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Behavior

Moderate Pränatale Alkoholexposition und Quantifizierung von Sozialverhalten bei erwachsenen Ratten

doi: 10.3791/52407 Published: December 14, 2014

Introduction

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Schätzungsweise 1-5% der Kinder mit Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs) 2, das Fetale Alkoholsyndrom (FAS), Teil FAS (PFA) und alkoholbedingte neurologische Entwicklungsstörungen (Arnds) 3 sind diagnostiziert. Defizite im sozialen Verhalten und Kognition gehören zu den häufigsten unerwünschten Ergebnissen bei Kindern mit FASDs 4-7 beobachtet. Negative Folgen sind nicht zu schwer pränatalen Exposition Alkohol (PAE), als moderat PAE, die nicht der auffällige morphologische, Verhaltens- und kognitive Defizite Merkmal FAS führt, bei Menschen mit FASDs 8-10 begrenzt vergleichsweise subtile, aber dennoch anhalt verursachen, Defizite und nicht-menschlichen Tieren zu Ethanol während der Gehirnentwicklung 11 ausgesetzt. Die Bedeutung von Verständnis der Verhaltens-und neurobiologische entsprechenden Folgen moderate PAE wird von aktuellen Schätzungen darauf hinweist, dass die große Mehrheit der FASD Fällen innerhalb weniger s fallen unterstrichenevere Bereich des Spektrums 12.

Mehrere unabhängige Laboratorien haben Veränderungen in Nagetier Sozialverhalten im Zusammenhang mit Exposition während der Entwicklung des Gehirns Ethanol berichtet, einschließlich verringerte Untersuchung und Zusammenspiel 1,13-15, veränderte Spiel 14,16,17, erhöhte aggressive Interaktionen 17,18, Veränderungen in Reaktion auf soziale Stimuli 19-21, und Defizite in sozial erworbenen Nahrungspräferenzen und soziale Anerkennung Speicher 22. Soziales Verhalten Defizite wurden nach Exposition gegenüber Schwer (Blutethanolkonzentrationen (BECs) ~ 300 mg / dl) 22,23 oder eher moderaten Ethanol (BECs ~ 80 mg / dl) 1 und in einem breiten Spektrum von Parametern für andere bedeutende beobachtet Faktoren wie Belichtungszeit, Dauer der Exposition, und Alter zum Zeitpunkt der Verhaltensmessung.

Zurück Forschung hat in bestimmten Aspekten der sozialen int gezeigt, dass Änderungeneraction im Erwachsenenalter zu unterscheiden Ratten auf moderatem Niveau von Alkohol aus den Kontrolltieren zu Saccharin 1,18 ausgesetzt. Insbesondere hat moderate PAE konsequent mit robusten erhöht im Ringen, die Erhöhungen der aggressives Verhalten und geringere soziale Untersuchung (zB Schnupfen des Partners) im Erwachsenenalter legt nahe, in Verbindung gebracht. Da Veränderungen im Sozialverhalten sind zuverlässig Folgen PAE kann die Quantifizierung von Sozialverhalten folgenden PAE Bedeutung für Fortschritte in Richtung auf ein besseres Verständnis der neuronalen Grundlagen der PAE bedingten Veränderungen im Sozialverhalten und der Entwicklung von Interventionsansätze zu halten. Das Ziel dieser Arbeit und der damit verbundenen Video ist zu Anweisungen auf dem moderaten PAE-Protokoll und Methoden zur Quantifizierung von Sozialverhalten bei erwachsenen Nachkommen, aufweisen zuverlässig unterschieden pränatale Alkohol-exponierten von nicht-exponierten Ratten-Nachwuchs.

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Protocol

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Alle hier und im zugehörigen Video beschriebenen Verfahren wurden von den Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüsse des Health Sciences Center und dem Hauptcampus der University of New Mexico zugelassen.

1. Die pränatale Exposition Ethanol

  1. Erhalten alle notwendigen Materialien und Chemikalien: Saccharin-Natriumsalz-Hydrat, Proof-Ethanol 190 (95% vol), Perlen Glas Trinkröhrchen, Naturkautschuk weiß # 4 Anschlag ein Loch, 1 "gebogenen Rohren-Kugelschreiber, Papier Herrscher von www gedruckt .vendian.org / mncharity / dir3 / paper_rulers /.
  2. Erhalten bewährten Erwachsenen Züchter Ratten von einem Händler oder alternative Quelle. Verwenden Long-Evans Züchter für die Methoden und repräsentative Daten in diesem Protokoll vorgestellt. Frauen wiegen 125-150 g und 6-7 Wochen alt bei der Ankunft, dass sie etwa 9-10 Wochen alt zum Zeitpunkt der Zucht sind (Schritt 1.5). Stellen Sie sicher, dass alle potenziellen Dämme Erstgebärenden. Stellen Sie sicher, dass Männer 12Wochen alt bei der Ankunft und 15 Wochen alt zu Beginn des Züchtungsprotokoll.
  3. Haus die Tiere einzeln in Kunststoffkäfigen bei 22 ° C auf einer Umkehr 12 Stunden hell / dunkel Zeitplan (Licht an 21.00 bis 09.00 h). Zugang zu Lebensmitteln und Leitungswasser ad libitum während der Studie, darunter in allen Trinkgelage. Lassen Sie mindestens 1 Woche für Akklimatisierung an der Anlage, bevor zu Schritt 1.4.
  4. Erhalten Ausgangskörpergewicht für jeden weiblichen Ratte.
  5. Werten Sie vor der Schwangerschaft trinken Ebenen bei weiblichen Ratten für 2 Wochen. Führen Sie die Schritte 1.5.1-1.5.6 in Ordnung.
    1. An den Tagen 1 und 2 zu füllen ein Trinkröhrchen, das 0,066% Saccharin-Lösung (ohne Ethanol) in Leitungswasser. Zur Quantifizierung Verbrauch befestigen ein Papier Lineal mit mm Genauigkeit auf den Trinkschlauch vor dem Füllen sie. Verwenden Sie diese Methode, wie sie bei der Messung mit einem Gewicht von Röhrchen Ethanolkonsum zu quantifizieren assoziiert reduziert Fehler. Das Rohr wird auf die 20 mm-Marke auf dem Lineal. Beginnen vierstündigen drinking Sitzungen (Schritte 1.5.1-1.5.6 und 1,7) 1 Stunde nach dem Beginn der Dunkelphase (10.00 h), wenn die Aktivität und Trink Ebenen am höchsten sind.
    2. Am Ende jedes Trinkgelage Quantifizierung des Volumens des Saccharin-Lösung, die verbraucht wurde. Um die Messung zu erleichtern, bestimmen das Volumen der Lösung pro mm auf dem Lineal im Voraus und konvertieren mm bis Bände. Bei den hier empfohlenen Rohren jeweils mm entspricht 0,366 ml.
    3. An den Tagen 3 und 4 zu füllen ein Rohr mit 2,5% Ethanol (v / v) und 0,066% Saccharin-Lösung in Leitungswasser. Am Ende jeder Sitzung Quantifizierung der Menge an Ethanol-Lösung (Gewicht pro kg Körpergewicht), die verbraucht wurde.
    4. Am Tag 5 und danach Füllen eines Rohres mit 5% Ethanol (v / v) und 0,066% Saccharin-Lösung in Leitungswasser. Am Ende jeder Sitzung Quantifizierung der Menge an Ethanol-Lösung (Gewicht pro kg Körpergewicht), die verbraucht wurde.
    5. Nach Abschluss der vor der Schwangerschaft trinken Phase wiegen die Ratten und berechnet den Mittelwert Ethanol consumption und Standardabweichung für die gesamte Gruppe. Ratten, für die bedeuten Verbrauch größer als 1 Standardabweichung über oder unter dem Gruppendurchschnitt aus der Studie, um die Variabilität der freiwilligen Trinken während der Schwangerschaft zu verringern.
    6. Ordnen die verbleibenden Ratten entweder mit dem Saccharin Steuerung oder PAE solchen Bedingungen, dass die vor der Schwangerschaft Trinkpegel so dicht wie möglich für die zwei Gruppen angepasst ist.
  6. Innerhalb 1-14 Tage Paar jeweils weiblichen Ratten mit einem bewährten männlichen Züchter. Weibliche Ratten haben während der Brutphase nicht Ethanol konsumieren. Schwangerschaft zu bestätigen durch die Anwesenheit von einer vaginalen Stecker, wiegen die weiblichen Ratte und beherbergen sie einzeln. Dies wird als Schwangerschafts Tag 1. Optional definiert, lassen Sie die weiblichen Ratten mit einem männlichen Züchter für bis zu 5 Tage, nach dem Entfernen der Frauen aus der Studie.
    Hinweis: Da Ethanolkonsum während der Schwangerschaft beginnt um 10:00 h am Tag der Gestation 1 Prüfung auf das Vorhandensein von einer vaginalen Stecker durchgeführt werden sollbis zu diesem Zeitpunkt.
  7. Bereitzustellen Ethanol oder Saccharin Lösungen während 4 Stunden pro Tag (1.000 bis 1.400 hr) für die Dauer der Schwangerschaft.
    1. Ab dem Tag der Gestation 1 stellen die weiblichen Ratten mit 0% oder 5% Ethanol und 0,066% Saccharin-Lösung in Leitungswasser auf der Grundlage der Gruppenzuordnung. Sicherzustellen, dass das Volumen der 0% igen Ethanollösung, um Saccharin Kontrollratten vorgesehen ist, um das mittlere Volumen von 5% Ethanol-Lösung von Ethanol Ratten konsumierten abgestimmt. Am Ende jeder Sitzung Quantifizierung der Menge an Ethanol-Lösung (Gewicht pro kg Körpergewicht) oder Saccharin, die verbraucht wurde.
    2. Wiegen Ratten-Muttertiere wöchentlich zu einer Gewichtszunahme von Müttern zu bewerten.
    3. Sorgen für Speis und Leitungswasser jederzeit einschließlich der Trinkgelage.
    4. Hört die Ethanolexposition Verfahren, wenn der Nachwuchs geboren werden. Notieren Sie die Zahl der lebenden Welpen und Welpen Gewichte bei der Geburt. Bestimmen Sie den Tag der Geburt als postnatalen Tag 0.
    5. Cull das Katzenklo zu 10 Welpen um postnatalen Tag 2-3. Versuchen to pflegen eine gleiche Verhältnis von männlichen zu weiblichen Tieren in jedem Wurf. Wenn dies nicht möglich ist, filtern bis 10 Welpen mit einer ungleichen Anzahl von Männchen und Weibchen.
    6. Nehmen pup Gewichte 2-3 Tage nach der Geburt.
    7. Wean die Tiere auf etwa postnatalen Tag 21 bis 24 und Haus in gleichgeschlechtlichen Paaren mit einem Tier aus dem gleichen pränatalen Behandlung Zustand. Verwenden Sie nicht mehr als 1-2 Ratten aus jedem Wurf pro Versuch, potenzielle Wurf Auswirkungen zu begrenzen.

2. Sozialverhalten

  1. Erhalten und bereiten alle notwendigen Materialien und Geräte.
    1. Besorgen Sie ein Gerät für die soziale Interaktion. Verwenden Sie eine Kammer mit einem offenen Oberteil Material aufgebaut ist, die leicht zu reinigen und zu desinfizieren ist. Die Vorderseite des Gerätes sollte mit starren transparenten Kunststoff (~ 2 mm Dicke) für die Dreharbeiten abgedeckt werden. Linie die Innenwände und Boden mit transparentem Kunststoff (~ 2 mm Dicke), um bei der Reinigung und Geruchskontrolle zu unterstützen. Platz Spiegeln entlang der Rückseite Innen wall Analyse helfen.
      HINWEIS: Für die repräsentative Daten hier ein benutzerdefiniertes Kammer (95 cm lang x 47 cm breit x 43 cm hoch) mit einer offenen Oberseite und starren transparenten Kunststoff (2 mm Dicke), die die Innenseiten und Boden des Gerätes gemeldet verwendet wurde. Spiegel wurden an der Rückwand angebracht. Die spezifischen Abmessungen und Materialien sind nicht kritisch für die Messung des Sozialverhaltens, aber es wird empfohlen, dass die Abmessungen ausreichend groß, dass eine echte soziale Interaktion gewährleisten können von anderen Verhaltensweisen unterschieden werden können. Das heißt, die Vorrichtung sollte groß genug sein, so dass Tiere nicht immer in unmittelbarer Nähe zueinander.
    2. Erhalten Videokameras in der Lage, Aufnahmen bei geringer oder keiner Lichtverhältnissen wie alle Dreharbeiten mit wenig oder gar kein Umgebungslicht im sichtbaren Spektrum durchgeführt. Stellen Sie sicher, dass die Kamera hat eine hohe Auflösung im Infrarotspektrum jedoch jede Kamera, die Aufnahme bei schlechten Lichtverhältnissen in seiner nativenNacht-Modus oder mit zusätzlicher Infrarot-Strahler sollte ausreichend sein.
    3. Position Infrarotstrahler in der Umgebung der Vorrichtung zur Beleuchtung der Vorrichtung in der Videoaufzeichnung zu verbessern.
    4. Erhalten Laborqualität Hackschnitzel (Espe Chip).
    5. Besorgen Sie sich einen Pinsel, Kehrschaufel, Chlordioxid und Isopropylalkohol (70%) für die Reinigung des Gerätes zwischen den Sitzungen und Geruchskontrolle.
  2. Apparat Akklimatisierung und Sozialverhalten
    1. Für diese Phase des Experiments, machen Messungen bei erwachsenen Ratten, die mindestens 90 Tage alt sind.
    2. Vor jeder Sitzung entfernen Sie alle Wald-Chips, wischen Sie das Gerät sauber mit Isopropylalkohol, um Gerüche zwischen den Sitzungen zu steuern und für frische Holzspäne. Sicherzustellen, dass die Holzspäne vollständig bedeckt die Unterseite der Vorrichtung. Reinigen von der Vorrichtung mit einem geeigneten Mittel, wie beispielsweise Chlordioxid, wie nötig.
    3. Für drei aufeinander folgenden Tagen stellen ein Tier und seinem Käfig Kollegen in derKammer für 30 Minuten, um die Tiere an die Vorrichtung zu akklimatisieren. Während der Akklimatisierung Sitzungen alle Raumbeleuchtung ausgeschaltet sind.
    4. Am Ende des dritten Akklimatisierung Sitzung Haus die Tiere einzeln in neue Käfige mit frischer Bettwäsche, Lebensmittel und Wasser für 24 Stunden, um die soziale Interaktion zu motivieren.
    5. Record soziale Interaktion am folgenden Tag 24 Stunden nach Einsetzen der Tiere wurden getrennt.
      1. Entfernen Hackschnitzel aus dem Gerät, Reinigen von mit Chlordioxid, wischen Sie mit Isopropyl-Alkohol, um Gerüche zu kontrollieren, und ersetzen Sie die Holzspäne vor der Sitzung.
      2. Positionieren Sie eine oder mehrere Kameras, um die Interaktion zu erfassen. Position mindestens einer Kamera vor der Vorrichtung, so daß die Spiegel auf der Rückwand der Vorrichtung eine zusätzliche Perspektive für die Analyse bereitzustellen.
      3. Abrufen Tieren ein zu einer Zeit und halten das Tier vor der Kamera, so dass die einzigartigen Eigenschaften des Pelzmuster zu verzeichnen. Diese Identifikationsmerkmale vondas Fell kann verwendet werden, um Ratten während der Analyse und nicht künstlich Kennzeichnung der Tiere zu unterscheiden.
        Hinweis: Da viele Aspekte der Nager soziale Interaktion beinhalten olfaktorischen Signale und riechen Sie den Partner, wo immer möglich, die Einführung fremder Gerüche zu vermeiden. Long-Evans-Ratten haben in der Regel eine Funktion der Fellmuster, die genutzt werden, um eine bestimmte Paar von Tieren zu unterscheiden. Bei anderen Stämmen (zB Sprague-Dawley-Ratten) Alternative Ansätze, wie Markieren der Schwanz mit einem fusselfreien Farbstoff verwendet werden. Es ist wichtig zu erkennen, dass viele Verhaltensweisen von Interesse sind, auf bestimmte Ziele ausgerichtet (z. B. anogenitale Sniffing in der Nähe der Basis des Schwanzes gerichtet, verspielt Angriffe am Nacken oder aggressive Angriffe gegen die Flanken oder Bauch gerichtet). Kennzeichnung der Tiere näher zu der Spitze des Endstücks weit von diesen interessierende Ziele empfohlen.
      4. Nehmen Sie Video von der sozialen Interaktion für mindestens 12 min.
      5. Überwachen Tiere für den Kampf in der gesamten Sitzung. Wenn möglich, beobachten Sie die Tiere über einen Monitor oder ein Fenster, so dass der Versuchsleiter ist nicht im Zimmerpreis während der Sitzung.
        HINWEIS: Bekämpfung wurde nur selten in Studien mit erwachsenen Ratten beobachtet jedoch, sollten die Tiere während der gesamten Sitzung überwacht werden. Die Sitzung sollte beendet werden, wenn es übermäßige Bekämpfung oder Anzeichen von Schäden oder Verletzungen an ein Tier.
  3. Verhaltens Codierung und Analyse.
    1. Identifizieren Sie die folgenden Verhaltensweisen von Interesse nach früheren Arbeiten mit PAE 1,18. Quantifizierung der Dauer, Häufigkeit und Latenzzeit bis zum ersten Auftreten der folgenden Verhaltensweisen; Wrestling (einschließlich Pinning), Boxen, Krabbeln (Kreuzung) über / unter dem Partner, anogenitale Schnupfen, andere Schnüffeln der Körper des Partners (Körper Sniffing) allogrooming (Pflege des Partners), Aufzucht und schnüffeln / Graben in den Holzspänen . Beispiele für jedes Verhalten zu veranschaulichend in der Video-Komponente in diesem Artikel.
    2. Quantifizierung der Sozialverhalten von Interesse aus dem Video. Besorgen Sie sich die Frequenz, Gesamtdauer und Latenz an die erste Instanz für jedes Verhalten von Interesse.
      HINWEIS: Die Beschaffung dieser Maßnahmen kann manuell erreicht werden, aber die Quantifizierung dieser Maßnahmen mit Hilfe computergestützter Analysen der digitalisierten Video empfohlen. Ein Matlab (www.mathworks.com) Skript für die Wiedergabe des Videos und Quantifizierung von Verhalten ist als Ergänzung zu diesem Artikel.
    3. Nach der Codierung wird für alle Ratten beendet die erhaltenen Dauer, Häufigkeit und Latenz-Daten werden mit einem Statistikpaket analysiert.

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Representative Results

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Im Laufe vieler Zucht Runden weiblichen Ratten in der Ethanol Zustand konsistent trinken durchschnittlich etwa 2,1 g / kg Ethanol pro 4 Stunden Trinkgelage. Ratte Dämme verbrauchen etwa eine Hälfte des vier hr Gesamt während der ersten 15 bis 30 Minuten nach der Einführung der Trinkröhrchen, was zu einem Spitzen mütterlichen Serum Ethanolkonzentration von etwa 60 mg / dl, gemessen in 45 Minuten-Zeitpunkt. Über den verbleibenden 3,5 Stunden des Trink Zeitraums erhalten sie auf 5% Ethanol, bei einer niedrigeren, aber relativ stabile Geschwindigkeit von 0,4 g / kg Körpergewicht / Stunde verbraucht. Dieses Niveau, Struktur freiwillige Ethanolkonsum hat keine wesentlichen Auswirkungen auf mütterliche Gewichtszunahme, Nachkommen Geburtsgewicht, Wurfgröße, mütterliche Fürsorge, Plazenta-Nassgewicht, Nachkommen Gewicht bei Verhaltenstests oder ganze Gehirn, Hippocampus oder Kleinhirnfeuchtgewichte.

Repräsentative Mittel und SEMs von männlichen saccharin- und Ethanol-exponierten Ratten für jede Verhaltensmaßnahme einerneut in Tabelle 1 dargestellt. Diese Daten wurden aus früheren Experimenten zusammengefasst und beinhalten 16 Männern für jeden pränatalen Behandlung Zustand. Alle Tiere wurden mit Partnern aus der gleichen pränatalen Behandlung Zustand gepaart. Robust alkoholbedingte Veränderungen im Sozialverhalten der weiblichen Tiere wurden nicht in unseren Studien unter Verwendung dieser Verfahren 1 jedoch alkoholbedingten Unterschiede in der weiblichen Sozialverhalten wurden durch andere Verfahren, 15,23 dokumentiert beobachtet. Separate univariate Varianzanalysen (ANOVA) in SPSS Version durchgeführt. 21 für Macintosh gezeigt, dass männliche Ethanol-exponierten Ratten signifikant höher Dauer [F (1, 30) = 19,12] und Frequenz [F (1, 30) = 6.80] Wrestling hatte und verringert Latenz an die erste Instanz des Wrestling [F ( 1, 30) = 9,41]. Ethanol-exponierten Ratten verbrachte weniger Zeit in anogenitalen engagiert Schnupfen [F (1, 30) = 5,17].

1a. Häufigkeit SAC PAE
Wrestling * 2,00 (0,58) 8,00 (2,23)
Boxen 1,81 (0,80) 3,56 (1,47)
Überqueren Sie über / unter 1,06 (0,48) 1,00 (0,29)
Anogenital-Sniffing 6.25 (1.20) 3,75 (0,73)
Körper Sniffing 19,75 (1,64) 18,56 (2,06)
Allogrooming 2,31 (0,93) 0,75 (0,27)
Aufzucht 56,50 (5,39) 56,06 (5,40)
Dig / Sniff Bettwäsche 32,06 (6,03) 30,06 (5,27)
1b. Dauer (sek) SAC PAE
Wrestling ** 9,14 (2,31) 39,81 (6,62)
Boxen 2,55 (1,43) 3,81 (1,62)
Überqueren Sie über / unter 0,83 (0,39) 1,03 (0,27)
Anogenital-Sniffing * 11.21 (2.10) 5,69 (1,22)
Körper Sniffing 27,21 (2,33) 27,09 (3,73)
Allogrooming 13,50 (5,68) 3,82 (1,79)
Aufzucht 120,31 (13,32) 121,48 (12,13)
Dig / Sniff Bettwäsche 119,59 (24,45) 109,15 (21,41)
1c. Latenz (sec) SAC PAE
Wrestling ** 430,75 (50,51) 209,98 (51,25)
Boxen 569,52 (48,14) 525,63(74,75)
Überqueren Sie über / unter 544,4 (65,21) 429,01 (75,78)
Anogenital-Sniffing 107,68 (39,35) 164,31 (44,09)
Körper Sniffing 22.77 (6.14) 16.80 (3.21)
Allogrooming 471,44 (70,82) 588,52 (48,47)
Aufzucht 20,92 (7,65) 11.94 (1.20)
Dig / Sniff Bettwäsche 76,78 (25,78) 117,66 (44,64)

Tabelle 1: Mittlere (+ SEM) Frequenz (1a), Dauer (1b) und Wartezeit bis zum ersten Auftreten (1c) für jedes Verhalten während der sozialen Interaktion Sitzung für saccharin- (SAC) quantifiziert und pränatale Alkohol-exponierten (PAE) Ratten ( n = 1 6 pro vorgeburtlichen Behandlungsgruppe). [* P <0,05, ** p <0,005]

18. Für das vorliegende Beispiel, könnte der Box M-Test zu Test auf gleiche Varianzen nicht berechnet werden, da die Anzahl der unabhängigen Variablen größer als die Anzahl der Fälle war (ein 5: 1-Verhältnis ist in der Regel empfohlen). Die Diskriminanzfunktion zeigte eine signifikante Assoziation zwischen Gruppen und Prädiktoren, einem Anteil von 74% der Variabilität zwischen den Gruppen. Eine Analyse der Struktur-Matrix ergab, dass die Dauer der Wrestling (0,470), und die Latenz bis zum ersten Auftreten von Ringen (-0,330) waren signifikante Prädiktoren. Counts (Frequenz) Wrestling (0,280) und die Dauer der anogenitalen Sniffing (-0,244) waren etwas schwächer Prädiktoren. Der Vergleichstest-Klassifizierung ergab, dass insgesamt 71,9% der Fälle wurden korrekt klassifiziert.

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Discussion

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Die hier beschriebene pränatalen Exposition Alkohol Paradigma beinhaltet freiwilligen Verbrauch von Ethanol (5% v / v) von Ratten-Muttertiere während der Schwangerschaft. Es gibt eine Reihe von Protokollen für die während der Entwicklung des Gehirns in der Literatur, die in Bezug auf die Zeitwahl, Dosis, Dauer und Art der Verabreichung Ethanol sowie untersuchten Art unterscheiden dargestellt Belichten nicht-menschlichen Tieren zu Ethanol. Obwohl eine sorgfältige Behandlung der Vorteile der verschiedenen Belichtungs Protokollen ist hier vorgesehen, in diesem Protokoll beschrieben mehrere Vorteile des freiwilligen Trink Verfahren zur PAE sind hervorgehoben. Zuvor verwendeten wir eine flüssige Diät-Protokoll, ein Ansatz, die üblicherweise in diesem Bereich der Forschung eingesetzt werden, bei denen Ratten-Muttertiere verbrauchen 5% Ethanol als Teil des Hauptnahrungsquelle 24. Kontrollbedingungen für diesen Ansatz ein Paar gefüttert, in der der Kalorienzufuhr wurde mit der von Ethanol raub Staudämme angespannt und eine Gruppe, die freien Zugang hatum Chow. Bei dem hier beschriebenen Ratten-Muttertiere in beiden Gruppen (Ethanol und Saccharin) verbrauchen die gleiche Rattenfutter Diät, die zwischen Gruppe Variabilität reduziert in der Ernährung und Kalorienzufuhr, und das Potenzial verwechseln Stress mit Zwangs Verbrauch von einem unbekannten Nahrungsquelle verbunden minimiert freiwilligen Trinkparadigmen 25. Dieses Merkmal der Selbsttrink Paradigma beseitigt auch die Notwendigkeit für eine paarweise gefütterte Kontroll wie bei der flüssigen Nahrung Ansatz, der einige praktische und ethische Vorteile bietet, einschließlich der Verringerung der Zahl der Versuchsgruppen (von drei auf zwei), die Anzahl der Tieren in der Forschung verwendet werden, und die damit verbundenen Kosten für die Forschung durchzuführen. Das 4 h intermittierende Exposition Muster freiwillige Ethanolverbrauch bedeutet weniger variabel Trinkstufen als bei der 5% Ethanol flüssige Diät-Protokoll, das vernünftigerweise erwartet werden kann, um ähnliche Variabilität in PAE Nachkommen beobachtet Endpunkte zu verringern beobachtet. Da Blut Ethanol concentrations mit jedem Protokoll erreicht sind wichtig, um zu quantifizieren und zu kommunizieren, Messungen der mütterlichen Serum Ethanolkonzentrationen sollten regelmäßig durchgeführt werden (zB jährlich), um sicherzustellen, dass vergleichbare BACs werden in Zucht Runden erreicht. Aufgrund der möglichen Wechselwirkungen zwischen pränataler Stress und Ethanol Exposition sollten diese Maßnahmen in einer separaten Gruppe von Frauen, für die die Nachkommen in nachfolgenden Studien durchgeführt werden (siehe Nr. 26). Es ist wichtig zu erkennen, dass die maximalen Plasmakonzentrationen Ethanol wird ca. 45-60 min auftritt, nachdem das Trinkrohr eingeführt wird. Anstelle der BACs aus den Talsperren Herstellung experimenteller Nachkommen, ist die sinnvolle Maßnahme, um mit Ergebnismessungen korrelieren täglich Ethanolkonsum einer Ratte Damms während der Schwangerschaft. Allerdings beschränken den Bereich der Trinkwasser in Ratten-Muttertiere innerhalb einer Standardabweichung vom Mittelwert für die Gruppe wahrscheinlich zwingen eine sinnvolle Korrelation zween Ethanol verbraucht und eine vorgegebene Zielparameter. Schließlich Auswertung vor der Schwangerschaft Trinkwasser verwendet, um Ratten, die in der gewünschten Höhe für die nachfolgenden Phasen der Trinkprotokoll trinken identifizieren. Dieser Aspekt der Ethanolexposition Paradigma auch sichergestellt, dass alle weiblichen Ratten haben Erfahrung Trinken vor der Schwangerschaft, die genauer Modelle menschlichen Verhaltens in diesem Trink ist unwahrscheinlich, dass in der Schwangerschaft beginnen.

Mehrere zusätzliche methodische Fragen und Vorbehalte zum Alkohol Exposition Paradigma Zusammenhang sollte berücksichtigt werden. Die hier beschriebene freiwillige Trink PAE Paradigma tritt in der gesamten Schwangerschafts Entwicklung, die bei der Ratte entspricht in etwa den ersten beiden Trimester der Schwangerschaftsentwicklung beim Menschen. Exposition während der frühen postnatalen Entwicklung wird von vielen Laboren verwendet, um dritten Trimester menschlichen Gleichwertigkeit zu modellieren (siehe zB, ref. 27). Darüber hinaus stellen wir fest, dass die Verfahren hier zum Ausdruck einer chronischenExposition Protokoll (Ratten-Muttertiere trinken jeden Tag). Wichtig ist, genau zeitgesteuerte Belichtung auf höhere Ebenen von Alkohol (~ 287 mg / dl) an Schwangerschafts-Tag 15 beschränkt hat auch gezeigt, dass das Sozialverhalten 15 ändern. Die hier vorgestellte Paradigma umfasst freiwilligen Alkoholkonsum von Ratten Dämme, daher gibt es eine begrenzte Anzahl von Blutethanolkonzentrationen, die mit diesem Ansatz erreicht werden kann. Erzielung höherer Blutethanolkonzentrationen erfordert andere Methoden der Exposition (zB Magensonde, Injektion, Dampfexposition). Ein weiterer wichtiger Punkt betrifft Potenzial für Veränderungen im mütterlichen Fürsorge, die Interpretation der Auswirkungen auf das Verhalten mit der pränatalen Exposition Ethanol erschweren könnte. Zur Lösung dieses Problems sollten Bewertungen der mütterlichen Betreuung während der Schwangerschaft regelmäßig bewertet werden. Keine Effekte von mässiger Alkoholkonsum während der Schwangerschaft auf mütterlicher Fürsorge haben mit den hier in der Long-Evans-Ratten 28 beschriebenen Verfahren festgestellt. Beurteilung, obVeränderungen in Verhaltensindikatoren der mütterlichen Fürsorge (siehe Ref. 29) sollte jedoch zunächst und danach in regelmäßigen Abständen bewertet werden, insbesondere dann, wenn Abweichungen von den hier beschriebenen Methoden, einschließlich der Art und Stamm des Tieres oder höhere Konzentrationen von Ethanol verwendet.

Die hier beschriebenen Verhaltensverfahren zuverlässig Veränderungen in spezifischen Aspekten des Sozialverhaltens (Ringen und Untersuchung) in erwachsenen männlichen Ratten auf moderatem Niveau von Alkohol während der vorgeburtlichen Entwicklung des Gehirns 1,18,30 ausgesetzt ergab. Die hier quantifiziert Verhaltensweisen wurden ausgewählt, basierend auf einer großen Anzahl von vorhandenen Literatur 31 bis Partner gerichtete Verhaltensweisen (zB Ringen, Untersuchung) und andere Verhaltensweisen gegenüber der Umwelt gerichtet (zB, Aufzucht-, Graben) Ziel, die leicht durch gemessen werden kann Videoanalyse. Diskriminanz Analysen zeigten, dass erhöht im Ringen die beste Diskriminierung zwischen alkohol belichtet und Saccharin-exponierten Ratten unter einer breiten Palette von sozialen und nicht-sozialen Verhaltensvariablen 18. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass die Auswirkungen von PAE auf das soziale Verhalten bei weiblichen Ratten nicht mit den hier beschriebenen Methoden 1 beobachtet worden, auch wenn Haupteffekte des Geschlechts wurden für mehrere abhängige Maßnahmen einschließlich Anogenital-Sniffing (female> male) berichtet, Körper-Sniffing (Stecker> Buchse), Ringen (Stecker> Buchse) und Boxen (Stecker> Buchse).

Obwohl Wrestling wurde gezeigt, dass der primäre Aspekt des sozialen Verhaltens durch moderate PAE verändert werden, ist die Einbeziehung der anderen Verhaltensweisen wichtig für die Gründung der Selektivität der Auswirkungen auf das Verhalten und den Ausschluss allgemeine Verhaltensdefizite. Die Reihe von Verhaltensweisen hier quantifiziert ist keineswegs erschöpfend. Verhalten von Interesse sollte während der Vorarbeiten ausgewählt werden, um das Gesamtbild der in einer gegebenen Menge von Daten beobachteten Effekte zu erfassen. Dies ist Augenhöhebesonders wichtig, wenn verschiedene Alkohol-Exposition Paradigmen oder Parameter, wie Variationen in den Verfahren zumutbar wäre, die verschiedenen Verhaltensergebnisse ergeben werden genutzt. Zusätzlich zu den hier beschriebenen, zunächst die Bewertung eine breitere Reihe von Verhaltensweisen wie Beißen, Kratzen (Selbst-), ​​volle Pflege-Sequenzen, abgeschnitten grooming Sequenzen (indikativ für Angst) Verhaltensweisen, "seitlich" Display 32,33, schüttelt Körper, jagen, und Spielverhalten 34-37 empfohlen. Beobachtung in 6-12 Paare von Tieren sollte ausreichen, um Verhaltensweisen, die Alkohol-exponierten aus nicht-exponierten Tieren unterscheiden zu identifizieren.

Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Ringkampf, in Abhängigkeit vom Alter zum Zeitpunkt der Messung, könnten echte aggressives Verhalten zu reflektieren oder Spielverhalten. Frühe Läsionen der ventrolateralen Frontalcortex von Ratten, die verknüpft wurde bis mittel PAE Auswirkungen auf das Sozialverhalten 1,18,30, führen zu Increased Spielverhalten 38. Bei der Ratte spielen Verhalten Spitzen während nach der Entwöhnung Entwicklung rund um die postnatale Tage 30-40 33,34 und nimmt wie die Tiere im Erwachsenenalter nähern. Alkohol-Exposition während der Entwicklung des Gehirns verändert Spielverhalten, wenn vor der Erwachsenenalter 6,16,23 gemessen und könnte die Rate, mit der Spielverhalten mit dem Alter abnimmt beeinflussen. Da die Topographien von Spiel und aggressives Verhalten ähnlich sind, eine klare Unterscheidung kann schwer zu erreichen sein. In früheren Studien, auffällige Verhaltensindikatoren der Aggression, wie kämpfen oder beißen, nicht in moderaten PAE Ratten beobachtet. Allerdings können zusätzliche Verhaltensindikatoren geben Aufschluss über die Einstufung dieser Verhaltensweisen 18. Zum Beispiel am Nacken gerichteten Angriffe, das primäre Ziel der spielerischen Angriffe selten auftreten bei erwachsenen Ratten PAE 18. Im Gegensatz dazu, direkte Angriffe auf das Hinterteil, ein Ziel von nicht-spielerischen Angriffe 39 beobachtet more häufig, was darauf hindeutet, dass PAE bedingte Erhöhungen der Wrestling reflektieren Aggression anstatt zu spielen. Spielverhalten sollten in die Analyse einbezogen werden, wenn das Sozialverhalten vor dem Erwachsenenalter oder spielen Verhalten auffällig im Verhalten von erwachsenen Tieren gemessen. Detaillierte Verfahren für die Analyse von Spielverhalten durch Himmler et al 35 beschrieben.

Schließlich ist es wichtig, dass die Sozialverhaltens mit Hilfe der hier beschriebenen kann durch die Wahl des Partners Tier beeinflusst werden Methoden. In den hier vorgestellten repräsentativen Ergebnissen wurden die Tiere mit vertrauten Tieren (Käfig Kollegen) aus dem gleichen pränatalen Behandlung Zustand 1,18 gepaart. Die Begründung für diese Wahl war weitgehend auf Daten, die zeigen, dass die Gehäuse Kontrolltieren mit Ethanol-exponierten Ratten auf Basis verändert das soziale Verhalten in Kontrollratten 14, sowie ähnliche und zuverlässige unveröffentlichte Beobachtungen aus unserem Labor. Diese Effekte können möglicherweise complicaß Identifizierung und Interpretation von PAE bedingten Veränderungen im Sozialverhalten. Die zur Quantifizierung des Sozialverhaltens hier beschriebenen Verfahren können jedoch auf jede Veränderung der Quelle des Sozialpartner, von denen es mehrere Möglichkeiten, einschließlich der Verwendung eines nicht behandelten Partner, die von keinem der beiden Behandlungszustand 1 wird angewendet werden, wobei ein Partner Tiere aus dem gleichen Behandlungsbedingungen (wie hier beschrieben) oder einem Partner Tier aus einer anderen Behandlungsbedingung. Ferner kann die Vertrautheit der Partner Tier manipuliert werden, um die soziale Interaktion 1 beeinflussen. Die Auswahl der Partner Bedingung und anderen Variablen zu Sozialwohnungen, Geschlecht und Exposition Paradigma Zusammenhang kann zugeschnitten auf am besten erfüllen die wissenschaftlichen Ziele des jeweiligen Labor, während immer noch die Nutzung der grundlegenden Verfahren zur Quantifizierung der hier beschriebenen Sozialverhalten werden.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saccharin sodium salt hydrate Sigma S1002
190 proof ethanol Sigma 493538
Beaded glass drinking tubes Fisher 14-955K
Natural rubber white #4 stopper one hole Plasticoid LSG4M181
1" bend tubes-ball point Ancare TD-199-3"
Paper rulers N/A N/A www.vendian.org/mncharity/dir3/paper_rulers
Apparatus for social interaction Custom built N/A 95 cm X 47 cm X 43 cm
Video cameras N/A N/A Capable of recording low/no light conditions
Infrared illuminators Vitek VT-IR1-12
Teklad laboratory grade sani-chips Harlan 7090A
Brush and dustpan N/A N/A
Isopropyl alcohol Sigma W292907
Chlorine Dioxide (1.5 mg Tablets) Quiplabs N/A Prepare per manufacturer's recommendation

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References

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Moderate Pränatale Alkoholexposition und Quantifizierung von Sozialverhalten bei erwachsenen Ratten
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Hamilton, D. A., Magcalas, C. M., Barto, D., Bird, C. W., Rodriguez, C. I., Fink, B. C., Pellis, S. M., Davies, S., Savage, D. D. Moderate Prenatal Alcohol Exposure and Quantification of Social Behavior in Adult Rats. J. Vis. Exp. (94), e52407, doi:10.3791/52407 (2014).More

Hamilton, D. A., Magcalas, C. M., Barto, D., Bird, C. W., Rodriguez, C. I., Fink, B. C., Pellis, S. M., Davies, S., Savage, D. D. Moderate Prenatal Alcohol Exposure and Quantification of Social Behavior in Adult Rats. J. Vis. Exp. (94), e52407, doi:10.3791/52407 (2014).

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