Protocol
Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute. La cura e l'uso Comitato degli animali presso l'Università di Alabama a Birmingham ha approvato l'uso degli animali.
1. Ottenere RNA e DNA da un Arricchita astrocitica Popolazione utilizzando fluorescenti Cellulari Attivato Ordinamento (FACS) di astrociti da tutto il tessuto del cervello
- Animale sedate con CO 2 per 1 minuto e poi rapidamente decapitarlo. Sezionare cortecce come descritto in Albuquerque et al, 26.; non è necessario rimuovere meningi.
Nota: i ratti transgenici che esprimono eGFP sotto il S100β (un marcatore astrociti) promotore sono stati generati da Itakura et al 27 e utilizzati per FACS ordinamento degli astrociti.. - Preparare tutto omogenato cerebrale utilizzando un kit di dissociazione papaina in condizioni non sterili, secondo il protocollo del produttore. Calore disattivare papaina a 37 ° C a bagnomaria per 10 min. Nota:Soluzione papaina è fornito dal costruttore e contiene L-cisteina e EDTA (vedi Tabella dei Materiali).
- Tagliare o dremel un foro nella parte superiore di un tubo da 50 ml per permettere tubazione che trasporta il 95% O 2: 5% CO 2 da alimentare in una provetta conica chiusa (Figura 1A). Mettere cortecce sezionato in 10 millimetri piatto di coltura contenenti supporti dissociazione (MEM supplementato con 20 mM glucosio e la penicillina / streptomicina (500 U / ml) ed equilibrato al 95% O 2: 5% di CO 2) e utilizzare una lama di rasoio pulito per tritare il tessuto in 1 x 1 mm 2 pezzi.
- Tessuto Trasferimento con 10 ml Pipetman manuale a tubo da 50 ml contenente soluzione papaina. Lasciare tessuto di depositarsi fondo pipetta prima dello scarico per minimizzare la quantità di materiale di dissociazione riportati. Mantenere soluzione papaina equilibrati a 95% O 2: 5% CO 2 attraverso lo scambio di gas di superficie per la durata dell'incubazione. Non bolla papaina solution. Incubare il tessuto per 20 minuti a 37 ° C bagnomaria.
- Dopo l'incubazione in soluzione papaina, tessuto triturare 10 volte con una pipetta 10 ml di trasferimento a bassa velocità. Centrifugare sospensione cellulare nuvoloso a 1.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Equilibrare soluzione inibitore DNasi / albumina (fornito dal costruttore) attraverso lo scambio di gas superficiale e risospendere le cellule in pellet in 3 ml di soluzione inibitore / DNasi di albumina. Preparare commerciale gradiente di densità discontinuo seguendo le istruzioni del produttore.
- Spin gradiente di densità discontinuo a 1.000 xg per 6 min. Isolare le cellule dissociate dal fondo della provetta da succhiare pellet fondo con una pipetta.
- Risospendere le cellule dissociate in 2-3 ml di DPBS con 0,02% di albumina di siero bovino e 1 mg / ml DNasi o HEPES buffered preferiti coltura. Passare attraverso 40 micron filtro prima FACS (Figura 2A). Mantenere le cellule in ghiaccio fino a quando l'ordinamento.
- Eseguire FACS 28. </ li>
- Cellule pellet in 1,5 ml provette a 2000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
Nota: astrociti Il pellet possono essere utilizzati immediatamente o conservati in -80 ° C fino al momento dell'estrazione del DNA.
- Estratto RNA e DNA utilizzando il metodo preferito di isolamento 29 30. Valutare RNA e concentrazione del DNA e la qualità con spettrofotometro e bioanalizzatore 31.
Nota: Utilizzare solo RNA alta qualità e il DNA in fasi successive, 260/280 = 2,0-2,2 e 1,8-1,9, rispettivamente. Analisi Bioanalyzer è essenziale per valutare la degradazione dell'RNA o frammentazione del DNA. RNA o DNA possono essere utilizzati immediatamente o conservate in -80 ° C o -20 ° C, rispettivamente per gli studi successivi.
2. Valutare metilazione del DNA Stato di un gene mediante metilazione-sensibile ad alta risoluzione Melt Analysis (MS-HRMA)
- Inserisci sequenza del gene di interesse in preferito software di mappatura metilazione online per individuare eventuali isole CpG del genedi interessi 32.
- Primer design contro bisolfito convertiti sequenza di DNA 33 e amplificano con DNA polimerasi preferita secondo il protocollo del produttore. Verificare le dimensioni del prodotto amplificato mediante l'esecuzione di un gel di DNA agarosio 1% a 100 V per 45 minuti. Conservare primer a concentrazione magazzino di 20 micron di -20 ° C.
- Bisolfito convertire 500-1000 ng di DNA di ciascun campione e DNA metilato standard che vanno da 0-100% delle stesse specie animali 34. Campioni eluire per fornire una concentrazione di 20 ng / ml. Verificare la concentrazione di bisolfito di DNA convertito con spettrofotometro 31.
- Setup 20 reazioni microlitri per l'amplificazione di MS-HRM utilizzando DNA polimerasi preferito e primer a 5 micron di concentrazione in base alla tabella 1 e 2. Eseguire tutti i campioni, tra cui DNA e metilato standard FACS, in triplice copia.
- A seconda del software di analisi, impostare pre- e post-avviare e arrestare i parametriintorno alle transizioni della curva di fusione. Set inizio pre-fusione e parametri di stop pre-melt così la differenza tra i due è 0,2-0,5 ° C. Imposta l'inizio post-fusione e post-fusione fermare in modo simile. Estrarre i dati differenza di temperatura di picco per ogni campione.
- Utilizzando gli standard per cento metilati (y-valore) e le loro corrispondenti differenze di temperatura di picco medi (x valore) genera una equazione di regressione lineare (Figura 3A-B, Tabella 3-4). Utilizzare questa equazione di regressione lineare per stimare lo stato di metilazione di 35 campioni sconosciuti.
3. Valutare Hyper-metilato Promotore Attività via Uso di luciferasi Assay
- Identificare isole CpG del gene bersaglio (punto 2.1). PCR amplifica regioni di interesse 36 e clone monte della luc2 Firefly gene della luciferasi giornalista per la produzione di plasmidi CpG-isola-luc2 37.
- Linearizzare 30 microgrammi di plasmide CpG-isola-luc2 via restrizionedigestione enzimatica 38. Verificare i siti di restrizione digest e di evitare doppi tagli utilizzando il software di taglio preferito 38. Calore-inattivare enzimi a temperatura e durata adeguata seguenti digestione secondo il protocollo del produttore. Perdita minima di DNA si verifica durante la fase di linearizzazione.
- Metilato plasmidi linearizzati con CpG metilasi (M.Sssl) O / N a 30 ° C o lasciare non trattati protocollo seguente produttore tranne che per le seguenti regolazioni.
- Eseguire 50 reazioni microlitri.
- Utilizzare 5 unità di CpG metilasi per metilare 700 ng di plasmide linearizzato.
- Eseguire reazioni O / N per 13-19 ore.
- A seguito di CpG reazione metilasi, eseguire la pulitura del DNA utilizzando lo standard, disponibile in commercio membrana di gel di silice pulizia Kit secondo il protocollo del produttore. Perdite significative di DNA si verificano a seguito CpG reazione metilasi, perdita 30-60%.
- Verificare metilazione di plasmidi tramite una restrizione Hpa II digest. Prendere 1 mg di DNA metilato o non metilato e restrizione digerire con Hpa II per 1 ora a 37 ° C. Utilizzare 5-10 unità di Hpa II per ogni mg di DNA. A seguito di Hpa II digestione, eseguire la pulitura DNA usando preferita, membrana disponibile in commercio gel di silice ripulire kit. Eseguire entrambi plasmidi metilati e non metilati CpG su un gel di agarosio 1% DNA in tampone TAE o TBE a 100 V per 45 minuti per la visualizzazione (Figura 4B).
- Oggetto sia denaturato e non metilato plasmidi a doppia digestione con opportuni enzimi di restrizione per rilasciare full-length luc 2 (vettoriale) e l'isola CpG (inserto) frammenti 38. Eseguire doppio digestione O / N a temperatura adeguata e gli enzimi calore inattivare seguente digestione secondo il protocollo del produttore. Minima perdita di concentrazione di DNA avviene durante doppia restrizione digest.
- Eseguire plasmidi doppio digeriti su 1% gel di agarosio DNA a 100 V per 1 ora per permettere la separazione of vettore e inserire (Figura 4C). Attenzione. Indossando UV scudo protettivo faccia, mettere il gel del DNA su un tavolo nero luce di visualizzare bande. In base alle dimensioni, accise inserto metilato e non metilato e non metilato vettore con una lama chirurgica pulito.
- Gel estratto di DNA con fenolo saturo, pH 6,6. In breve, pesare gel DNA contenente vettoriale o inserto. Utilizzare 100 ml di fenolo per 0,1 grammi di gel DNA. Omogeneizzare gel DNA fenolo utilizzando Dounce vetro omogeneizzatore.
- Aggiungere cloroformio (con 1/5 del volume di fenolo) ed agitare i campioni per 20 sec. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 2-3 minuti. Centrifugare per 15 minuti a velocità massima (16,1 x 1.000 xg) a 4 ° C.
- Rimuovere la soluzione acquosa e 0,1 X. aggiungere volume di 3 M acetato di sodio e 2,5 volte il volume di etanolo. Incubare i campioni per 1 ora a -80 ° C. Dopo l'incubazione, rimuovere l'etanolo e risospendere il DNA in 30 microlitri di tampone preferito. Significativa perdita di DNA avviene seguenti isolamento di inserti e vettori, 30-50% loss.
- Re-legare inserti metilato e non metilato al vettore non metilato utilizzando T4 DNA ligasi 38. Utilizzare un rapporto 1: 4 di vettore da inserire per le reazioni legatura. Reazione di installazione in base alle istruzioni del produttore. Utilizzare un volume totale di 50 microlitri per le reazioni e incubare O / N a -20 ° C o su ghiaccio con coperchio sopra secchiello del ghiaccio.
- A seguito di legatura, eseguire la pulitura DNA usando preferita, membrana disponibile in commercio gel di silice ripulire kit. Significativa perdita di DNA si verificano a seguito di reazione legatura, un approssimativo perdita 30-50% del DNA. Verificare ri-legatura eseguendo il 1% gel di DNA agarosio a 100 V per 45 minuti e valutare la concentrazione di plasmidi ri-legatura (Figura 4D).
- Trasfettare plasmidi denaturato o non denaturato nelle cellule D54 con un reagente di trasfezione commerciale secondo il protocollo del produttore. Cellule D54 Seed sulla piastra 12 pozzetti alla 0,14 x 10 6 cellule / pozzetto.
- A seguito di 24 ore, le cellule trasfettare with concentrazioni uguali di entrambi (1) plasmide non methyated CpG luc2 + Renilla o un altro controllo luciferasi vettoriale o (2) metilata plasmide CpG luc2 + Renilla o un altro controllo luciferasi vettoriale.
- Consentono alle cellule per trasfettare per 24 ore prima di eseguire doppio test luciferasi. Eseguire test secondo le istruzioni del produttore. Eseguire le letture usando un luminometro. Leggere ogni bene in triplice copia.
- Calcolare il rapporto di attività luciferasi Firefly a Renilla o altre attività di controllo della luciferasi. Normalizzare metilato Firefly: attività luciferasi di controllo per non metilato Firefly: attività luciferasi controllo dividendo l'attività luciferasi metilato per attività luciferasi non denaturato
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Representative Results
Una popolazione arricchita di astrociti è stato acquisito tramite FACS ordinamento di eGFP-S100β animali transgenici 27. A causa della diminuzione della qualità delle cellule e molecole molecolari isolati da animali di età superiore a postnatale giorno 50 (p50), animali di età p0-P40 sono ottimali per tali esperimenti. Tessuto corticale è stato utilizzato per questi esperimenti. Cortecce da due a sei animali sono stati riuniti insieme. FACS è stata eseguita presso lo stabilimento UAB Comprehensive Citometria a flusso Core. Ordinamento è stato eseguito su Becton Dickinson FACSAria II. eGFP eccitazione è stata ottenuta utilizzando laser 488 nm; nessun risarcimento era necessario. Una popolazione gated stato preso di mira in base avanti e scatter laterale (Figura 1B). Una popolazione di cellule in tempo reale è stato determinato utilizzando un indicatore di cellule morte bromuro di etidio e gated (Figura 1C). Due diverse popolazioni sono stati osservati sulla base del profilo eGFP (Figura 1D). Attraverso test empirico, la popolazione di cellule con una maggiore eGFPprofilo è stata identificata come la popolazione cellulare eGFP-positivo (Figura 1F-F ''). Analisi visiva della seconda popolazione con un profilo più basso eGFP rivelato frammenti cellulari che esprimono eGFP, ma privo di nuclei, probabilmente rappresenta detriti dai processi astrocitari (Figura 1G-G ''). Immagini rappresentative della dissociate astrociti positivi eGFP seguenti dissociazione ma prima di smistamento (figura 2A) e dopo l'ordinamento (Figura 2B) sono presenti. Isolata eGFP popolazione cellulare positivo dimostrato un aumento di 40 volte in ALDH1L1 mRNA, un marker specifico astrocitica 39 (Figura 2C). Inoltre, nonostante espressione condivisa S100β in NG2 + OPC e astrociti 39, abbiamo osservato una riduzione di 4 volte di NG2 mRNA, un marker per le cellule progenitrici oligodendrociti 39, indicando isolamento di una popolazione di cellule astrociti arricchito (Figura 2C-D). RNAe DNA isolato da FACS ordinati astrociti erano di qualità e quantità sufficiente per essere utilizzato per successivi studi di metilazione. L'RNA totale e DNA isolato da varie età e il numero di animali è elencato come riferimento per rendimento atteso delle molecole molecolari seguenti FACS (Tabella 5). Va notato che la resa varierà anche in base al numero di animali utilizzati, periodo di incubazione, e l'esperienza del ricercatore. Tabella 6 mostra la variabilità di eventi rilevati secondo il numero di animali utilizzati e periodi di incubazione.
Per gli studi di metilazione, iniziando con l'alta qualità e quantità sufficienti di DNA è essenziale per applicazioni a valle di successo. Per garantire una sufficiente lisi di tessuto RNA o estrazione del DNA, tutte omogeneizzazione di tessuti o cellule è stata seguita da triturazione utilizzando un ago 23G 7x, avendo cura di evitare la formazione di schiuma durante la lisi. Una volta che il DNA di alta qualità viene estratto e convertito bisolfitoed, regioni di interesse può essere indirizzato per MS-HRMA. Si noti che, nel valutare la qualità e la concentrazione di bisolfito di DNA convertito, spettrofotometro deve essere impostato a leggere a un fattore di OD di 33 come bisolfito convertito DNA a singolo filamento. I valori di 260/280 per bisolfito convertito DNA variava 2,20-2,70.
Prima di iniziare gli studi di metilazione, è fondamentale per selezionare in modo appropriato e calibrare un termociclatore per gli studi di MS-HRMA. Inoltre, si deve determinare come esportare e utilizzare i dati grezzi generati da MS-HRMA. Applied Biosystems ad alta risoluzione di fusione Guida introduttiva è stata utilizzata per aiutare a calibrare il termociclatore 7900HT. Infine, i dati è stato estratto e importato in software di analisi delle risorse umane per la successiva analisi dei dati. Come specificato nel protocollo, la validità e avviamento postale e fermano i parametri sono stati fissati in prossimità dei passaggi della curva di fusione. Le differenze di temperatura di picco sono stati utilizzati per estrapolare stato di metilazione di sconosciuta samples. Dati di metilazione stimati acquisiti da MS-HRMA corrispondevano a stretto contatto per i dati generati dai metilazione pirosequenziamento (dati Pyrosequencing è stata generata in casa utilizzando primer di targeting stesse regioni come primer MS-HRM) (Figura 3C) 15.
Un test dual luciferasi è stato utilizzato per valutare l'attività trascrizionale delle regioni iper-metilato del gene di interesse (Figura 4A). Ogni plasmide CpG-isola-luc2 era linearizzato e poi metilato. Tuttavia, poiché sia l'inserto (isola CpG) e vettoriale (luc2) sono metilato durante la reazione, si deve asportare l'inserto metilato e ri-legare ad un vettore non metilato. Grazie alla vasta manipolazione del plasmide, si verificano perdite significative e uno devono iniziare con materiale di partenza sufficiente. HpaII digestione è stato utilizzato per verificare lo stato di metilazione di ciascun plasmide come HpaII digerisce solo DNA non-metilata (Figura 4B). Va notato chese O / N metilazione è insufficiente, un 1x addizionale di SAM e 1x di CpG metilasi possono essere aggiunti dopo 1 ora di incubazione a 30 ° C. Continua O / N incubazione dopo l'aggiunta di supplementi di SAM e CpG metilasi. Generazione di plasmide CpG-isola-luc2 metilato e non metilato consente per la valutazione diretta dei cambiamenti tra metilazione del DNA e l'attività trascrizionale mediante misurazione delle attività luciferasi.
Figura 1. FACS ordinamento isola popoulation cella eGFP +. (A) L'uso di un tubo da 50 ml con il foro tagliato sulla parte superiore permette lo scambio di gas superficie durante la papaina digestione. (B), le cellule sono state gated Ordinati in base a in avanti e scatter lato trame. (C) Un bromuro di etidio indicatore di cellule morte sulla base è stata utilizzata per porta una popolazione di cellule in tempo reale (in rosso). (D) Risultati in diretta cell popolazione ha dimostrato due popolazioni - uno con un alto profilo eGFP (verde) e un basso profilo eGFP (viola). Per tutti i grafici, asse y rappresenta un'area side scatter (SSC-A); asse x rappresenta forward zona scatter laterale (FSC-A), zona proteina fluorescente verde (GFP-A), o etidio bromuro (EtBr). (EG), le cellule dissociate sono state incubate con Hoechst e 20 ml di cellule dissociate è stata posta su vetrino e ripreso. (EE '') eGFP + astrociti, con processi estensivi sono stati visualizzati prima di smistamento (NS). (FF '') A seguito di smistamento, alta eGFP + popolazione (POS) dimostrano soma cella eGFP + che co-localizza con Hoechst colorazione. (GG '') della popolazione a basso eGFP dimostra eGFP + colorazione che non hanno collaborato localizza con Hoechst colorazione, probabilmente in rappresentanza detriti astrociti (per tutte le immagini, scala = 20 micron). Si prega diclicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. FACS smistamento di eGFP-S100 beta animali transgenici fornisce popolazione arricchita di astrociti. (A) sono riportati 20 microlitri di cellule dissociate prima FACS (NS), i processi rimangono intatte (scala = 50 micron). (B) Immagine rappresentativa post-FACS (FACS), le cellule sono mostrati; I processi astrocitari vengono rimosse e rimane soma cellulare (scala = 20 micron). Dati (C) qPCR dimostra a 40 volte maggiore ALDH1L1 mRNA in FACS allineati cellule (FACS) rispetto alla popolazione non ordinato (NS). (D) NG2 mRNA è ridotta di 4 volte in FACS ordinati cellule rispetto a popolazione non ordinato (NS). CLICCA QUI PER visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. I dati del campione e analisi per gli studi di MS-HRM. (A) Esempio di temperatura appezzamenti di differenza generata dagli standard di metilazione. Corrispondente per cento metilazione è etichettato per ciascuna curva (B) Esempio di equazione di regressione lineare generato dagli standard di ratto metilato. (C) Confronto tra la percentuale di metilazione acquisito da pirosequenziamento (pyroseq, barre verdi) e MS-HRMA (barre grigie) dimostra livelli simili di metilazione per variare le regioni di KCNJ10. Dati Pyrosequencing generati in casa utilizzando i primer di targeting stesse regioni come MS-HRM analisi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. dosaggio doppio luciferasi permette per la valutazione di attività trascrizionale di regioni geniche differenzialmente metilati. (A) Schema di luciferasi trascrizionale saggio di attività dimostra il flusso di lavoro di protocollo. Differenze visualizza (B) di gel di DNA in metilato rispetto plasmidi non metilato seguenti digestione HpaII. DNA non metilato è facilmente digeribile seguente digestione HpaII rispetto al DNA metilato, dimostrando di successo metilazione di DNA plasmidico. (C) gel DNA dimostra separazione del vettore da inserto seguente doppio digestione. Dopo la separazione del DNA, vettore e l'inserto sono gel estratto. (D) gel DNA dimostra successo ri-legatura del vettore e l'inserto. Plasmide Re-legatura possiede peso molecolare simile a quella plasmide non trattati (uNTx). NM, non ha incontratohylated; M, metilato; RL, ri-legatura; uNTx, non trattata. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| . | Volume (ml) | x3 + 10% in eccesso | x # di campioni |
| MeltDoc MM | 10 microlitri | 33 microlitri | |
| Primer 1 | 1.2 ml | 3.96 microlitri | |
| Primer 2 | 1.2 ml | 3.96 microlitri | |
| gDNA | 1 ml | --- | |
| DH 2 0 | 6.6 ml | 21.78 ml |
Tabella 1. Esempio di calcolo di MeltDoctor Mastermix. Eseguire ogni Rea MS-HRMction in triplice copia con il 10% in eccesso per compensare errori di pipettamento. Ultima colonna indica il calcolo necessario per più numeri di campioni. Il volume totale per ogni reazione è di 20 ml.
| Ciclo | Temp (° C) | Tempo (sec) | Velocità di rampa (%) |
| 95 ° C | : 15 | 100 | |
| 40x | 95 ° C | : 15 | 100 |
| 60 ° C | : 60 | 100 | |
| Parametri di fusione | 95 ° C | : 10 | 100 |
| 60 ° C | : 60 | 100 | |
| 95 ° C | : 15 | 1 | |
| 60 ° C | : 15 | 100 | |
| Tenere | 4 76; C |
Tabella 2:. Protocollo di esempio per l'amplificazione Denaturare i campioni a 95 ° C per 10 minuti seguiti da 40 cicli di amplificazione e generazione della curva di fusione. I parametri di fusione sono indicate in tabella. Nota variazione del tasso di rampa che permette l'acquisizione di alta temperatura di fusione risoluzione.
| Percentuale metilazione (Rat Standard) | Peak differenza di temperatura |
| y | X |
| 0 | 5.670116 |
| 5 | 10,70448 |
| 10 | 15,5044 |
| 25 | 25,52295 |
| 50 | 34,43047 |
| 75 | 43,80894 |
| 100 | 53,88717 |
| Peak Temp Differenza | Metilazione stimato |
| X | Y |
| Campione 1 (n = 4) | |
| 47,450 | 81,115 |
| 46,292 | 78,657 |
| 41,694 | 68,894 |
| 47,292 | 80,779 |
| Campione 2 (n = 4) | |
| 29,925 | 43,904 |
| 24,269 | 31,894 |
| 25,061 | 33,575 |
| 25,389 | 34,272 |
Tabella 4. Esempio di metilazione stimato calcolato cento. Differenza di temperatura di picco di campioni di stato di metilazione sconosciuto viene utilizzato per stimare cento metilazione utilizzando un'equazione di regressione lineare. Dati rappresentativi provenienti da due diverse condizioni, Campione 1 e Campione 2, vengono mostrati; n = 4 per ogni condizione.
| Età | Numero di animali | RNA totale (ng) | DNA totale (ng) |
| p4-p10 | 3-6 | 455-868 | 265-1523 |
| p19-p22 | 1-2 | 220-680 | 583-1483 |
| p40-p50 | 3-4 | 198-260 | 578-1700 |
Tabella 5. Totale RNA e DNA acquisito da FACS allineati cellule. L'età e il numero di animali utilizzati in FASono elencati esperimenti CS. Nota, entrambe le corticali sono stati utilizzati per ogni N. totale RNA e DNA è elencato come riferimento per il rendimento atteso.
| Età | Numero di animali | Pos Eventi | Neg Eventi | Il tempo di incubazione (a 37 ° C) |
| p26 | 1 | 2.18X10 ^ 6 | 1.15X10 ^ 6 | 20:00 min |
| p26 | 2 | 4.4X10 ^ 6 | 2.78X10 ^ 6 | 20:00 min |
| p26 | 2 | 9.2X10 ^ 6 | 3.3X10 ^ 6 | 30:00 min |
Tabella 6. Numero di eventi acquisiti da FACS al giorno postnatale 26. Al numero di p26 positivi (eGFP +) manifestazioni e gli eventi negativi varia a seconda del numero di animali utilizzati e periodo di incubazione.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| Methyl Primer | Applied Biosystems | online | software to localize CpG Islands |
| EZ DNA methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Rat Premixed Calibration Standard | EpiGenDx | 80-8060R-Premix | |
| CpG Methylase (M.Sssl) | Zymo Research | E2010 | |
| QIAquick Gel Extraction | QIagen | 28704 | Used for gel extraction and DNA cleanup |
| Restriction enzymes | New England BioLabs | ||
| NEB cutter | New England BioLabs | online | verify restriction digest sites |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Luc2 vector, pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| renilla vector, pGL4.74 | Promega | E2241 | |
| TD-20/20 Luminometer | Turner Designs | ||
| Lipofectamine LTX and Plus Reagent | Life Technologies | A12621 | |
| Phenol, saturated pH 6.6/6.9 | Fisher Scientific | BP 17501-100 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer | ThermoScientific | ||
| MeltDoctor Master Mix | Life Technologies | 4415440 | |
| High Resolution Melt (HRM) Software v2.0 | Life Technologies | 4397808 | |
| AB SDS software v2.3 | Life Technologies | online | |
| AB High Resolution Melting Getting Started Guide | Life Technologies | online | |
| AB 7900HT Fast Real-Time System | Life Technologies |
References
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16 (1), 6-21 (2002).
- Deaton, A. M., Bird, A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25, 1010-1022 (2011).
- Lorincz, M. C., Dickerson, D. R., Schmitt, M. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells. Nat Struct. Mol Biol. 11 (11), 1068-1075 (2004).
- Moore, L. D., Le, T. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacol. 38, 23-38 (2013).
- Santos, K. F., Mazzola, T. N. The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Braz.J.Med.Biol.Res. 38 (10), 1531-1541 (2005).
- Day, J. J., Sweatt, J. D. Cognitive neuroepigenetics: a role for epigenetic mechanisms in learning and memory. Neurobiol. Learn.Mem. 96, 2-12 (2011).
- Denk, F., McMahon, S. B. Chronic pain: emerging evidence for the involvement of epigenetics. Neuron. 73, 435-444 (2012).
- Endres, M., et al. DNA methyltransferase contributes to delayed ischemic brain injury. J. Neuroscience. 20 (9), 3175-3181 (2000).
- Qureshi, I. A., Mehler, M. F. Emerging role of epigenetics in stroke: part 1: DNA methylation and chromatin modifications. Arch.Neurol. 67, 1316-1322 (2010).
- Tian, R., et al. disease mutant glial fibrillary acidic protein compromises glutamate transport in astrocytes. J Neuropathol. Exp Neurol. 69, 335-345 (2010).
- Perisic, T., Holsboer, F., Rein, T. The CpG island shore of the GLT-1 gene acts as a methylation-sensitive enhancer. Glia. 60 (9), 1345-1355 (2012).
- Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
- Poopalasundaram, S., et al. Glial heterogeneity in expression of the inwardly rectifying K+ channel, Kir4.1, in adult rat CNS. Glia. 30, 362-372 (2000).
- Hibino, H., Fujita, A., Iwai, K., Yamada, M. Differential assembly of inwardly rectifying K+ channel subunits. Kir4.1 and Kir5.1, in brain astrocytes. 279, 44065-44073 (2004).
- Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
- Li, L., Head, V. Identification of an inward rectifier potassium channel gene expressed in mouse cortical astrocytes. Glia. 33, 57-71 (2001).
- Kucheryavykh, Y. V., et al. Downregulation of Kir4.1 inward rectifying potassium channel subunits by RNAi impairs potassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes. Glia. 55 (3), 274-281 (2007).
- Djukic, B., Casper, K. B., Philpot, B. D., Chin, L. S. Conditional knock-out of Kir4.1 leads to glial membrane depolarization, inhibition of potassium and glutamate uptake, and enhanced short-term synaptic potentiation. J. Neuroscience. 27, 11354-11365 (2007).
- Fujita, A., et al. Clustering of Kir4.1 at specialized compartments of the lateral membrane in ependymal cells of rat brain. Cell Tissue Res. 359 (2), 627-634 (2015).
- MacFarlane, S. N., Sontheimer, H. Electrophysiological changes that accompany reactive gliosis in vitro. J Neuroscience. 17 (19), 7316-7329 (1997).
- Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R. Impaired K(+) homeostasis and altered electrophysiological properties of post-traumatic hippocampal glia. J. Neuroscience. 19 (18), 8152-8162 (1999).
- Anderova, M., et al. Voltage-dependent potassium currents in hypertrophied rat astrocytes after a cortical stab wound. Glia. 48 (4), 311-326 (2004).
- Olsen, M. L., Campbell, S. C., McFerrin, M. B., Floyd, C. L. Spinal cord injury causes a wide-spread, persistent loss of Kir4.1 and glutamate transporter 1: benefit of 17 beta-oestradiol treatment. Brain. 133, 1013-1025 (2010).
- Koller, H., Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Time course of inwardly rectifying K(+) current reduction in glial cells surrounding ischemic brain lesions. Brain Res. 872, 1-2 (2000).
- Bordey, A., Lyons, S. A., Hablitz, J. J. Electrophysiological characteristics of reactive astrocytes in experimental cortical dysplasia. J Neurophysiol. 85 (4), 1719-1731 (2001).
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P. plating, and maintenance of cortical astrocyte cultures. 8, Cold Spring. 10-1101 (2009).
- Itakura, E., et al. Generation of transgenic rats expressing green fluorescent protein in S-100beta-producing pituitary folliculo-stellate cells and brain astrocytes. Endocrinology. 148, 1518-1523 (2007).
- Foo, L. C. Purification of astrocytes from transgenic rodents by fluorescence-activated cell sorting. Cold Spring Harb.Protoc. 2013, 551-560 (2013).
- Smith, C., Otto, P., Bitner, R. A silica membrane-based method for the isolation of genomic DNA from tissues and cultured cells. CSH. Protoc. 2006, 2006-201 (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. A Single-step Method for the Simultaneous Preparation. of DNA, RNA, and Protein from Cells and. 1, 2006-201 (2006).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K. Quantitation of DNA and. , (2007).
- Zhao, Z., Han, L. CpG islands: algorithms and applications in methylation studies. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 643-645 (2009).
- Srivastava, G. P., Guo, J., Shi, H. PRIMEGENS-v2: genome-wide primer design for analyzing DNA methylation patterns of CpG islands. Bioinformatics. 24, 1837-1842 (2008).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J.Vis.Exp.(56), doi:3170 [pii];10.3791/3170. , (2011).
- Drummond, G. B., Vowler, S. L. Categorized or continuous? Strength of an association-and linear regression. Adv.Physiol Educ. 36, 89-92 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. The basic polymerase chain reaction. CSH.Protoc. 1, (2006).
- Arpa, P. Strategies for cloning PCR products. Cold Spring Harb.Protoc. 8, (2009).
- Makovets, S. Basic DNA electrophoresis in molecular cloning: a comprehensive guide for beginners. Methods Mol.Biol. 1054, 11-43 (2013).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neuroscience. 28, 264-278 (2008).
- Maldonado, P. P., Velez-Fort, M., Levavasseur, F. Oligodendrocyte precursor cells are accurate sensors of local K+ in mature gray matter. J Neuroscience. 33, 2432-2442 (2013).
- Kalsi, A. S., Greenwood, K., Wilkin, G. Kir4.1 expression by astrocytes and oligodendrocytes in CNS white matter: a developmental study in the rat optic nerve. J.Anat. 204, 475-485 (2004).
- Higashi, K., et al. An inwardly rectifying K(+) channel, Kir4.1, expressed in astrocytes surrounds synapses and blood vessels in brain. Am.J.Physiol Cell Physiol. 281 (3), (2001).
- Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
- Neusch, C., Rozengurt, N., Jacobs, R. E., Lester, H. A. Kir4.1 Potassium Channel Subunit Is Crucial for Oligodendrocyte Development and In Vivo Myelination. J. Neuroscience. 21 (15), 5429-5438 (2001).
- Kofuji, P., et al. Genetic Inactivation of an Inwardly Rectifying Potassium Channel (Kir4.1 Subunit) in Mice: Phenotypic Impact in Retina. J. Neuroscience. 20 (15), 5733-5740 (2000).
- Kofuji, P., Connors, N. C. Molecular substrates of potassium spatial buffering in glial cells. Mol.Neurobiol. 28, 195-208 (2003).
- Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
- Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high-resolution melting. Nat.Protoc. 3, 1903-1908 (2008).
- Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res. 35, 10-1093 (2007).
- Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nat.Rev.Genet. 11, 191-203 (2010).
