6 | 2.78X10 ^ 6 | 20:00 min |
| P26 | 2 | 9.2X10 ^ 6 | 3.3X10 ^ 6 | 30:00 min |
Tabel 6. Antal hændelser erhvervet fra FACS ved postnatal dag 26. Ved P26 antal positive (eGFP +) arrangementer og negative begivenheder varierer afhængigt af antallet af anvendte dyr og inkubationstid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| Methyl Primer | Applied Biosystems | online | software to localize CpG Islands |
| EZ DNA methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Rat Premixed Calibration Standard | EpiGenDx | 80-8060R-Premix | |
| CpG Methylase (M.Sssl) | Zymo Research | E2010 | |
| QIAquick Gel Extraction | QIagen | 28704 | Used for gel extraction and DNA cleanup |
| Restriction enzymes | New England BioLabs | ||
| NEB cutter | New England BioLabs | online | verify restriction digest sites |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Luc2 vector, pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| renilla vector, pGL4.74 | Promega | E2241 | |
| TD-20/20 Luminometer | Turner Designs | ||
| Lipofectamine LTX and Plus Reagent | Life Technologies | A12621 | |
| Phenol, saturated pH 6.6/6.9 | Fisher Scientific | BP 17501-100 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer | ThermoScientific | ||
| MeltDoctor Master Mix | Life Technologies | 4415440 | |
| High Resolution Melt (HRM) Software v2.0 | Life Technologies | 4397808 | |
| AB SDS software v2.3 | Life Technologies | online | |
| AB High Resolution Melting Getting Started Guide | Life Technologies | online | |
| AB 7900HT Fast Real-Time System | Life Technologies |
References
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16 (1), 6-21 (2002).
- Deaton, A. M., Bird, A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25, 1010-1022 (2011).
- Lorincz, M. C., Dickerson, D. R., Schmitt, M. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells. Nat Struct. Mol Biol. 11 (11), 1068-1075 (2004).
- Moore, L. D., Le, T. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacol. 38, 23-38 (2013).
- Santos, K. F., Mazzola, T. N. The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Braz.J.Med.Biol.Res. 38 (10), 1531-1541 (2005).
- Day, J. J., Sweatt, J. D. Cognitive neuroepigenetics: a role for epigenetic mechanisms in learning and memory. Neurobiol. Learn.Mem. 96, 2-12 (2011).
- Denk, F., McMahon, S. B. Chronic pain: emerging evidence for the involvement of epigenetics. Neuron. 73, 435-444 (2012).
- Endres, M., et al. DNA methyltransferase contributes to delayed ischemic brain injury. J. Neuroscience. 20 (9), 3175-3181 (2000).
- Qureshi, I. A., Mehler, M. F. Emerging role of epigenetics in stroke: part 1: DNA methylation and chromatin modifications. Arch.Neurol. 67, 1316-1322 (2010).
- Tian, R., et al. disease mutant glial fibrillary acidic protein compromises glutamate transport in astrocytes. J Neuropathol. Exp Neurol. 69, 335-345 (2010).
- Perisic, T., Holsboer, F., Rein, T. The CpG island shore of the GLT-1 gene acts as a methylation-sensitive enhancer. Glia. 60 (9), 1345-1355 (2012).
- Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
- Poopalasundaram, S., et al. Glial heterogeneity in expression of the inwardly rectifying K+ channel, Kir4.1, in adult rat CNS. Glia. 30, 362-372 (2000).
- Hibino, H., Fujita, A., Iwai, K., Yamada, M. Differential assembly of inwardly rectifying K+ channel subunits. Kir4.1 and Kir5.1, in brain astrocytes. 279, 44065-44073 (2004).
- Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
- Li, L., Head, V. Identification of an inward rectifier potassium channel gene expressed in mouse cortical astrocytes. Glia. 33, 57-71 (2001).
- Kucheryavykh, Y. V., et al. Downregulation of Kir4.1 inward rectifying potassium channel subunits by RNAi impairs potassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes. Glia. 55 (3), 274-281 (2007).
- Djukic, B., Casper, K. B., Philpot, B. D., Chin, L. S. Conditional knock-out of Kir4.1 leads to glial membrane depolarization, inhibition of potassium and glutamate uptake, and enhanced short-term synaptic potentiation. J. Neuroscience. 27, 11354-11365 (2007).
- Fujita, A., et al. Clustering of Kir4.1 at specialized compartments of the lateral membrane in ependymal cells of rat brain. Cell Tissue Res. 359 (2), 627-634 (2015).
- MacFarlane, S. N., Sontheimer, H. Electrophysiological changes that accompany reactive gliosis in vitro. J Neuroscience. 17 (19), 7316-7329 (1997).
- Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R. Impaired K(+) homeostasis and altered electrophysiological properties of post-traumatic hippocampal glia. J. Neuroscience. 19 (18), 8152-8162 (1999).
- Anderova, M., et al. Voltage-dependent potassium currents in hypertrophied rat astrocytes after a cortical stab wound. Glia. 48 (4), 311-326 (2004).
- Olsen, M. L., Campbell, S. C., McFerrin, M. B., Floyd, C. L. Spinal cord injury causes a wide-spread, persistent loss of Kir4.1 and glutamate transporter 1: benefit of 17 beta-oestradiol treatment. Brain. 133, 1013-1025 (2010).
- Koller, H., Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Time course of inwardly rectifying K(+) current reduction in glial cells surrounding ischemic brain lesions. Brain Res. 872, 1-2 (2000).
- Bordey, A., Lyons, S. A., Hablitz, J. J. Electrophysiological characteristics of reactive astrocytes in experimental cortical dysplasia. J Neurophysiol. 85 (4), 1719-1731 (2001).
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P. plating, and maintenance of cortical astrocyte cultures. 8, Cold Spring. 10-1101 (2009).
- Itakura, E., et al. Generation of transgenic rats expressing green fluorescent protein in S-100beta-producing pituitary folliculo-stellate cells and brain astrocytes. Endocrinology. 148, 1518-1523 (2007).
- Foo, L. C. Purification of astrocytes from transgenic rodents by fluorescence-activated cell sorting. Cold Spring Harb.Protoc. 2013, 551-560 (2013).
- Smith, C., Otto, P., Bitner, R. A silica membrane-based method for the isolation of genomic DNA from tissues and cultured cells. CSH. Protoc. 2006, 2006-201 (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. A Single-step Method for the Simultaneous Preparation. of DNA, RNA, and Protein from Cells and. 1, 2006-201 (2006).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K. Quantitation of DNA and. , (2007).
- Zhao, Z., Han, L. CpG islands: algorithms and applications in methylation studies. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 643-645 (2009).
- Srivastava, G. P., Guo, J., Shi, H. PRIMEGENS-v2: genome-wide primer design for analyzing DNA methylation patterns of CpG islands. Bioinformatics. 24, 1837-1842 (2008).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J.Vis.Exp.(56), doi:3170 [pii];10.3791/3170. , (2011).
- Drummond, G. B., Vowler, S. L. Categorized or continuous? Strength of an association-and linear regression. Adv.Physiol Educ. 36, 89-92 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. The basic polymerase chain reaction. CSH.Protoc. 1, (2006).
- Arpa, P. Strategies for cloning PCR products. Cold Spring Harb.Protoc. 8, (2009).
- Makovets, S. Basic DNA electrophoresis in molecular cloning: a comprehensive guide for beginners. Methods Mol.Biol. 1054, 11-43 (2013).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neuroscience. 28, 264-278 (2008).
- Maldonado, P. P., Velez-Fort, M., Levavasseur, F. Oligodendrocyte precursor cells are accurate sensors of local K+ in mature gray matter. J Neuroscience. 33, 2432-2442 (2013).
- Kalsi, A. S., Greenwood, K., Wilkin, G. Kir4.1 expression by astrocytes and oligodendrocytes in CNS white matter: a developmental study in the rat optic nerve. J.Anat. 204, 475-485 (2004).
- Higashi, K., et al. An inwardly rectifying K(+) channel, Kir4.1, expressed in astrocytes surrounds synapses and blood vessels in brain. Am.J.Physiol Cell Physiol. 281 (3), (2001).
- Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
- Neusch, C., Rozengurt, N., Jacobs, R. E., Lester, H. A. Kir4.1 Potassium Channel Subunit Is Crucial for Oligodendrocyte Development and In Vivo Myelination. J. Neuroscience. 21 (15), 5429-5438 (2001).
- Kofuji, P., et al. Genetic Inactivation of an Inwardly Rectifying Potassium Channel (Kir4.1 Subunit) in Mice: Phenotypic Impact in Retina. J. Neuroscience. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Kofuji, P., Connors, N. C. Molecular substrates of potassium spatial buffering in glial cells. Mol.Neurobiol. 28, 195-208 (2003).
- Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
- Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high-resolution melting. Nat.Protoc. 3, 1903-1908 (2008).
- Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res. 35, 10-1093 (2007).
- Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nat.Rev.Genet. 11, 191-203 (2010).
