Introduction
Uppskattningsvis 1-5% av barn diagnostiseras med Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs) 2, som omfattar fetalt alkoholsyndrom (FAS), partiell FAS (PFAS), och alkoholrelaterade störningar i nervsystemets (ARNDs) 3. Brister i socialt beteende och kognition är bland de vanligaste negativa resultat observerats hos barn med FASDs 4-7. Negativa konsekvenser är inte begränsade till tung prenatal alkoholexponering (PAE), som måttlig PAE som inte leder till iögonfallande morfologiska, beteendemässiga och kognitiva brister karakteristiska för FAS kan orsaka devis subtila, men ändå ihållande, underskott i människor med FASDs 8-10 och icke-humana djur exponeras för etanol under hjärnans utveckling 11. Vikten av att förstå beteendemässiga och motsvarande neurobiologiska konsekvenser av måttlig PAE stryks av Aktuella uppgifter visar att den stora majoriteten av FASD fall faller inom de mindre severe området av spektrumet 12.
Flera oberoende laboratorier har rapporterat förändringar i gnagare socialt beteende relaterade till etanol exponering under hjärnans utveckling, inklusive minskade utredning och interaktion 1,13-15, förändrad lek 14,16,17, ökade aggressiva interaktioner 17,18, förändringar i lyhördhet för sociala stimuli 19-21, och underskott i socialt förvärvade matpreferenser och igenkänningsminne social 22. Social beteende underskotten har observerats efter exponering för tunga (blodetanolkoncentrationer (avgasrening) ~ 300 mg / dl) 22,23 eller mer måttliga nivåer av etanol (BEC ~ 80mg / dl) 1, och över ett brett spektrum av parametrar för andra betydande faktorer, bland annat exponering timing, exponeringens varaktighet, och ålder vid tidpunkten för beteendemätning.
Tidigare forskning har visat att förändringar i specifika aspekter av socialt interaction i vuxen ålder diskriminera råttor som utsätts för måttliga nivåer av alkohol från kontrolldjur som utsätts för sackarin 1,18. I synnerhet har måttlig PAE konsekvent förknippats med robusta ökningar i brottning, vilket tyder på ökningar i aggressivt beteende, och lägre nivåer av social utredning (t.ex. sniffning av partnern) i vuxen ålder. Eftersom förändringar i socialt beteende är tillförlitliga konsekvenser av PAE, kan kvantifiering av socialt beteende efter PAE håll betydelse för framåt mot en mer fullständig förståelse av de neurala grunderna för PAE-relaterade förändringar i socialt beteende och utvecklingen av intervention tillvägagångssätt. Målet med detta dokument och den tillhörande videon är att ge instruktioner om den moderata PAE protokoll och metoder för kvantifiering av socialt beteende hos vuxna avkommor som har ett tillförlitligt stående prenatal alkoholexponerade från icke-exponerade råtta avkomma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som beskrivs här och i det åtföljande videon har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittéer Health Sciences Center och huvudcampus vid University of New Mexico.
1. Prenatal Etanol Exponering
- Skaffa alla nödvändiga material och kemikalier: Sackarinnatrium salthydrat, 190 bevis etanol (95% alkohol i volym), pärlstav glas dricka rören, naturgummi vit # 4 proppen ett hål, 1 "böjda rör-kulspets, pappers härskare skrivas ut från www .vendian.org / mncharity / kat3 / paper_rulers /.
- Skaffa beprövade vuxen uppfödare råttor från en leverantör eller alternativ källa. Använd Long-Evans uppfödare för de metoder och representativa uppgifter som presenteras i detta protokoll. Honorna väger 125-150 g och 6-7 veckors ålder vid ankomsten så att de är ungefär 9-10 veckor gammal vid tiden för avel (steg 1,5). Se till att alla blivande dammar är förstföderskor. Se till att män är 12veckors ålder vid ankomsten och 15 veckor gamla vid början av häcknings protokollet.
- Hus djuren individuellt i plastburar vid 22 ° C på en omvänd 12 timmar ljus / mörker schema (ljus på från 21:00 till 09:00 h). Ge tillgång till mat och kranvatten ad libitum under hela studien, även under alla dryckestillfällen. Lämna minst 1 vecka för acklimatisering till anläggningen innan du fortsätter till steg 1.4.
- Skaffa baslinje kroppsvikt för varje hona råtta.
- Utvärdera före graviditeten dryckesnivåer i honråttor i 2 veckor. Följ steg 1.5.1-1.5.6 i ordning.
- På dagarna 1 och 2 fyller en dricka rör innehållande 0,066% sackarin lösning (ingen etanol) i kranvatten. För att kvantifiera konsumtionen fästa ett papper linjal med mm precision till dricksröret innan det fylls. Använd denna metod eftersom det minskar mätfel i samband med vägning rör för att kvantifiera etanolkonsumtion. Fyll röret till 20 mm märket på linjalen. Börja fyra timmars drinkiNG sessioner (steg 1.5.1-1.5.6 och 1.7) 1 tim efter debuten av den mörka fasen (10:00 timmar) när aktivitets- och dryckesnivåerna är högst.
- Vid slutet av varje dricksvatten session kvantifiera volymen av sackarin lösning som konsumerades. För att underlätta mätning, fastställa omfattningen av lösningen per mm på linjalen i förväg och konvertera mm till volymerna. För rören rekommenderas här varje mm motsvarar 0,366 ml.
- På dagarna 3 och 4 fylla ett rör med 2,5% etanol (vol / vol) och 0,066% sackarin lösning i kranvatten. Vid slutet av varje session kvantifiera mängden etanollösning (vikt per kg kroppsvikt) som konsumerades.
- På dag 5 och därefter fylla ett rör med 5% etanol (volym / volym) och 0,066% sackarin lösning i kranvatten. Vid slutet av varje session kvantifiera mängden etanollösning (vikt per kg kroppsvikt) som konsumerades.
- Efter avslutad före graviditeten drickande fasen väga råttorna och beräkna medelvärdet etanol konsumption och standardavvikelse för hela gruppen. Ta bort råttor som innebär konsumtion är större än 1 standardavvikelse över eller under gruppen menar från studien att minska variationen i frivilligt drickande under graviditeten.
- Tilldela de återstående råttorna till antingen sackarin kontroll eller PAE betingelser så att de före graviditeten konsumtionsnivåerna matchas så nära som möjligt för de två grupperna.
- Inom 1-14 dagar paret varje hona råtta med en beprövad manliga uppfödare. Honråttor konsumerar inte etanol under häckningsfasen. Bekräfta graviditet genom närvaron av en vaginal plugg, väger den kvinnliga råttan, och hysa henne personligen. Detta definieras som graviditets dag 1. Eventuellt lämna honråttor med en manlig uppfödare för upp till 5 dagar, varefter bort honorna från studien.
OBS: bör utföras Eftersom etanolkonsumtion under graviditeten börjar kl 10:00 tim på graviditets dag 1 inspektion för förekomst av en vaginal pluggföre denna tid. - Tillhandahålla etanol- eller sackarin lösningar under 4 h per dag (1000 till 1400 h) under varaktigheten av graviditeten.
- Med början på graviditets dag 1 ger den kvinnliga råttan med antingen 0% eller 5% etanol och 0,066% sackarin lösning i kranvatten baserat på gruppuppgift. Se till att volymen av 0% etanollösning tillhandahålls till sackarinsalter kontrollråttor är anpassad till medelvolym på 5% etanol-lösning som förbrukas av etanol råttor. Vid slutet av varje session kvantifiera mängden etanollösning (vikt per kg kroppsvikt) eller sackarin som konsumerades.
- Väg råtta dammar varje vecka för att utvärdera maternell viktökning.
- Ge mat och kranvatten på alla gånger inklusive dryckestillfällen.
- Upphör förfarandena etanol exponering när avkomman föds. Anteckna antalet levande ungar och ungar vikter vid födseln. Utse dagen födelse som postnatal dag 0.
- Gallra kullen till 10 valpar runt postnatal dag 2-3. Försök to upprätthålla en lika stor andel av manliga till kvinnliga djur i varje kull. Om detta inte är möjligt, gallra till 10 valpar med olika antal män och kvinnor.
- Rekord pup vikter 2-3 dagar efter födseln.
- Avvänja djuren på ungefär postnatal dag 21-24 och hus i samkönade par med ett djur från samma prenatal behandling skick. Använd inte mer än 1-2 råttor från varje kull per experiment för att begränsa eventuella ströeffekter.
2. Social Behavior
- Skaffa och förbereda alla nödvändiga material och utrustning.
- Skaffa en apparat för social interaktion. Använd en kammare med en öppen topp av sådant material som är lätt att rengöra och desinficera. Framsidan av apparaten bör täckas med styv transparent plast (~ 2 mm tjocklek) för filmning. Linje innerväggarna och golvet med transparent plast (~ 2 mm tjocklek) för att underlätta rengöring och luktkontroll. Placera speglar längs ryggen interiören wall för att underlätta analysen.
OBS: För de representativa uppgifter redovisas här en anpassad kammare (95 cm långa × 47 cm bred × 43 cm lång) med en öppen topp och styv transparent plast (2 mm tjocklek) som täcker de inre sidorna och golvet av apparaten användes. Speglar placerades längs bakväggen. De specifika mått och material är inte kritiskt för mätning av socialt beteende, dock är det rekommenderat att dimensionerna vara tillräckligt stor för att säkerställa att en verklig social interaktion kan skiljas från andra beteenden. Det vill säga, anordningen skall vara stora nog så att djur inte alltid i nära anslutning till varandra. - Skaffa videokameror som kan spela in under låg eller ingen ljusförhållanden som all filmning sker med liten eller ingen omgivande belysning inom det synliga spektrat. Se till att kameran har en hög upplösning inom det infraröda spektrat, dock någon kamera som kan spela in under mörka förhållanden i dess naturliganattläge eller med ytterligare infraröd belysning bör räcka.
- Position infraröd belysning runt apparaten för att förbättra belysningen av apparaten i videoinspelningen.
- Skaffa laboratoriekvalitet flis (asp chip).
- Skaffa en borste, sopskyffel, klordioxid och isopropylalkohol (70%) för rengöring av anordningen mellan sessioner och luktkontroll.
- Skaffa en apparat för social interaktion. Använd en kammare med en öppen topp av sådant material som är lätt att rengöra och desinficera. Framsidan av apparaten bör täckas med styv transparent plast (~ 2 mm tjocklek) för filmning. Linje innerväggarna och golvet med transparent plast (~ 2 mm tjocklek) för att underlätta rengöring och luktkontroll. Placera speglar längs ryggen interiören wall för att underlätta analysen.
- Apparater acklimatisering och socialt beteende
- För denna fas av experimentet, göra mätningar i vuxna råttor som är minst 90 dagars ålder.
- Före varje session avlägsna eventuella trän chips, torka apparaten ren med isopropylalkohol för att kontrollera lukter mellan sessioner och tillhandahålla färskt flis. Säkerställ att träflisen helt täcka botten av anordningen. Rengör och desinficera anordningen med ett lämpligt medel, såsom klordioxid, vid behov.
- För tre dagar i följd placera ett djur och dess bur-mate ikammare under 30 minuter för att acklimatisera djuren till anordningen. Under acklimatiseringen sessionerna alla rums lampor är avstängda.
- Vid utgången av det tredje acklimatisering sessions hus djuren individuellt i nya burar med nytt strö, mat och vatten för 24 timmar för att motivera social interaktion.
- Record social interaktion följande dag 24 timmar efter djuren åtskilda.
- Ta träflis från apparaten, rent och desinficera med klordioxid, torka med isopropylalkohol för att kontrollera lukter, och ersätta flisen före sessionen.
- Placera en eller flera kameror för att registrera interaktionen. Position minst en kamera framför anordningen, så att speglarna på den bakre väggen av apparaten kan ge ett ytterligare perspektiv för analys.
- Hämta djur en i taget och håll djuret framför kameran så att de unika funktionerna i pälsmönstret kan noteras. Dessa identifiera egenskaper hospälsen kan användas för att skilja råttor under analysen snarare än konstgjord väg märkning djuren.
OBS: Eftersom många aspekter av gnagare social interaktion involverar doftsignaler och lukta partnern, varhelst möjligt införa främmande lukter bör undvikas. Long-Evans-råttor har typiskt någon egenskap hos pälsmönster som kan användas för att särskilja två givna djur. För andra stammar (t.ex. Sprague-Dawley) alternativa metoder såsom märkning svansen med en oparfymerad färgämne kan användas. Det är viktigt att inse att många beteenden av intresse riktas mot specifika mål (t.ex.., Snusas anogenital riktad nära svansroten, lekfulla attacker riktade mot nacken, eller aggressiva attacker riktade mot flankerna eller magen). Märkning djuren närmare spetsen av svansen långt från dessa mål av intresse rekommenderas. - Spela in video av den sociala interaktionen i minst 12 minuter.
- Övervaka djur för att slåss hela sessionen. Om möjligt, titta på djuren via en monitor eller fönstret så att försöksledaren är inte i rummet under sessionen.
OBS: Striderna har sällan observerats i studier med vuxna råttor, dock djuren bör övervakas under hela sessionen. Sessionen ska upphört om det är överdrivet slåss eller om det finns tecken på skada eller skada på ett djur.
- Behavioral kodning och analys.
- Identifiera följande beteenden av intresse enligt tidigare arbete med PAE 1,18. Kvantifiera varaktighet, frekvens och latens till första förekomsten av följande beteenden; brottning (inklusive pinning), boxning, krypa (korsning) över / under partnern, anogenital sniffar, andra sniffning av partnerns kropp (kropp sniffa), allogrooming (trimning av partnern), uppfödning, och sniffa / gräva i flisen . Exempel på varje beteende är illustrerad i videokomponenten i den här artikeln.
- Kvantifiera de sociala beteenden av intresse från videon. Skaffa frekvens, total varaktighet och latens till första instans för varje uppträdande av intresse.
OBS: Att få dessa åtgärder kan göras manuellt, men kvantifiering av dessa åtgärder med hjälp av datoriserade analyser av digitaliserad video rekommenderas. En Matlab (www.mathworks.com) manus för uppspelning av video och kvantifiering av beteenden ges som ett komplement till den här artikeln. - Efter kodning är klar för alla råttor resulterande varaktighet, frekvens och latens data analyseras med en statistisk paket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under loppet av många avels rundor honråttor i etanol villkoret konsekvent dricka i genomsnitt cirka 2,1 g / kg etanol per 4 tim dricksvatten session. Rat dammar förbrukar ungefär hälften av den fyra timmar totalt under de första 15 till 30 min efter införandet av dryckesrören, vilket resulterar i en topp moderns serum etanolkoncentration av ca 60 mg / dl, mätt vid 45 min tidpunkten. Över den återstående 3,5 h av dricksperioden, de fortsätter att konsumera 5% etanol vid en lägre, men relativt stabil hastighet av 0,4 g / kg kroppsvikt / timme. Denna nivå och mönster av frivilliga etanolkonsumtionen har inga signifikanta effekter på moderns viktökning, avkomma födelsevikt, kullstorlek, mödravård, placenta våtvikt, avkomma vikt vid beteendetester, eller hela hjärnan, hippocampus eller cerebellära våta vikter.
Representativa medel och SEM från manliga saccharin- och etanol exponerade råttor för varje beteende åtgärd are visas i tabell 1. Dessa data samlades från tidigare experiment och inkluderar 16 hanar för varje prenatal behandling skick. Alla djur var parat med partners från samma prenatal behandling skick. Robusta alkoholrelaterade förändringar i sociala beteende hondjur har inte observerats i våra studier med dessa förfaranden 1, dock alkoholrelaterade skillnader i kvinnliga socialt beteende har dokumenterats med hjälp av andra förfaranden 15,23. Separata univariata analyser av varians (ANOVA) utförs i SPSS ver. 21 för Macintosh avslöjade att manliga etanol exponerade råttor hade signifikant högre duration [F (1, 30) = 19.12] och frekvens [F (1, 30) = 6.80] i brottning och minskad latens till första instans av brottning [F ( 1, 30) = 9,41]. Etanol exponerade råttor bringade också mindre tid bedriver anogenital sniffar [F (1, 30) = 5,17].
| 1a. Frekvens | SÄCK | PAE |
| Brottning * | 2,00 (0,58) | 8,00 (2,23) |
| Boxning | 1,81 (0,80) | 3,56 (1,47) |
| Korsa över / under | 1,06 (0,48) | 1,00 (0,29) |
| Anogenital sniffning | 6,25 (1,20) | 3,75 (0,73) |
| Kropp Sniffning | 19,75 (1,64) | 18.56 (2,06) |
| Allogrooming | 2,31 (0,93) | 0,75 (0,27) |
| Uppfödning | 56,50 (5,39) | 56,06 (5,40) |
| Dig / Sniff Bedding | 32,06 (6,03) | 30,06 (5,27) |
| 1b. Varaktighet (sek) | SÄCK | PAE |
| Brottning ** | 9,14 (2,31) | 39,81 (6,62) |
| Boxning | 2,55 (1,43) | 3,81 (1,62) |
| Korsa över / under | 0,83 (0,39) | 1,03 (0,27) |
| Anogenital sniffning * | 11.21 (2.10) | 5,69 (1,22) |
| Kropp Sniffning | 27,21 (2,33) | 27,09 (3,73) |
| Allogrooming | 13,50 (5,68) | 3,82 (1,79) |
| Uppfödning | 120,31 (13,32) | 121,48 (12,13) |
| Dig / Sniff Bedding | 119,59 (24,45) | 109,15 (21,41) |
| 1c. Latens (sek) | SÄCK | PAE |
| Brottning ** | 430,75 (50,51) | 209,98 (51,25) |
| Boxning | 569,52 (48,14) | 525,63(74,75) |
| Korsa över / under | 544,4 (65,21) | 429,01 (75,78) |
| Anogenital sniffning | 107,68 (39,35) | 164,31 (44,09) |
| Kropp Sniffning | 22,77 (6,14) | 16,80 (3,21) |
| Allogrooming | 471,44 (70,82) | 588,52 (48,47) |
| Uppfödning | 20,92 (7,65) | 11,94 (1,20) |
| Dig / Sniff Bedding | 76,78 (25,78) | 117,66 (44,64) |
Tabell 1: Medelvärde (+ SEM) frekvens (1a), längd (1b) och latens till första förekomsten (1c) för varje beteende kvantifieras under social interaktion session för saccharin- (SAC) och prenatal alkoholexponerade (PAE) råttor ( n = 1 6 per prenatal behandlingsgrupp). [* P <0,05, ** p <0,005]
18. För föreliggande provet kunde Box M: s test till test för lika vari inte beräknas eftersom antalet oberoende variabler var större än antalet fall (en 5: 1-förhållande är typiskt rekommenderas). Diskriminantfunktionen visade ett signifikant samband mellan grupper och prediktorer, som står för 74% av mellan grupp variabilitet. En analys av strukturen matrisen visade att längden på brottning (0,470), och latens till första förekomsten av brottning (-0,330) var signifikanta prediktorer. Räknar (frekvens) av brottning (0,280) och varaktighet anogenital sniffar (-0,244) var något svagare prediktorer. Den tvär validerade klassificeringen visade att totalt sett, var 71,9% av fallen korrekt klassificerad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den prenatala alkohol exponering paradigm beskrivs här innebär frivillig konsumtion av etanol (5% v / v) med rått dammar under graviditeten. Det finns ett antal protokoll för att exponera icke-humana djur till etanol under hjärnans utveckling representeras i litteraturen, vilka skiljer sig med avseende på timing, dos, varaktighet och väg för etanol administration samt arten är föremål för undersökningen. Även om en grundlig behandling av fördelarna med olika exponerings protokollen inte finns här, flera fördelar med dricksmetod för PAE frivilliga beskrivs i detta protokoll markeras. Tidigare utnyttjade vi en flytande diet protokoll, ett tillvägagångssätt som vanligen används inom detta forskningsområde, där råtta dammar förbrukar 5% etanol som en del av den primära födokälla 24. Styrvillkor för att detta tillvägagångssätt innefattar ett par matad grupp, i vilken kaloriintaget var yoked till det av etanolkrävande dammar och en grupp som har ad libitum tillgångatt chow. I den frivilliga dricka paradigm beskrivs här rått dammar i båda grupperna (etanol och sackarin) konsumerar samma råttfoderdiet som minskar mellan grupp variabilitet i kost och kaloriintag, och minimerar potentiella FÖRVÄXLA av stress i samband med tvångs konsumtion av en obekant födokälla 25. Denna egenskap hos frivilliga drickande paradigmet eliminerar också behovet av ett par-fed kontroll som med flytande synsätt diet, som ger en del praktiska och etiska fördelar, inklusive minskningar i antalet försöksgrupper (från tre till två), antalet djur som används i forskningen, och de tillhörande kostnaderna för att utföra forskningen. Den 4 tim intermittent exponering mönster av frivilliga etanolkonsumtion avkastning mindre rörliga dryckesnivåer än observerats med 5% etanol flytande kost-protokollet, som rimligen kan förväntas på liknande minska variationen i utfallsmått som observerats i PAE avkomma. Eftersom blodetanol concentrations uppnås med alla protokoll är viktigt att kvantifiera och kommunicera, mätningar av maternal serumetanolkoncentrationerna bör utföras regelbundet (t.ex. årligen) för att säkerställa att jämförbara BAC har uppnåtts över avels rundor. På grund av risken för interaktioner mellan prenatal stress och etanolexponering dessa åtgärder bör utföras i en separat kohort av honor som avkomman inte används i efterföljande studier (se ref. 26). Det är viktigt att inse att toppserumetanolkoncentrationer kommer att uppträda ungefär 45-60 min efter dricksröret införs. I stället för BAC från dammarna producerar experimentella avkomma, är det mest användbart mått för att korrelera med utfallsmått en råtta damm dagliga etanolkonsumtion under graviditeten. Men begränsa utbudet av drickande i rått dammar till inom en standardavvikelse av medelvärdet för gruppen skulle sannolikt begränsar någon meningsfull korrelation between etanol förbrukas och en given effektmått. Slutligen är utvärdering av före graviditeten drickande utnyttjas för att identifiera råttor som dricker på önskade nivåer för senare faser av dricks protokollet. Denna aspekt av etanolexponerings paradigmet säkerställer också att alla honråttor har erfarenhet dricka innan graviditeten, som bättre modeller mänskligt beteende i att drickandet är osannolikt att påbörjas under graviditet.
Flera ytterligare metodfrågor och varningar i samband med alkoholexponeringen paradigm bör övervägas. Den frivilliga dricka PAE paradigm beskrivs här förekommer i hela graviditetsutveckling, vilket i råtta motsvarar ungefär de två första trimestrar graviditetsutveckling hos människor. Exponering under tidig postnatal utveckling används av många laboratorier att modellera tredje trimestern mänsklig likvärdighet (se t.ex., ref. 27). Vidare kan vi konstatera att de förfaranden som presenteras här utgör en kroniskexponeringsprotokoll (råtta dammar dricker varje dag). Viktigt exakt tidsinställda exponering för högre nivåer av alkohol (~ 287 mg / dl) begränsad till graviditets dag 15 har också visat att förändra socialt beteende 15. Paradigm presenteras här innebär frivillig alkoholkonsumtion råtta dammar, därför finns det ett begränsat antal blodetanolkoncentrationer som kan uppnås med denna metod. Att uppnå högre blodetanolkoncentrationer kräver andra metoder för exponering (t.ex. sondmatning, injektion, ånga exponering). En ytterligare viktig punkt gäller potential för förändringar i mödravård som kan komplicera tolkningen av beteendeeffekter förknippade med prenatal etanol exponering. För att lösa detta, bör bedömningar av mödravård under graviditeten utvärderas regelbundet. Inga effekter av måttlig alkoholkonsumtion under graviditeten på mödravård har upptäckts med hjälp av de förfaranden som beskrivs här i Long-Evans råttan 28. Utvärdering av huruvidaförändringar i beteende indikatorer på mödravård (se ref. 29), dock bör utvärderas initialt och därefter regelbundet, särskilt om avvikelser från de metoder som beskrivs här, inklusive art och stam av djur, eller högre koncentrationer av etanol utnyttjas.
De beteende förfaranden som beskrivs här har gett tillförlitliga förändringar i särskilda aspekter av socialt beteende (brottning och utredning) hos vuxna råttor av hankön som utsätts för måttliga nivåer av alkohol under foster hjärnans utveckling 1,18,30. De beteenden kvantifierade här valdes utifrån en stor mängd existerande litteratur 31 att rikta partnerstyrda beteenden (t.ex. brottning, utrednings) och andra beteenden riktade mot miljön (t.ex., uppfödning, gräva) som lätt kan mätas med hjälp av videoanalys. Discriminant analyser visade att ökningar i brottning ge bästa diskriminering mellan alhol-exponerade och sackarin-exponerade råttor bland ett brett utbud av sociala och icke-sociala beteendevariabler 18. Det är viktigt att påpeka att effekterna av PAE på socialt beteende hos honråttor inte har observerats med hjälp av de metoder som beskrivs här 1, även om huvud effekter av kön har rapporterats i flera beroende åtgärder, inklusive anogenital sniffa (hona> hane), kropp sniffar (hane> hona), brottning (hane> hona), och boxning (hane> hona).
Även brottning har visat sig vara den primära aspekten av socialt beteende förändras av måttliga PAE är viktigt för att fastställa selektivitet beteendeeffekter och utesluter generbeteendestörningar att andra beteenden. Den uppsättning beteenden kvantifierade här är på intet sätt uttömmande. Beteenden av intresse bör väljas under förarbete för att fånga det övergripande mönstret av effekter som observerats i en given uppsättning data. Detta är parskilt viktigt om olika alkoholexponerings paradigm, eller parametrar, används som variationer i förfaranden rimligen kan förväntas ge olika beteende utfall. Förutom de beteenden som beskrivs här, initialt utvärdera en bredare uppsättning beteenden inklusive bita, skrapa (själv), fulla grooming sekvenser, stympade grooming sekvenser (vägledande av ångest), "lateral" display 32,33, skakar kropp, jaga, och lekbeteende 34-37 rekommenderas. Observation i 6-12 par djur bör vara tillräckligt för att identifiera beteenden som skiljer alkoholexponerade från icke-exponerade djur.
Det är också viktigt att beakta att brottning, beroende på ålder vid tidpunkten för mätningen, skulle återspegla verkliga aggressivt beteende eller spela beteende. Tidiga skador på ventrolaterala frontala cortex hos råttor, som har kopplats till måttlig PAE effekter på socialt beteende 1,18,30, resultera i ökat sjsed lekbeteende 38. I råtta, spela beteendetoppar under efter avvänjning utveckling kring postnatal dagar 30-40 33,34 och avtar som djur närmar vuxen ålder. Alkohol exponering under hjärnans utveckling förändrar spelbeteende mätt före vuxen ålder 6,16,23 och kan påverka i vilken takt spelar beteendet minskar med åldern. Eftersom kretsmönster i lek och aggressiva beteenden liknar en tydlig skillnad kan vara svårt att uppnå. I tidigare studier, iögonfallande beteendeindikatorer aggression, såsom konflikter eller bitande, inte har iakttagits i måttliga PAE råttor. Däremot kan ytterligare beteende indikatorer ger ledtrådar om klassificering av dessa beteenden 18. Till exempel, attacker riktade mot nacken, det primära målet för lekfulla attacker, sällan inträffar hos vuxna PAE råttor 18. Däremot attacker riktade mot rumpan, ett mål av icke-lekfulla attacker 39 observerades more ofta, vilket tyder på att PAE-relaterade ökningar i brottning reflekterar aggression snarare än spel. Lekbeteende bör ingå i analysen om socialt beteende mäts före vuxen ålder eller spela beteende är iögonfallande i beteendet hos vuxna djur. Detaljerade metoder för analys av spelbeteende beskrivs av Himmler et al. 35
Slutligen är det viktigt att notera att socialt beteende med användning av de metoder som beskrivs här kan påverkas genom valet av partner djuret. I representativa resultat som presenteras här djuren parade med välbekanta djur (bur-mates) från samma prenatal behandling skick 1,18. Skälet till detta val baserades till stor del på uppgifter som visar att bostadskontrolldjur med etanol exponerade råttor förändrar socialt beteende hos kontrollråttor 14, liksom liknande och pålitliga opublicerade observationer från vårt laboratorium. Dessa effekter kan potentiellt complicåt identifiering av och tolkning av PAE-relaterade förändringar i socialt beteende. De metoder som beskrivs här för kvantifiering av socialt beteende kan dock tillämpas på någon variant av källan till arbetsmarknadens parter, av vilka det finns flera möjligheter, inklusive användning av en icke-behandlad partner som kommer från varken behandlingstillstånd 1, med hjälp av en partner djur från samma behandlingstillstånd (som beskrivs här), eller en partner djur från en annan behandlingstillstånd. Vidare kan förtrogenhet partner djuret manipuleras för att påverka social interaktion 1. Valet av partner skick och andra variabler som rör subventionerat boende, kön och exponeringsparadigm kan skräddarsys för att bäst uppfylla de vetenskapliga målen för särskilda laboratorium samtidigt utnyttjar de grundläggande förfaranden för kvantifiering av socialt beteende som beskrivs här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saccharin sodium salt hydrate | Sigma | S1002 | |
| 190 proof ethanol | Sigma | 493538 | |
| Beaded glass drinking tubes | Fisher | 14-955K | |
| Natural rubber white #4 stopper one hole | Plasticoid | LSG4M181 | |
| 1" bend tubes-ball point | Ancare | TD-199-3" | |
| Paper rulers | N/A | N/A | www.vendian.org/mncharity/dir3/paper_rulers |
| Apparatus for social interaction | Custom built | N/A | 95 cm X 47 cm X 43 cm |
| Video cameras | N/A | N/A | Capable of recording low/no light conditions |
| Infrared illuminators | Vitek | VT-IR1-12 | |
| Teklad laboratory grade sani-chips | Harlan | 7090A | |
| Brush and dustpan | N/A | N/A | |
| Isopropyl alcohol | Sigma | W292907 | |
| Chlorine Dioxide (1.5 mg Tablets) | Quiplabs | N/A | Prepare per manufacturer's recommendation |
References
- Hamilton, D. A., et al. Prenatal exposure to moderate levels of ethanol alters social behavior in adult rats: Relationship to structural plasticity and immediate early gene expression in frontal cortex. Behav. Brain Res. 207 (2), 290-304 (2010).
- May, P. A., et al. Approaching the prevalence of the full spectrum of Fetal Alcohol Spectrum Disorders in a South African population-based study. Alcohol. Clin. Exp. Res. 37 (5), 818-830 (2013).
- Chasnoff, I. J., Wells, A. M., Telford, E., Schmidt, C., Messer, G. Neurodevelopmental functioning in children with FAS, pFAS, and ARND. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 31 (3), 192-201 (2010).
- Disney, E. R., Iacono, W., McGue, M., Tully, E., Legrand, L. Strengthening the case: Prenatal alcohol exposure is associated with increased risk for conduct disorder. Pediatrics. 122 (6), E1225-E1230 (2008).
- Kelly, S. J., Goodlett, C. R., Hannigan, J. H. Animal models of fetal alcohol spectrum disorders: Impact of the social environment. Dev Disabil Res Rev. 15 (3), 200-208 (2009).
- Kelly, S. J., Day, N., Streissguth, A. P. Effects of prenatal alcohol exposure on social behavior in humans and other species. Neurotoxicol. Teratol. 22 (2), 143-149 (2000).
- Thomas, S. E., Kelly, S. J., Mattson, S. N., Riley, E. P. Comparison of social abilities of children with fetal alcohol syndrome to those of children with similar IQ scores and normal controls. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 22 (2), 528-533 (1998).
- Conry, J. Neuropsychological deficits in Fetal Alcohol Syndrome and fetal alcohol effects. Alcohol. Clin. Exp. Res. 14 (5), 650-655 (1990).
- Streissguth, A. P., et al. Fetal Alcohol Syndrome in adolescents and adults. JAMA-Journal of the American Medical Association. 265 (15), 1961-1967 (1991).
- Streissguth, A. P., Barr, H. M., Sampson, P. D. Moderate prenatal alcohol exposure: effects on child IQ and learning problems at age 7 1/2 years. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 14 (5), 662-669 (1990).
- Valenzuela, C. F., Morton, R. A., Diaz, M. R., Topper, L. Does moderate drinking harm the fetal brain? Insights from animal models. Trends Neurosci. 35 (5), 284-292 (2012).
- May, P. A., et al. Prevalence of children with severe Fetal Alcohol Spectrum Disorders in communities near Rome, Italy: New estimated rates are higher than previous estimates. Int. J. Env. Res. Public Health. 8 (6), 2331-2351 (2011).
- Tunc-Ozcan, E., Ullmann, T. M., Shukla, P. K., Redei, E. E. Low-dose thyroxine attenuates autism-associated adverse affects of fetal alcohol in male offspring's social behavior and hippocampal gene expression. Alcohol. Clin. Exp. Res. 37 (11), 1986-1995 (2013).
- Middleton, F. A., Varlinskaya, E. I., Mooney, S. M. Molecular substrates of social avoidance seen following prenatal ethanol exposure and its reversal by social enrichment. Dev. Neurosci. 34 (2-3), 115-128 (2012).
- Varlinskaya, E. I., Mooney, S. M. Acute exposure to ethanol on gestational day 15 affects social motivation of female offspring. Behav. Brain Res. 261, 106-109 (2014).
- Meyer, L. S., Riley, E. P. Social play in juvenile rats prenatally exposed to alcohol. Teratology. 34 (1), 1-7 (1986).
- Royalty, J. Effects of prenatal ethanol exposure on juvenile play-fighting and postpubertal aggression in rats. Psychol Rep. 66 (2), 551-560 (1990).
- Hamilton, D. A., et al. Effects of moderate prenatal ethanol exposure and age on social behavior, spatial response perseveration errors and motor behavior. Behav. Brain Res. 269, 44-54 (2014).
- Kelly, S. J., Dillingham, R. R. Sexually dimorphic effects of perinatal alcohol exposure on social interactions and amygdala DNA and DOPAC concentrations. Neurotoxicol. Teratol. 16 (4), 377-384 (1994).
- Lugo, J. N., Marino, M. D., Cronise, K., Kelly, S. J. Effects of alcohol exposure during development on social behavior in rats. Physiology and Behavior. 78 (2), 185-194 (2003).
- Lugo, J. N., Marino, M. D., Gass, J. T., Wilson, M. A., Kelly, S. J. Ethanol exposure during development reduces resident aggression and testosterone in rats. Physiology and Behavior. 87 (2), 330-337 (2006).
- Kelly, S. J., Tran, T. D. Alcohol exposure during development alters social recognition and social communication in rats. Neurotoxicol. Teratol. 19 (5), 383-389 (1997).
- Mooney, S. M., Varlinskaya, E. I. Acute prenatal exposure to ethanol and social behavior: Effects of age, sex, and timing of exposure. Behav. Brain Res. 216 (1), 358-364 (2011).
- Savage, D. D., Becher, M., de la Torre, A. J., Sutherland, R. J. Dose-dependent effects of prenatal ethanol exposure on synaptic plasticity and learning in mature offspring. Alcohol. Clin. Exp. Res. 26 (11), 1752-1758 (2002).
- Rasmussen, D. D., et al. Chronic daily ethanol and withdrawal: 1. Long-term changes in the hypothalamo-pituitary-adrenal axis. Alcohol. Clin. Exp. Res. 24 (12), 1836-1849 (2000).
- Savage, D. D., et al. Effects of a Novel Cognition-Enhancing Agent on Fetal Ethanol-Induced Learning Deficits. Alcohol. Clin. Exp. Res. 34 (10), 1793-1802 (2010).
- Goodlett, C. R., Johnson, T. B. Neonatal binge ethanol exposure using intubation: Timing and dose effects on place learning. Neurotoxicol. Teratol. 19 (6), 435-446 (1997).
- Staples, M. C., Rosenberg, M. J., Allen, N. A., Porch, M. W., Savage, D. D. Impact of Combined Prenatal Ethanol and Prenatal Stress Exposure on Anxiety and Hippocampal-Sensitive Learning in Adult. 37 (12), 2039-2047 (2013).
- Champagne, F. A., Francis, D. D., Mar, A., Meaney, M. J. Variations in maternal care in the rat as a mediating influence for the effects of environment on development. Physiol. Behav. 79 (3), 359-371 (2003).
- Hamilton, D. A., et al. Patterns of social-experience-related c-fos and Arc expression in the frontal cortices of rats exposed to saccharin or moderate levels of ethanol during prenatal brain development. Behav. Brain Res. 214 (1), 66-74 (2010).
- Barnett, S. A. A study in behaviour: Principles of ethology and behavioural physiology displayed mainly in the rat. , (1963).
- Pellis, S. M., Pellis, V. C. Play-fighting differs from serious fighting in both target of attack and tactics of fighting in the laboratory rat Rattus-Norvegicus. Aggressive Behav. 13 (4), 227-242 (1987).
- Meaney, M. J., Stewart, J. A descriptive study of social-development in the rat (Rattus-Norvegicus). Anim. Behav. 29 (1), 34-45 (1981).
- Pellis, S. M., Pellis, V. C. The prejuvenile onset of play fighting in laboratory rats (Rattus norvegicus). Dev. Psychobiol. 31 (3), 193-205 (1997).
- Himmler, B. T., Pellis, V. C., Pellis, S. M. Peering into the dynamics of social interactions: measuring play fighting in rats. J. Vis. Exp. (71), e4288-e4288 (2013).
- Panksepp, J., Siviy, S., Normansell, L. The psychobiology of play : Theoretical and methodological perspectives. Neurosci. Biobehav. Rev. 8 (4), 465-492 (1984).
- Siviy, S. M., Panksepp, J. Sensory modulation of juvenile play in rats. Dev. Psychobiol. 20 (1), 39-55 (1987).
- Pellis, S. M., et al. The effects of orbital frontal cortex damage on the modulation of defensive responses by rats in playful and nonplayful social contexts. Behav. Neurosci. 120 (1), 72-84 (2006).
- Blanchard, R. J., Blanchard, D. C., Takahashi, T., Kelley, M. J. Attack and defensive behavior in albino-rat. Anim. Behav. 25 (3), 622-634 (1977).
