Protocol
Todos os animais foram tratados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde orientações. O tratamento ea utilização Comitê Animal da Universidade de Alabama em Birmingham aprovou o uso animal.
1. A obtenção de RNA e DNA a partir de uma Enriched astrocítica População usando fluorescente de células activadas (FACS) de astrócitos partir de tecido cerebral Whole
- Sedar animais com CO 2 durante 1 min e, em seguida, rapidamente decapitar. Dissecar córtices como descrito em Albuquerque et ai, 26.; não é necessário para remover das meninges.
Nota: Ratos transgênicos expressando eGFP sob a S100β (um marcador de astrócitos) promotor foram gerados por Itakura et al 27 e utilizado para triagem de FACS astrócitos.. - Prepare homogenato de cérebro total utilizando um kit de dissociação de papaína em condições não-estéreis de acordo com o protocolo do fabricante. Calor-activar a papaina, a 37 ° C em banho-maria durante 10 min. Nota:Solução de papaína é fornecido pelo fabricante e contém L-cisteína e EDTA (Ver Tabela de Materiais).
- Cortar ou dremel um furo no topo de um tubo de 50 ml para tubos de permitir transportar 95% de O2: 5% de CO 2 a ser alimentado a um tubo cónico fechado (Figura 1A). Coloque córtices dissecadas em 10 milímetros placa de cultura contendo meio de dissociação (MEM suplementado com glucose 20 mM e penicilina / estreptomicina (500 U / ml) e equilibrou-se a 95% de O2: 5% de CO 2) e utilizar uma lâmina de barbear limpa para tecido triturado em 1 x 1 mm 2 peças.
- Tecido de transferência usando 10 ml PIPETMAN manual para tubo de 50 ml contendo solução de papaína. Permitir que o tecido para resolver a parte inferior da pipeta de transferência antes da descarga para minimizar a quantidade de mídia dissociação transitadas. Manter solução de papaína equilibrada a 95% de O2: 5% de CO 2 por meio de intercâmbio de gás de superfície para a duração da incubação. Não bolha papaína solutiligar. Incubar o tecido durante 20 minutos em 37 ° C num banho de água.
- A seguir à incubação em solução de papaína, o tecido triturado 10 vezes com uma pipeta de 10 ml de transferência a uma velocidade lenta. Centrifugar a suspensão de células a 1000 x g turva durante 5 min à TA.
- Equilibrar soluo do inibidor de ADNase / albumina (fornecido pelo fabricante), através de intercâmbio de gás superficial e re-suspender as células precipitadas em 3 ml de solução / inibidor de albumina de ADNase. Prepare gradiente de densidade descontínua comercial seguindo as instruções do fabricante.
- Gire gradiente de densidade descontínua em 1000 xg durante 6 min. Isolar as células dissociadas a partir do fundo do tubo por sucção sedimento de fundo, utilizando uma pipeta.
- Re-suspender as células dissociadas em 2-3 ml de DPBS com 0,02% de albumina de soro bovino e 1 mg / ml de DNase ou tamponadas de HEPES preferidos meios de cultura. Passe por 40 um filtro antes de FACS (Figura 2A). Manter as células no gelo até a classificação.
- Execute FACS 28. </ li>
- Células sedimento em 1,5 ml de tubos de centrífuga a 2000 xg durante 5 min a 4 ° C.
Nota: astrócitos sedimentado pode ser utilizada imediatamente ou mantidas em -80 ° C até à extracção do ADN.
- Extrair RNA e DNA usando o método de isolamento preferido 29 30. Avaliar RNA e DNA e qualidade através de espectrofotómetro e 31 Bioanalyzer.
Nota: Utilize apenas RNA de alta qualidade e DNA em passos subsequentes, 260/280 = 2,0-2,2 e 1,8-1,9, respectivamente. Análise Bioanalyzer é essencial para avaliar a degradação do RNA ou a fragmentação do DNA. ARN ou ADN pode ser utilizado imediatamente ou armazenado em -80 ° C ou -20 ° C, respectivamente, para os estudos subsequentes.
2. Avaliar DNA metilação status de um Gene usando metilação-sensível de alta resolução Melt Análise (MS-HRMA)
- Digite sequência do gene de interesse em software de mapeamento on-line preferido de metilação para identificar quaisquer ilhas CpG em genede interesse 32.
- Iniciadores design contra bissulfito convertido sequência de ADN 33 e amplificar utilizando polimerase de ADN preferida de acordo com o protocolo do fabricante. Verificar o tamanho do produto amplificado, executando um gel de agarose a 1% de ADN a 100 V durante 45 min. Loja primers na concentração estoque de 20 mM em -20 ° C.
- Bissulfito converter 500-1000 ng de ADN de cada amostra e padrões de ADN metilado que variam de 0-100% em relação à mesma espécie animal 34. Elui-se amostras para proporcionar uma concentração de 20 ng / ul. Verificar a concentração de ADN convertido por meio de bisulfito espectrofotómetro 31.
- 20 ul de configuração para reacções de amplificação MS-HRM utilizando polimerase de ADN preferida e iniciadores na concentração de 5 ^ M de acordo com a Tabela 1 e 2. Executar todas as amostras, incluindo os padrões de ADN metiladas e FACS, em triplicado.
- Dependendo de software de análise, definir pré e pós iniciar e parar parâmetrosem torno das transições da curva de fusão. Set começar a pré-melt e os parâmetros de paragem pré-fusão assim que a diferença entre os dois é 0,2-0,5 ° C. Definir início de pós-fusão e pós-melt parar de forma semelhante. Extrair dados de diferença de temperatura de pico para cada amostra.
- Utilizar percentagem normas metilados (valor-y) e seus correspondentes diferenças médias de temperatura de pico (valor-x) gerar uma equação de regressão linear (Figura 3A-B, Tabela 3-4). Use esta equação de regressão linear para estimar estado de metilação de amostras desconhecidas 35.
3. Avaliação Hyper-metilado Promotor Atividade via uso de ensaio de luciferase
- Identificar ilhas CpG do gene alvo (Passo 2.1). PCR amplificar regiões de interesse 36 e clone a montante do Firefly gene repórter de luciferase luc2 para produzir plasmídeos CpG-island-luc2 37.
- Linearizar 30 ug do plasmídeo CpG-island-luc2 via restriçãodigestão enzimática 38. Verifique sites para digestão de restrição e evitar cortes de casal usando software cortador de 38 preferida. Calor-inactivar enzimas, à temperatura e duração apropriada, após digestão de acordo com o protocolo do fabricante. Perda mínima de ADN ocorre durante a etapa de linearização.
- Metilato de plasmídeos linearizados utilizando CpG metilase (M.Sssl) O / N a 30 ° C ou deixam protocolo fabricante seguinte sem tratamento, exceto para os seguintes ajustes.
- Realizar 50 reações ul.
- Use 5 unidades de CpG metilase para metilar 700 ng do plasmídeo linearizado.
- Execute reações O / N para 13-19 h.
- Após reacção CpG metilase, executar a limpeza do DNA usando o padrão, comercialmente membrana de gel de sílica disponíveis limpar kit de acordo com o protocolo do fabricante. Perdas significativas de DNA ocorrem após reação metilase CpG, perda de 30-60%.
- Verificar a metilação dos plasmídeos através de uma digestão de restrição Hpall. Tomar 1 ug de ADN metilado ou não metilado e digestão de restrição com Hpa II durante 1 hora a 37 ° C. Use 5-10 unidades de Hpa II para cada ug de ADN. Após a digestão Hpa II, executar a limpeza DNA usando membrana comercialmente disponível sílica-gel limpar kit preferido,. Executar tanto CpG metilados plasmídeos e não metilados no ADN de um gel de agarose a 1% em tampão TAE ou TBE a 100 V durante 45 min para visualização (figura 4B).
- Plasmídeos Assunto tanto metilados e não metilados a dupla digestão com enzimas de restrição apropriadas para liberar full-length luc 2 (vector) e ilha CpG (insert) fragmenta 38. Execute dupla digestão O / N à temperatura adequada e enzimas inatividade ao calor após digestão de acordo com o protocolo do fabricante. Perda mínima de concentração de DNA ocorre durante a restrição dupla digestão.
- Executar plasmídeos duplamente digerido em gel de agarose a 1% de ADN a 100 V durante 1 h para permitir a separação óF vector e inserção (Figura 4C). Cuidado. Vestindo protetor rosto protetor UV, coloque gel DNA em uma luz negra tabletop para visualizar bandas. Com base no tamanho, consumo de inserção metilado e não metilado e não metilado vector utilizando uma lâmina cirúrgica limpo.
- Extracto de gel de ADN utilizando fenol saturado, pH 6,6. Resumidamente, pesar de gel contendo o vector de ADN ou de inserção. Use 100 ul de fenol por 0,1 grama de gel de ADN. Homogeneizar em gel de ADN de fenol Dounce de vidro usando homogeneizador.
- Adicionar clorofórmio (utilizando 1/5 do volume de fenol) e agitar amostras por 20 s. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 2-3 minutos. Centrifugar durante 15 minutos à velocidade máxima (16,1 x 1000 x g) a 4 ° C.
- Remover solução aquosa e adicionar o volume de 0,1X de 3 M de acetato de sódio e o volume de 2,5X de etanol. Incubar as amostras durante 1 hora a -80 ° C. Após a incubação, remover o etanol e re-suspender o ADN em 30 ul de tampão preferido. Perda significativa de DNA ocorre isolamento seguimento de inserções e vetores, 30-50% loss.
- Re-ligar inserções metilados e não metilados para não metilado vector utilizando DNA ligase T4 38. Usar uma proporção de 1: 4 de vector para inserir para reacções de ligação. Reação de configuração de acordo com as instruções do fabricante. Utilizar um volume total de 50 ul por reacções e incubar O / N à temperatura de -20 ° C ou sobre gelo com a tampa sobre o balde de gelo.
- Após a ligação, executar a limpeza DNA usando membrana comercialmente disponível sílica-gel limpar kit preferido,. Uma perda significativa de ADN ocorrem após reacção de ligação, uma perda de aproximadamente 30-50% do DNA. Verifique re-ligação, executando em 1% de gel de agarose de ADN a 100 V durante 45 min e avaliar a concentração de plasmídeos re-ligado (Figura 4D).
- Transfectar plasmídeos metilados ou não metilados nas células D54 usando um reagente de transfecção comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Células D54 sementes Onto de 12 poços na placa de 0,14 x 10 6 células / poço.
- Na sequência de 24 horas, as células transf with concentrações iguais de ambos (1) plasmídeo não methyated CpG-luc2 + Renilla ou outro vector controle luciferase ou (2) metilado plasmídeo CpG-luc2 + Renilla ou outro vector controle luciferase.
- Permitir que as células transf durante 24 horas antes de realizar ensaio de luciferase duplo. Realizar ensaio de acordo com as instruções do fabricante. Realizar as leituras utilizando um luminómetro. Leia cada poço em triplicado.
- Calcular a relação da actividade da luciferase do pirilampo ou de Renilla para outra actividade de luciferase de controlo. Normalizar Firefly metilado: atividade luciferase controle para Firefly não metilado: atividade luciferase controle dividindo atividade luciferase metilado pela atividade luciferase não metilado
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Representative Results
Uma população enriquecida dos astrócitos foi adquirida via FACS classificação de eGFP-S100β animais transgênicos 27. Devido à diminuição da qualidade das células e moléculas moleculares isoladas de animais com idade superior a 50 dias pós-parto (p50), animais com idade p0-p40 são ideais para tais experimentos. Tecido cortical foi usada para estas experiências. Córtices de dois a seis animais foram reunidas. FACS foi realizada nas instalações UAB Comprehensive Citometria de Fluxo Core. Triagem foi realizada em Becton Dickinson FACSAria II. eGFP excitação foi obtido utilizando o laser de 488 nm; nenhuma compensação era necessária. Uma população alvo foi fechado com base na dispersão frontal e lateral (Figura 1B). Uma população de células vivas foi determinada utilizando um indicador de brometo de etidio de células mortas e fechado (Figura 1C). Duas populações diferentes foram observados com base no perfil eGFP (Figura 1D). Por meio de testes empíricos, a população de células com maior eGFPperfil foi identificado como a população de células-eGFP positivas (Figura 1F-f ''). A análise visual da segunda população com um perfil mais baixo eGFP revelou fragmentos celulares que expressam eGFP, mas desprovido de núcleos, provavelmente representando detritos de processos astrocíticos (Figura 1G-G ''). Imagens representativas de astrócitos positivos dissociados eGFP seguintes dissociação, mas antes da triagem (Figura 2A) e, após separação (Figura 2B) são mostrados. População de células positiva eGFP isolado demonstrou um aumento de 40 vezes na ALDH1L1 ARNm, um marcador específico astrocíticos 39 (Figura 2C). Além disso, apesar da expressão partilhada S100β em NG2 + OPCs astrócitos e 39, observou-se uma redução de 4 vezes de ARNm NG2, um marcador para as células precursoras de oligodendrócitos 39, indicando o isolamento de uma população de células de astrócitos enriquecido (Figura 2C-D). RNAe ADN isolado a partir de astrócitos foram separadas por FACS de qualidade e em quantidade suficiente para ser utilizado para estudos subsequentes de metilação. RNA total e DNA isolado a partir de diferentes idades e número de animais é listada como uma referência para o rendimento esperado de moléculas molecular seguinte FACS (Tabela 5). Deve notar-se que o rendimento também irá variar com base no número de animais utilizados, período de incubação, e a experiência do investigador. A Tabela 6 demonstra a variabilidade de eventos adquirida dependendo do número de animais utilizados e os períodos de incubação.
Para os estudos de metilação, começando com alta qualidade e quantidades suficientes de ADN é essencial para aplicações a jusante bem sucedidas. A fim de assegurar a lise de tecido suficiente para o RNA ou extracção de ADN, todos homogeneização do tecido ou células foi seguido por trituração com uma agulha de 23G 7x, tendo o cuidado de evitar a formação de espuma durante a lise. Uma vez que o DNA de alta qualidade é extraído e convertido bissulfitoed, regiões de interesse podem ser direcionados para MS-HRMA. Observe que, quando a avaliação da qualidade e concentração de DNA convertido bissulfito, espectrofotômetro deve ser definido para ler em um fator de 33 OD como bissulfito convertido DNA é de cadeia simples. Os valores para 260/280 ADN convertido com bissulfito variou de 2.20-2.70.
Antes de iniciar estudos de metilação, é fundamental para selecionar adequadamente e calibrar um termociclador para estudos MS-HRMA. Além disso, deve-se determinar como exportar e utilizar os dados brutos gerados a partir do MS-HRMA. Applied Biosystems alta resolução fusão Guia de Introdução foi utilizado para auxiliar na calibração do termociclador 7900HT. Finalmente, os dados foi extraído e importado para o software de análise de gestão de recursos humanos para posterior análise de dados. Conforme detalhado no protocolo, pré e pós partida e parada parâmetros foram situado perto as transições da curva de fusão. Diferenças de temperatura de pico foram usadas para extrapolar estado de metilação de sa desconhecidomples. Dados de metilação estimado adquiridos a partir do MS-HRMA correspondiam estreitamente com os dados gerados a partir de metilação pirossequenciao (dados pyrosequencing foi gerado em casa utilizando iniciadores dirigidos mesmas regiões como iniciadores MS-HRM) (Figura 3C) 15.
Um ensaio da luciferase dupla foi utilizado para avaliar a actividade de transcrição das regiões hiper-metilada do gene de interesse (Figura 4A). Cada plasmídeo CpG-island-luc2 foi linearizado e depois metilado. No entanto, dado que tanto o inserto (ilha CpG) e vector (luc2) são metilado durante a reacção, deve-se excisar o inserto metilado e re-ligar-se a um vector não metilado. Devido à extensa manipulação do plasmídeo, ocorrem perdas significativas e tem de começar com um material de partida suficiente. Digestão Hpall foi utilizada para verificar o estado de metilação de cada plasmídeo como Hpall única digere ADN não metilado (Figura 4B). Deve notar-se quese S / N metilação é insuficiente, uma 1x adicional de SAM e 1x de CpG metilase pode ser adicionado a seguir 1 hr de incubação a 30 ° C. Continue S / N de incubação a seguir à adição de suplemento de SAM e CpG metilase. Geração de plasmídeo-CpG-ilha luc2 metilado e não metilado permite a avaliação direta de mudanças entre a metilação do DNA e atividade transcricional através da medição da actividade da luciferase.
Figura 1. FACS classificação isola popoulation células eGFP +. (A) A utilização de um tubo de 50 ml com furo cortado na parte superior permite a troca gasosa superfície durante a digestão com papaína. (B) As células seleccionadas foram fechado com base na dispersão frontal e lateral parcelas. (C) um brometo de etídio indicador de células mortas com base foi utilizada para a porta uma população de células vivas (vermelho). (D) cel vivol população demonstrou duas populações - um com um perfil de alto eGFP (verde) e um perfil baixo eGFP (roxo). Para todos os gráficos, o eixo dos y representa a área de dispersão lateral (SSC-A); eixo x representa a área em frente dispersão lateral (FSC-A), área proteína verde fluorescente (GFP-A), ou brometo de etídio (EtBr). (EG) As células dissociadas foram incubadas com Hoechst e 20 l de células dissociadas foi colocado na lamela e fotografada. (EE '') eGFP + astrócitos, com processos extensivos foram visualizados antes da classificação (NS). (FF '') Após a triagem, alta eGFP + população (POS) demonstram soma de células eGFP + que co-localizar com coloração Hoechst. (GG '') população de baixa eGFP demonstra eGFP + coloração que não co-localizar com coloração Hoechst, provavelmente representando detritos astrocytic (para todas as imagens, escala = 20 mm). Por favor,clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. separação por FACS de beta animais transgénicos eGFP-S100 fornece população enriquecida de astrócitos. (A) 20 jil de células dissociadas antes de FACS (NE) são mostrados, os processos permanecem intactos (escala = 50 uM). (B) Imagem representativa de pós-FACS células (FACS) são mostrados; processos astrocíticos são removidos e restos soma célula (escala = 20 mm). De dados (C) qPCR demonstra um aumento de 40 vezes na ALDH1L1 ARNm em células separadas por FACS (FACS) em comparação com a população não classificados (NS). (D) NG2 mRNA é reduzida em 4 vezes no separadas por FACS células comparado a população não classificadas (NS). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Os dados da amostra e análise de estudos MS-HRM. (A) Exemplo de diferença parcelas de temperatura gerados a partir de padrões de metilação. Correspondendo cento metilação é rotulada para cada curva (B) Exemplo de equação de regressão linear gerada a partir de padrões de rato metilado. (C) Comparação entre o percentual de metilação adquiridos a partir pyrosequencing (pyroseq, barras verdes) e MS-HRMA (barras cinza) demonstra níveis semelhantes de metilação para diferentes regiões de KCNJ10. Dados pyrosequencing gerados em casa, utilizando os iniciadores de segmentação mesmas regiões como MS-HRM análise. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. ensaio de luciferase duplo permite a avaliação da atividade transcricional de genes diferencialmente metilados regiões. (A) Diagrama de ensaio de atividade transcricional luciferase demonstra fluxo de trabalho de protocolo. (B) de gel de DNA mostrando as diferenças em metilado versus plasmídeos não metilados após digestão Hpall. ADN não metilado é facilmente digerido Hpall após digestão em relação ao ADN metilado, o que demonstra bem sucedida metilação de DNA do plasmídeo. (C) gel de DNA demonstra separação de vector de inserção seguinte dupla digestão. Após a separação de DNA, vector e inserção de gel são extraídos. (D) de gel de DNA demonstra bem sucedido re-ligação do vector e inserção. Plasmídeo re-ligado possui peso molecular semelhante ao plasmídeo não tratada (untx). NM, não-atendidashylated; H, metilado; RL, re-ligado; untx, não tratada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| . | Volume (uL) | x3 + 10% de excesso | x # de amostras |
| MeltDoc MM | 10 ul | 33 ul | |
| Iniciador 1 | 1,2 ul | 3,96 ul | |
| Iniciador 2 | 1,2 ul | 3,96 ul | |
| gDNA | 1 ul | --- | |
| dH 2 0 | 6.6 ul | 21.78 ul |
Tabela 1. Exemplo de cálculo de MeltDoctor Mastermix. Execute cada rea MS-HRMMedidas em triplicado com 10% de excesso para compensar erros de pipetagem. Última coluna indica cálculo necessário para vários números de amostras. O volume total de cada reacção é de 20 uL.
| Ciclo | Temp (° C) | Tempo (seg) | Taxa de rampa (%) |
| 95 ° C | : 15 | 100 | |
| 40x | 95 ° C | : 15 | 100 |
| 60 ° C | : 60 | 100 | |
| Parâmetros de fusão | 95 ° C | : 10 | 100 |
| 60 ° C | : 60 | 100 | |
| 95 ° C | : 15 | 1 | |
| 60 ° C | : 15 | 100 | |
| Aguarde | 4 76; C |
Tabela 2:. Exemplo de protocolo para a amplificação de Desnaturar amostras a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de amplificação e geração de curva de fusão. Parâmetros de fusão estão listados na tabela. Nota mudança na taxa de rampa que permite a aquisição de temperatura de fusão alta resolução.
| A metilação por cento (de rato padrão) | Os picos das diferenças de temperatura |
| y | x |
| 0 | 5.670116 |
| 5 | 10,70448 |
| 10 | 15,5044 |
| 25 | 25,52295 |
| 50 | 34,43047 |
| 75 | 43,80894 |
| 100 | 53,88717 |
| Os picos das diferenças Temp | Metilação estimado |
| x | Y |
| Amostra 1 (n = 4) | |
| 47,450 | 81,115 |
| 46,292 | 78,657 |
| 41,694 | 68,894 |
| 47,292 | 80,779 |
| Amostra 2 (n = 4) | |
| 29,925 | 43,904 |
| 24,269 | 31,894 |
| 25,061 | 33,575 |
| 25,389 | 34,272 |
Tabela 4. Exemplo de estimativa calculada por cento metilação. Diferença de temperatura de pico de amostras de estado de metilação desconhecido é utilizado para estimar a percentagem de metilação usando uma equação de regressão linear. Os dados representativos de duas condições diferentes, as amostras 1 e 2, são mostrados; n = 4 para cada condição.
| Idade | Número de animais | O ARN total (ng) | O ADN total (ng) |
| p4-p10 | 3-6 | 455-868 | 265-1523 |
| p19-p22 | 1-2 | 220-680 | 583-1483 |
| p40-p50 | 3-4 | 198-260 | 578-1700 |
Tabela 5. O RNA total e adquirido a partir de DNA separadas por FACS células. A idade eo número de animais utilizados em FACS experimentos são listados. Note, ambos os córtices foram utilizados para cada N. total RNA e DNA é listado como uma referência para o rendimento esperado.
| Idade | Número de animais | Pos Eventos | Neg Eventos | O tempo de incubação (a 37 ° C) |
| p26 | 1 | 2.18X10 ^ 6 | 1.15X10 ^ 6 | 20:00 min |
| p26 | 2 | 4.4X10 ^ 6 | 2.78X10 ^ 6 | 20:00 min |
| p26 | 2 | 9.2X10 ^ 6 | 3,3x10 ^ 6 | 30:00 min |
Quadro 6. Número de eventos adquiridos de FACS no dia pós-natal 26. No número de p26 (eGFP +) eventos positivos e negativos eventos varia dependendo do número de animais utilizados e período de incubação.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| Methyl Primer | Applied Biosystems | online | software to localize CpG Islands |
| EZ DNA methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Rat Premixed Calibration Standard | EpiGenDx | 80-8060R-Premix | |
| CpG Methylase (M.Sssl) | Zymo Research | E2010 | |
| QIAquick Gel Extraction | QIagen | 28704 | Used for gel extraction and DNA cleanup |
| Restriction enzymes | New England BioLabs | ||
| NEB cutter | New England BioLabs | online | verify restriction digest sites |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Luc2 vector, pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| renilla vector, pGL4.74 | Promega | E2241 | |
| TD-20/20 Luminometer | Turner Designs | ||
| Lipofectamine LTX and Plus Reagent | Life Technologies | A12621 | |
| Phenol, saturated pH 6.6/6.9 | Fisher Scientific | BP 17501-100 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophtometer | ThermoScientific | ||
| MeltDoctor Master Mix | Life Technologies | 4415440 | |
| High Resolution Melt (HRM) Software v2.0 | Life Technologies | 4397808 | |
| AB SDS software v2.3 | Life Technologies | online | |
| AB High Resolution Melting Getting Started Guide | Life Technologies | online | |
| AB 7900HT Fast Real-Time System | Life Technologies |
References
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