Protocol
Tous les animaux ont été traités en conformité avec les Instituts nationaux de la santé des lignes directrices. Le soin et l'utilisation Comité animale de l'Université de l'Alabama à Birmingham a approuvé l'utilisation des animaux.
1. Obtenir l'ARN et l'ADN à partir d'une population enrichie en utilisant astrocytique cellulaire activé par fluorescence (FACS) des astrocytes Whole Brain Tissue
- Animaux Sedate avec le CO 2 pendant 1 min, puis décapiter rapidement. Disséquer cortex comme décrit dans Albuquerque et al, 26.; il est pas nécessaire de retirer les méninges.
Remarque: les rats transgéniques exprimant eGFP sous la S100β (un marqueur des astrocytes) promoteur ont été générés par Itakura et al 27 et utilisés pour FACS tri des astrocytes.. - Préparer homogénat de cerveau entier en utilisant un kit de dissociation de la papaïne dans des conditions non stériles selon le protocole du fabricant. Heat-activer la papaïne à 37 ° C au bain-marie pendant 10 min. Note:Solution de papaïne est fourni par le fabricant et qui contient la L-cystéine et de l'EDTA (voir le tableau des matériaux).
- Couper ou dremel un trou dans la partie supérieure d'un tube conique de 50 ml pour permettre à un tube de transport 95% O 2: 5% de CO 2 pour être introduit dans un tube conique fermée (figure 1A). Placez cortex disséqués en 10mm boîte de culture contenant un milieu de dissociation (MEM complété avec 20 mM de glucose et de la pénicilline / streptomycine (500 U / ml) et équilibrée à 95% O 2: 5% de CO 2) et d'utiliser une lame de rasoir propre pour hacher tissu dans 1 x 1 mm 2 pièces.
- Tissus de transfert en utilisant 10 ml de Pipteman manuel à 50 ml tube conique de solution contenant de la papaïne. Permettre au tissu de se déposer au fond de pipette de transfert avant de décharger de minimiser la quantité de support de dissociation reportés. Conserver la solution de papaïne équilibrée à 95% d'O 2: 5% de CO 2 par l'intermédiaire d'un échange de gaz de la surface de la durée de l'incubation. Ne bulle papaïne solutisur. Incuber les tissus pendant 20 min dans 37 ° C bain d'eau.
- Après incubation dans une solution de papaïne, la trituration tissu 10 fois avec une pipette 10 ml de transfert à vitesse lente. Centrifugeuse suspension cellulaire nuageux à 1000 g pendant 5 min à température ambiante.
- Equilibrer solution d'inhibiteur de DNase / albumine (fourni par le fabricant) par l'intermédiaire d'un échange de gaz de surface et remettre en suspension les cellules rassemblées en un culot dans 3 ml de solution d'inhibiteur / albumine de DNase. Préparer gradient de densité commerciale discontinue suivant les instructions du fabricant.
- Spin gradient de densité discontinu à 1000 g pendant 6 min. Isoler les cellules dissociées du fond du tube en suçant culot fond à l'aide d'une pipette.
- Re-suspendre cellules dissociées dans 3.2 ml de DPBS avec 0,02% d'albumine de sérum bovin et 1 mg / ml de DNase ou mises en mémoire tampon HEPES préférés milieux de culture. Passez à travers 40 um filtre avant FACS (figure 2A). Gardez cellules sur la glace jusqu'à ce que le tri.
- Effectuer FACS 28. </ li>
- Cellules de culot dans 1,5 ml tubes de centrifugation à 2000 g pendant 5 min à 4 ° C.
Remarque: Les astrocytes peuvent être utilisées sous forme de culot immédiatement ou conservés à -80 ° C jusqu'à l'extraction de l'ADN.
- Extrait ARN et l'ADN en utilisant la méthode d'isolement préféré 29 30. Évaluer l'ARN et de l'ADN et la concentration qualité via spectrophotomètre et bioanalyseur 31.
Remarque: Utilisez uniquement l'ARN de haute qualité et de l'ADN dans des étapes ultérieures, 260/280 = 2,0-2,2 et 1,8-1,9, respectivement. Bioanalyzer analyse est essentielle pour évaluer la dégradation des ARN ou fragmentation de l'ADN. ARN ou d'ADN peuvent être utilisées immédiatement ou stockées à -80 ° C ou -20 ° C, respectivement pour des études ultérieures.
2. Évaluer méthylation de l'ADN Statut d'un gène à l'aide sensible à la méthylation haute résolution Melt analyse (MS-AGRH)
- Entrez séquence de gène d'intérêt dans le logiciel de cartographie de méthylation en ligne préféré pour identifier les îlots CpG dans le gèned'intérêt 32.
- Conception des amorces contre converties au bisulfite de l'ADN 33 séquence et amplifient l'aide d'ADN polymerase préférée selon le protocole du fabricant. Vérifier la taille du produit amplifié par l'exécution d'un gel d'ADN agarose à 1% à 100 V pendant 45 min. Amorces de magasins à concentration stock de 20 pm à -20 ° C.
- Bisulfite convertir 500-1000 ng d'ADN de chaque échantillon et de l'ADN méthylé normes allant de 0-100% de ces mêmes espèces animales 34. Éluées des échantillons pour fournir une concentration de 20 ng / ul. Vérifiez la concentration de l'ADN converti au bisulfite via spectrophotomètre 31.
- Configuration 20 réactions pi pour l'amplification MS-GRH utilisant polymérase et des amorces d'ADN préférée à une concentration de 5 uM selon le Tableau 1 et 2. Exécuter tous les échantillons, y compris l'ADN et méthylés normes FACS, en trois exemplaires.
- Selon le logiciel d'analyse, définissez pré- et post démarrer et arrêter les paramètresautour des transitions de la courbe de fusion. Régler le début de pré-fusion et paramètres d'arrêt pré-fusion de sorte que la différence entre les deux est de 0,2 à 0,5 ° C. Set Start post-fusion et post-fusion arrêter similaire. Extraire des données de différence de température de pointe pour chaque échantillon.
- Utilisation de normes pour cent méthylés (valeur Y) et de leurs différences de température moyenne de crête correspondantes (x-valeur) générer une équation de régression linéaire (figure 3A-B, tableau 4.3). Utiliser cette équation de régression linéaire pour estimer l'état de méthylation des 35 échantillons inconnus.
3. Evaluation Hyper-méthylé activité promotrice par utilisation de Luciferase Assay
- Identifier les îlots CpG de gène cible (étape 2.1). Amplifier par PCR des régions d'intérêt 36 et clone en amont du Firefly gène rapporteur luciférase pour produire de luc2 plasmides CpG-île-luc2 37.
- Linéariser 30 ug de plasmide CpG-île-luc2 via restriction38 digestion enzymatique. Vérifiez les sites de digestion de restriction et éviter les coupures doubles en utilisant le logiciel de coupe préféré 38. Inactiver les enzymes à la chaleur à la température et la durée appropriée après digestion selon le protocole du fabricant. Une perte minimale de l'ADN se produit au cours de l'étape de linéarisation.
- Méthylations plasmides linéarisés en utilisant CpG méthylase (M.Sssl) O / N à 30 ° C non traitée ou laisser le protocole du fabricant de suite, sauf pour les ajustements suivants.
- Effectuer des réactions de 50 pi.
- Utilisez 5 unités de CpG méthylase de méthyler 700 ng de plasmide linéarisé.
- Exécutez réactions O / N pour 13-19 h.
- Après CpG réaction de méthylase, effectuer le nettoyage à l'aide d'ADN standard, disponibles dans le commerce membrane de gel de silice nettoyer kit selon le protocole du fabricant. Des pertes importantes de l'ADN se produisent suite à CpG réaction de méthylase, 30-60% de perte.
- Vérifiez la méthylation de plasmides via une restriction Hpa II Digest. Prendre 1 ug d'ADN méthylé ou non méthylé et digestion de restriction avec Hpa II pendant 1 heure à 37 ° C. Utilisez 5-10 unités de Hpa II pour chaque pg d'ADN. Après la digestion Hpa II, effectuer le nettoyage de l'ADN en utilisant une membrane disponible dans le commerce de gel de silice nettoyer kit préféré,. Exécuter deux plasmides méthylés et non méthylés CpG sur un gel d'agarose de l'ADN de 1% dans du tampon TAE ou TBE à 100 V pendant 45 min pour la visualisation (figure 4B).
- Plasmides Sujet fois méthylés et non méthylés à double digestion avec des enzymes de restriction appropriées pour libérer toute la longueur luc 2 (vecteur) et l'île de CpG (insert) 38 fragments. Effectuez double digestion O / N à la température appropriée et enzymes de chaleur inactiver après digestion selon le protocole du fabricant. Une perte minimale de la concentration de l'ADN se produit pendant deux digestion de restriction.
- Exécutez plasmides double digestion sur gel ADN agarose à 1% à 100 V pendant 1 heure pour permettre la séparation of vecteur et insérez (figure 4C). Attention. Le port de protection UV écran facial, placer le gel de l'ADN sur une lumière noire de table à visualiser les bandes. Basé sur la taille, l'accise insert méthylé et non méthylé et non méthylé vecteur en utilisant une lame chirurgicale propre.
- ADN extrait sur gel en utilisant du phénol saturé, pH 6,6. Brièvement, peser gel d'ADN contenant le vecteur ou insert. Utilisez 100 pi de phénol par 0,1 gramme de gel d'ADN. Homogénéiser gel de l'ADN dans le phénol utilisant dounce de verre homogénéisateur.
- Ajouter chloroforme (en utilisant 1/5 du volume de phénol) et agiter les échantillons pendant 20 sec. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 2-3 min. Centrifugeuse pendant 15 min à la vitesse max (16,1 x 1000 XG) à 4 ° C.
- Retirer solution aqueuse et ajouter le volume de 0,1X de 3 M d'acétate de sodium et le volume d'éthanol 2.5X. Incuber les échantillons pendant 1 heure à -80 ° C. Après l'incubation, éliminer l'éthanol et remettre en suspension l'ADN dans 30 ul de tampon préféré. Perte significative de l'ADN se produit l'isolement suivant des inserts et des vecteurs, 30-50% loss.
- Re-ligaturer inserts méthylés et non méthylés à vecteur non-méthylé en utilisant l'ADN ligase T4 38. Utiliser un rapport de 1: 4 de vecteur à insérer pour des réactions de ligature. Réaction de configuration selon les instructions du fabricant. Utiliser un volume total de 50 pi pour les réactions et incuber O / N à -20 ° C ou sur de la glace avec couvercle sur le seau à glace.
- Après la ligature, effectuez l'ADN en utilisant une membrane nettoyage disponible dans le commerce de gel de silice nettoyer kit préféré,. Perte significative de l'ADN se produisent après la réaction de ligature, environ une perte de l'ADN de 30-50%. Vérifier re-ligature en exécutant sur gel à 1% d'agarose de l'ADN à 100 V pendant 45 min et à évaluer la concentration de plasmides re-ligaturé (figure 4D).
- Transfecter des plasmides méthylés ou non méthylés dans des cellules D54 en utilisant un réactif de transfection du commerce, selon le protocole du fabricant. Cellules D54 de semences sur la plaque de 12 puits à 0,14 x 10 6 cellules / puits.
- Après 24 h, les cellules transfecter wides concentrations égales e de soit (1) plasmide non methyated CpG luc2 + Renilla ou un autre vecteur de contrôle de la luciférase ou (2) méthylé plasmide CpG luc2 + Renilla ou un autre vecteur de contrôle de la luciférase.
- Laisser les cellules pour la transfection pendant 24 heures avant d'effectuer des dosages de la luciférase double. Effectuer dosage selon les instructions du fabricant. Effectuer des relevés au moyen d'un luminomètre. Lire chaque puits en triple.
- Calculer le rapport de l'activité de la luciférase de luciole de Renilla ou une autre activité de la luciférase de contrôle. Normaliser Firefly méthylé: activité de la luciférase de commande Firefly non méthylé: activité de la luciférase de contrôle en divisant l'activité de la luciférase méthylé par l'activité de la luciférase non-méthylé
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Representative Results
Une population enrichie de astrocytes a été acquis par l'intermédiaire de tri FACS de eGFP-S100β animaux transgéniques 27. En raison de la diminution de la qualité cellules et des molécules moléculaires isolées chez les animaux âgés de plus de 50 jours après la naissance (p50), les animaux âgés de P0-P40 sont optimales pour de telles expériences. Tissu cortical a été utilisé pour ces expériences. Cortex de deux à six animaux ont été mis en commun. FACS a été effectuée à l'installation complète UAB cytométrie de flux de base. Tri a été réalisée sur Becton Dickinson FACSAria II. eGFP excitation a été obtenu en utilisant 488 nm laser; Aucune rémunération n'a été nécessaire. Une population fermée a été ciblé sur la base de l'avant et la dispersion latérale (figure 1B). Une population de cellules vivantes a été déterminée en utilisant un indicateur bromure d'éthidium de cellules mortes et fermé (figure 1C). Deux populations différentes ont été observées en fonction du profil eGFP (figure 1D). Grâce à des tests empiriques, la population de cellules avec eGFP supérieurLe profil a été identifié comme étant la population de cellules eGFP-positif (figure 1F-F ''). L'analyse visuelle de la seconde population avec un profil inférieur eGFP a révélé des fragments cellulaires exprimant eGFP, mais dépourvu de noyaux, ce qui représente probablement les débris de processus astrocytaires (Figure 1G-G ''). Des images représentatives d'astrocytes positifs suivants dissociation eGFP dissociées mais avant le tri (figure 2A) et après le tri (figure 2B) sont représentées. Isolé eGFP population de cellules positives a démontré une augmentation de 40 fois dans ALDH1L1 ARNm, un marqueur spécifique astrocytique 39 (figure 2C). En outre, en dépit de l'expression commune de S100β dans NG2 + OPC et les astrocytes 39, nous avons observé une réduction de 4 fois de NG2 ARNm, un marqueur pour des cellules précurseurs d'oligodendrocytes 39, ce qui indique l'isolement d'une population de cellules astrocytaires enrichi (Figure 2C-D). ARNet ADN isolé à partir des astrocytes ont été triées par FACS de qualité et en quantité suffisante pour être utilisée pour des études de méthylation subséquentes. L'ARN total et l'ADN isolé à partir de différents âges et nombre d'animaux est considéré comme une référence pour le rendement attendu de molécules moléculaires suivante FACS (tableau 5). Il convient de noter que le rendement varie également en fonction du nombre d'animaux utilisés, la période d'incubation, et l'expérience de chercheur. Le tableau 6 démontre la variabilité des événements acquis en fonction du nombre d'animaux utilisés et les périodes d'incubation.
Pour les études de méthylation, en commençant avec la qualité et des quantités suffisantes de l'ADN est essentielle pour les applications en aval succès. Pour assurer une lyse suffisante de tissu pour l'ARN ou l'extraction d'ADN, tous homogénéisation de tissu ou de cellules a été suivie par trituration en utilisant une aiguille de 23G 7x, en prenant soin d'éviter de moussage lors de la lyse. Une fois que l'ADN de haute qualité est extrait et converti au bisulfiteed, des régions d'intérêt peut être ciblé pour MS-AGRH. Notez que lors de l'évaluation qualité et la concentration de l'ADN converti au bisulfite, spectrophotomètre doit être réglé à lire à un facteur de DO de 33 que le bisulfite ADN converti est simple brin. Les valeurs 260/280 pour l'ADN converti au bisulfite variaient de 2,20 à 2,70.
Avant de commencer des études de méthylation, il est essentiel de choisir de manière appropriée et calibrer un cycleur thermique pour les études MS-HRMA. En outre, il faut déterminer comment exporter et d'utiliser les données brutes obtenues à partir de MS-AGRH. Applied Biosystems haute résolution fusion Guide de démarrage a été utilisé pour aider à calibrer le cycleur thermique 7900HT. Enfin, les données a été extrait et importé dans la GRH logiciel d'analyse pour une analyse ultérieure des données. Comme indiqué dans le protocole, pré et post démarrage et d'arrêt paramètres ont été définis près des transitions de la courbe de fusion. Les différences de température des pics ont été utilisées pour extrapoler état de méthylation de sa inconnuemples. Les données de méthylation estimés acquises à partir de MS-HRMA correspondaient étroitement aux données de méthylation générés par pyroséquençage (données de pyroséquençage a été généré dans la maison en utilisant des amorces ciblant les mêmes régions que les amorces MS-GRH) (figure 3C) 15.
Un dosage de la luciférase double a été utilisé pour évaluer l'activité transcriptionnelle des régions hyper-méthylés du gène d'intérêt (figure 4A). Chaque plasmide CpG-île-luc2 était linéarisé puis méthylé. Toutefois, en raison à la fois l'élément rapporté (d'îlot CpG) et le vecteur (luc2) sont méthylés au cours de la réaction, il faut exciser l'insert méthylée et re-ligation à un vecteur non-méthylé. En raison de la vaste manipulation de plasmide, se produisent des pertes importantes et doivent commencer par une matière de départ suffisante. Hpall digestion a été utilisée pour vérifier l'état de méthylation de chaque plasmide comme Hpall ne digère l'ADN non méthylé (figure 4B). Il devrait être noté quesi O / N méthylation est insuffisante, un 1x supplémentaire de SAM et 1x de CpG méthylase peuvent être ajoutés à la suite 1 h d'incubation à 30 ° C. Continuer O / N incubation après addition de SAM supplémentaire et CpG méthylase. Génération du plasmide méthylé et non méthylé CpG-île-luc2 permet une évaluation directe des changements entre la méthylation de l'ADN et l'activité transcriptionnelle par mesure de l'activité luciférase.
Figure 1. tri FACS isole eGFP + popoulation cellulaire. (A) l'utilisation d'un tube conique de 50 ml avec le trou découpé sur le dessus permet l'échange de gaz de surface lors de digestion à la papaïne. (B) Les cellules triées ont été bloqués sur la base de l'avant et de dispersion latérale parcelles. (C) Un indicateur de bromure d'éthidium à base de cellules mortes a été utilisée pour porte une population de cellules vivantes (rouge). (D) cel directl la population a démontré deux populations - une avec un profil de haute eGFP (vert) et un profil bas eGFP (violet). Pour tous les graphiques, l'axe y représente la zone de diffusion latérale (SSC-A); axe x représente l'avant zone de dispersion latérale (FSC-A), espace vert fluorescent protein (GFP-A), ou de bromure d'éthidium (BET). (EG) Les cellules dissociées ont été incubées avec Hoechst et 20 pi de cellules dissociées ont été placés sur la lamelle et imagés. (EE '') eGFP + astrocytes, avec procédés extensifs ont été visualisées avant le tri (NS). (FF '') Après le tri, haute eGFP + population (POS) démontrent eGFP + soma cellulaire qui a co-localiser avec coloration de Hoechst. (GG '') Faible population eGFP démontre eGFP + coloration qui n'a pas co-localiser avec coloration de Hoechst, représentant probablement des débris astrocytique (pour toutes les images, échelle = 20 um). S'il vous plaîtcliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. FACS de tri de eGFP-S100 ß animaux transgéniques fournit population enrichie des astrocytes. (A) 20 pi de cellules dissociées avant FACS (NS) sont présentés, les processus restent intacts (échelle = 50 um). (B) Représentant l'image post-FACS (FACS) cellules sont présentées; astrocytes sont enlevés et soma cellulaire reste (échelle = 20 um). Données (C) qPCR démontre une augmentation de 40 fois dans ALDH1L1 ARNm dans les cellules triées par FACS (FACS) par rapport à la population non triés (NS). (D) NG2 ARNm est réduite de 4 fois dans les cellules triées par FACS rapport à la population non triés (NS). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Les données d'échantillonnage et d'analyse pour les études MS-GRH. (A) Exemple de parcelles de différence de température générés à partir des normes de méthylation. Correspondant pour cent méthylation est marqué pour chaque courbe (B) de l'exemple équation de régression linéaire générée à partir de normes de rat méthylée. (C) Comparaison de la pour cent méthylation acquis de pyroséquençage (pyroseq, barres vertes) et MS-AGRH (barres grises) démontre des niveaux similaires de méthylation pour les régions variables de KCNJ10. Données de pyroséquençage générés en interne en utilisant des amorces ciblant les mêmes régions que MS-GRH analyse. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Double dosage de la luciférase permet l'évaluation de l'activité transcriptionnelle des régions de gènes méthylés différemment. (A) Schéma de la luciférase dosage de l'activité transcriptionnelle démontre flux de protocole. (B) gel de l'ADN méthylé affiche les différences en rapport plasmides non méthylés suivantes digestion HpaII. ADN non méthylé est facilement digéré après digestion HpaII par rapport à l'ADN méthylé, démontrant la méthylation de l'ADN plasmidique succès. (C) gel de l'ADN démontre la séparation du vecteur d'insertion suivante double digestion. Après la séparation de l'ADN, vecteur et l'insert sont gel extrait. (D) le gel de l'ADN démontre avec succès re-ligature du vecteur et de l'insert. Plasmide religaturé possède poids moléculaire similaire à celle plasmide non traitée (uNTx). NM, non-Methylated; M, méthyle; RL, re-ligaturé; uNTx, non traité. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| . | Volume (pi) | x3 + 10% d'excès | x Nombre d'échantillons |
| MeltDoc MM | 10 ul | 33 pi | |
| Primer 1 | 1,2 pl | 3,96 pi | |
| Primer 2 | 1,2 pl | 3,96 pi | |
| gDNA | 1 ul | --- | |
| dH 2 0 | 6,6 pl | 21,78 pi |
Tableau 1. Exemple de calcul de MeltDoctor Mastermix. Exécutez chaque rea MS-GRHction en triple avec 10% d'excès pour compenser les erreurs de pipetage. Dernière colonne indique le calcul nécessaire pour plusieurs numéros d'échantillons. Le volume total pour chaque réaction est de 20 pi.
| Cycle | Temp (° C) | Temps (s) | Taux de rampe (%) |
| 95 ° C | : 15 | 100 | |
| 40x | 95 ° C | : 15 | 100 |
| 60 ° C | : 60 | 100 | |
| Paramètres de fusion | 95 ° C | :10 | 100 |
| 60 ° C | : 60 | 100 | |
| 95 ° C | : 15 | 1 | |
| 60 ° C | : 15 | 100 | |
| Tenir | 4 76; C |
Tableau 2:. Protocole de l'échantillon pour dénaturer les échantillons amplification à 95 ° C pendant 10 min suivie de 40 cycles d'amplification et de génération de courbe de fusion. Paramètres de fusion sont répertoriés au sein de table. Remarque changement dans le taux de rampe qui permet l'acquisition de haute résolution la température de fusion.
| La méthylation pour cent (Rat standard) | Température maximale Différence |
| y | X |
| 0 | 5.670116 |
| 5 | 10,70448 |
| 10 | 15,5044 |
| 25 | 25,52295 |
| 50 | 34,43047 |
| 75 | 43,80894 |
| 100 | 53,88717 |
| Pic Temp Différence | Méthylation estimée |
| X | Y |
| L'échantillon 1 (n = 4) | |
| 47,450 | 81,115 |
| 46,292 | 78,657 |
| 41,694 | 68,894 |
| 47,292 | 80,779 |
| L'échantillon 2 (n = 4) | |
| 29,925 | 43,904 |
| 24,269 | 31,894 |
| 25,061 | 33,575 |
| 25,389 | 34,272 |
Tableau 4. Exemple de calcul pour cent environ méthylation. De différence de température de crête d'échantillons de l'état de méthylation inconnu est utilisé pour estimer la méthylation pour cent en utilisant une équation de régression linéaire. Les données représentatives de deux conditions différentes, les échantillons 1 et 2, sont présentés; n = 4 pour chaque condition.
| Age | Nombre d'animaux | L'ARN total (ng) | L'ADN total (ng) |
| p4-p10 | 3-6 | 455-868 | 265-1523 |
| p19-p22 | 1-2 | 220-680 | 583-1483 |
| p40-p50 | 3-4 | 198-260 | 578-1700 |
Tableau 5. Total ARN et l'ADN acquis de FACS cellules triées. L'âge et le nombre d'animaux utilisés dans FACS expériences sont répertoriés. Remarque, les deux corticales ont été utilisées pour chaque N. total ARN et l'ADN est répertorié comme une référence pour le rendement attendu.
| Age | Nombre d'animaux | Pos Evénements | Neg Evénements | Le temps d'incubation (à 37 ° C) |
| p26 | 1 | 2.18X10 ^ 6 | 1.15X10 ^ 6 | 20:00 min |
| p26 | 2 | 4.4X10 ^ 6 | 2.78X10 ^ 6 | 20:00 min |
| p26 | 2 | 9.2X10 ^ 6 | 3.3X10 ^ 6 | 30:00 min |
Tableau 6. Nombre d'événements acquis de FACS au jour postnatal 26. Au nombre de p26 de eGFP (+) des événements positifs et négatifs des événements varie en fonction du nombre d'animaux utilisés et la période d'incubation.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| Methyl Primer | Applied Biosystems | online | software to localize CpG Islands |
| EZ DNA methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Rat Premixed Calibration Standard | EpiGenDx | 80-8060R-Premix | |
| CpG Methylase (M.Sssl) | Zymo Research | E2010 | |
| QIAquick Gel Extraction | QIagen | 28704 | Used for gel extraction and DNA cleanup |
| Restriction enzymes | New England BioLabs | ||
| NEB cutter | New England BioLabs | online | verify restriction digest sites |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Luc2 vector, pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| renilla vector, pGL4.74 | Promega | E2241 | |
| TD-20/20 Luminometer | Turner Designs | ||
| Lipofectamine LTX and Plus Reagent | Life Technologies | A12621 | |
| Phenol, saturated pH 6.6/6.9 | Fisher Scientific | BP 17501-100 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer | ThermoScientific | ||
| MeltDoctor Master Mix | Life Technologies | 4415440 | |
| High Resolution Melt (HRM) Software v2.0 | Life Technologies | 4397808 | |
| AB SDS software v2.3 | Life Technologies | online | |
| AB High Resolution Melting Getting Started Guide | Life Technologies | online | |
| AB 7900HT Fast Real-Time System | Life Technologies |
References
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