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Developmental Biology

एक सह-संस्कृति प्रणाली में neuronal कनेक्शन के गठन का आकलन करने के लिए एक optogenetic दृष्टिकोण

Published: February 17, 2015 doi: 10.3791/52408
* These authors contributed equally

Introduction

हाल के वर्षों में, न्यूरॉन और neuronal सर्किट समारोह के बारे में हमारी समझ neuronal excitability कि नियंत्रण कई optogenetic उपकरण द्वारा क्र ांतिकारी परिवर्तन किया गया है। ऐसा ही एक उपकरण प्रकाश सक्रिय कटियन चैनल है, channelrhodopsin-2 (ChR2): प्रकाश उत्तेजना 1-3 के जवाब में ChR2 आग कार्रवाई क्षमता व्यक्त न्यूरॉन्स। न्यूरॉन्स रोशनी करने के लिए आमतौर पर संवेदनशील नहीं होते हैं, क्योंकि यह उल्लेखनीय क्षमता न्यूरॉन्स 4 की आनुवंशिक रूप से परिभाषित आबादी की गतिविधि के सटीक अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण के लिए नए रास्ते खुल जाता है और बहुत मस्तिष्क समारोह के अध्ययन में तेजी आई है। ChR2 तंत्रिका नेटवर्क 6 की गतिविधि को विनियमित करने के लिए neuronal विकास 5 की निगरानी से, विभिन्न प्रयोजनों के लिए स्टेम सेल शोध के लिए लागू किया गया है।

यहाँ हम एक neuronal सह संस्कृति प्रणाली की उपयोगिता बढ़ाने के लिए ChR2 इस्तेमाल किया। सह संस्कृति प्रणालियों विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच बातचीत का आकलन कर सकें।न्यूरॉन्स और glia के सह संस्कृतियों, तंत्रिका तंत्र के मुख्य प्रकार की कोशिकाओं, आमतौर पर इन विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच संकेत जांच करने के लिए, साथ ही शारीरिक प्रतिक्रियाओं के लिए इस संकेतन के महत्व का मूल्यांकन करने, क्षति के प्रचार-प्रसार और जांच करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं संभवतः इस सात संकेत में शामिल कर रहे हैं कि आणविक तंत्र। पिछले एक अध्ययन मानव IPSCs चूहे कॉर्टिकल प्राथमिक संस्कृति युक्त न्यूरॉन्स, astrocytes, oligodendrocytes, और microglia 8 की उपस्थिति में न्यूरॉन्स में बहुत जल्दी में अंतर का पता चला।

इस प्रोटोकॉल में, हम मानव प्रेरित स्टेम कोशिकाओं (IPSCs) से ली गई चूहा cortical न्यूरॉन्स और न्यूरॉन्स के बीच synaptic कनेक्शन से पूछताछ करने के लिए एक सह संस्कृति प्रणाली में ChR2 इस्तेमाल करता है कि एक विधि प्रदर्शित करता है। हम astrocytes में काटना करने के लिए कदम और फसल मस्तिष्क के ऊतकों 9 के साथ ही माउस तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं को बनाए रखने और अलग करने के लिए (NPCs) का वर्णन है और मानव NPCs के intओ न्यूरॉन्स सह संस्कृति प्रणाली बनाने के लिए। इस सह-संस्कृति प्रणाली स्थापित करने के लिए, हम Okita एट अल द्वारा वर्णित एकीकरण मुक्त reprogramming विधि का इस्तेमाल किया। 10 मानव IPSCs उत्पन्न करने के लिए। ली एट अल द्वारा वर्णित के रूप में इन IPSCs फिर कुशलता से छोटे अणु अवरोधकों का उपयोग कर रासायनिक परिभाषित स्थितियों में NPCs में भेदभाव कर रहे थे। 11

सह-संस्कृतियों में, न्यूरॉन्स के विभिन्न आबादी टमाटर (tdTomato) डिमर फ्लोरोसेंट प्रोटीन, मिलकर माध्यम IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की cortical न्यूरॉन्स में ChR2 अभिव्यक्ति का पता लगाने और टैगिंग के माध्यम से पहचाना जा सकता है। Cortical न्यूरॉन्स की optogenetic photostimulation साथ IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स से electrophysiological रिकॉर्डिंग के संयोजन एक दूसरे के साथ सर्किट के लिए फार्म न्यूरॉन्स के इन दो प्रकार की क्षमता के आकलन के लिए अनुमति देता है। विशेष रूप से, cortical न्यूरॉन्स ChR2 व्यक्त की photostimulation अन्तर्ग्रथनी सर्किट का गठन किया है कि IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में synaptic प्रतिक्रियाओं का आह्वानphotostimulated cortical न्यूरॉन नेटवर्क के साथ। हम वृद्धि हुई पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं वास्तव में इस तरह की स्थितियों के तहत IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में पता चला रहे हैं कि प्रदर्शित करता है। इस प्रोटोकॉल रोग के रोगियों से fibroblasts से व्युत्पन्न IPSCs का उपयोग करके विभिन्न न्यूरोलॉजिकल बीमारी मॉडलों की आवृत्ति सहित प्रयोगात्मक शर्तों, की एक किस्म के तहत synaptic circuitry के मूल्यांकन की अनुमति देता है।

Protocol

नोट: सभी प्रयोगों SingHealth में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है।

1. कटाई जल्दी प्रसव के बाद माउस दिमाग

  1. 1 मिलीलीटर 1x अर्ल बैलेंस्ड नमक समाधान (EBSS) (1% HEPES) Deoxyribonuclease मैं के साथ (DNase मैं) (250 यू / एमएल) और Dispase द्वितीय (1 यू / प्रति 10 μl papain: विच्छेदन से पहले, हिप्पोकैम्पस ऊतक पाचन समाधान तैयार एमएल)। ऊतक पाचन समाधान के लगभग 2.5 मिलीलीटर बनाओ और एक .20 माइक्रोन फिल्टर यूनिट का उपयोग कर इसे फिल्टर। उपयोग करें जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान गर्म रखें।
  2. 5 मिनट के लिए बर्फ में उन्हें डालने से प्रसव के बाद दिन 5 (पी -5) चूहों पिल्ले anesthetize। पैर की अंगुली या पूंछ चुटकी के माध्यम से दर्द पलटा के लिए बर्फ और परीक्षण से निकालें। 70% इथेनॉल के साथ पिल्ले स्प्रे। पिल्ले सिर काटना और बर्फ पर एक पेट्री डिश में सिर जगह है।
  3. छोटे scisso की एक जोड़ी के साथ, नाक के लिए खोपड़ी के आधार से, midline के साथ त्वचा में एक चीरारुपये या ठीक विदारक संदंश। पील त्वचा को खोलने और खोपड़ी के माध्यम से एक समान चीरा बनाते हैं। खोपड़ी के प्रत्येक पक्ष पर दो अतिरिक्त क्षैतिज कटौती, (शीर्षस्थान पर) एक व्याख्यान चबूतरे वाला और (लैम्ब्डा पर) एक दुम बनाओ।
  4. पील अंतर्निहित मस्तिष्क को बेनकाब करने के छिन्न पंक्तियों के साथ खोपड़ी खुला। घ्राण बल्ब overlying खोपड़ी, और उन दोनों के बीच किसी भी midline के हड्डी को दूर करने के संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। गैर-विदारक हाथ में संदंश की एक जोड़ी के साथ स्थिर सिर पकड़ जबकि यह मत करो।
  5. मस्तिष्क के उदर भाग और दुम अंत में खोपड़ी के आधार के बीच एक रंग के फ्लैट हिस्से आसानी। मस्तिष्क के तहत खोपड़ी के आधार करने के लिए रंग समानांतर ध्यान में रखते हुए, मस्तिष्क और खोपड़ी के आधार के बीच किसी भी adhesions तोड़ खोपड़ी के व्याख्यान चबूतरे वाला अंत की दिशा में यह कदम।
    1. रंग के साथ मस्तिष्क बाहर निकालना और ठंडा 1x EBSS (1% HEPES) युक्त एक पेट्री डिश में जगह है। सभी समय पर जलमग्न ऊतकों रखें।
  6. सभी के लिएमाइक्रो-विच्छेदन कदम, एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत काम करते हैं और एक हाथ में ठीक विदारक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें, ऊतक को काटने के लिए एक, और स्थिर ऊतक के आयोजन के लिए अन्य।
  7. एक कट सिर्फ hindbrain से अलग करने के लिए सेरेब्रल कॉर्टेक्स के पीछे बनाओ। इसके दो गोलार्द्धों में सेरेब्रल कॉर्टेक्स को अलग करने के midline के साथ काटें। मस्तिष्क गोलार्द्धों से तानिका निकालें।
  8. एक गोलार्द्ध औसत दर्जे का पक्ष प्लेस और हिप्पोकैम्पस के नीचे पार्श्व वेंट्रिकल में संदंश डालें। मध्यमस्तिष्क दूर काटें।
    1. हिप्पोकैम्पस के बेहतर और अवर सिरों पर कटौती करें, और दांतेदार / entorhinal प्रांतस्था जंक्शन के पास कॉर्टेक्स से हिप्पोकैम्पस अलग करने के लिए। ठंडा 1x EBSS (1% HEPES) युक्त एक थाली में हिप्पोकाम्पी लीजिए।

2. Hippocampal ऊतक हदबंदी

  1. पूर्व गर्म हिप्पोकैम्पस ऊतक पाचन समाधान युक्त एक डिश के लिए हिप्पोकाम्पी स्थानांतरण। कीमा टीवह संभव के रूप में के रूप में ठीक करने के ऊतकों हिप्पोकैम्पस और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  2. धीरे से एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में यांत्रिक pipetting और हस्तांतरण कोशिकाओं द्वारा एकल कक्षों में ऊतकों को अलग कर देना।
  3. 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  4. 20 मिलीलीटर में Resuspend सेल गोली 10 मिनट के लिए 200 XG पर सुक्रोज (0.9 एम) और सेंट्रीफ्यूज युक्त हांक संतुलित नमक समाधान (HbSS) 0.5x।
  5. एनपीसी रखरखाव मध्यम (तालिका 1) के 2 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली निकालें, 5 मिनट के लिए 200 XG पर 1X EBSS समाधान और अपकेंद्रित्र में 4% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के 10 एमएल के शीर्ष पर रखा।
  6. सतह पर तैरनेवाला निकालें और सेल गोली करने के लिए माउस एनपीसी रखरखाव मध्यम (तालिका 1) जोड़ें। धीरे ऊपर पिपेट और 5-10 बार नीचे सेल गोली एकल कक्षों में टूट रहा है यह सुनिश्चित करने के लिए।
  7. पूर्व लेपित Matrigel प्लेटों में मध्यम युक्त कोशिकाओं स्थानांतरण और epidermal वृद्धि कारक (EGF) और fibrobla जोड़नेहेपरिन में सेंट वृद्धि कारक 2 (FGF2) (दोनों 20 एनजी / एमएल) (5 मिलीग्राम / एमएल)। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 प्लेटें सेते हैं।

पक्षपाती माउस hippocampal NPCs के 3. रखरखाव

  1. कम से कम एक घंटे पूर्व passaging के माउस हिप्पोकैम्पस NPCs के लिए लेपित प्लेटें / बोतल तैयार करें। प्रत्येक थाली या कुप्पी की सतह क्षेत्र को कवर किया और एक घंटा के लिए कमरे के तापमान पर सेते करने के लिए पर्याप्त Matrigel जोड़ें।
  2. 90% मिला हुआ माउस एनपीसी संस्कृतियों से मीडिया निकालें और फिर पीबीएस बंद महाप्राण 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ एक बार धो लें।
  3. सभी कुओं / बोतल को कवर किया और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते करने के लिए पर्याप्त सेल टुकड़ी समाधान जोड़ें।
  4. सभी कोशिकाओं 10X बढ़ाई पर एक औंधा उज्ज्वल क्षेत्र खुर्दबीन के नीचे देख कर अलग कर दिया है कि यह सुनिश्चित करें। अभी भी जुड़ी कोशिकाओं रहे हैं, तो एक और 1-2 मिनट के लिए संस्कृति पोत सेते हैं और फिर कोशिकाओं की जाँच करें। Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम / हाम एफ-12 पोषक तत्व मिश्रण से दुगुना जोड़ें (DMEM / एफ-12)वेल्स को सेल टुकड़ी के समाधान के रूप में है कि / बोतल एक बार सभी कोशिकाओं को अलग किया।
  5. 5 मिनट के लिए 200 XG पर एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में DMEM / एफ -12 युक्त कोशिकाओं स्थानांतरण।
  6. माउस एनपीसी रखरखाव मध्यम (तालिका 1) के 5 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली निकालें। धीरे एकल कक्षों में सेल गोली को तोड़ने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट और।
  7. EGF और FGF2 के साथ पूरक नई संस्कृति कुओं / बोतल और ऊपर पर्याप्त संस्कृति माध्यम में कुल कोशिकाओं का एक तिहाई थाली। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में संस्कृति वाहिकाओं को सेते हैं। 3 हर 3 से 4 दिन: मध्यम हर दूसरे दिन और विभाजित कोशिकाओं एक भरपाई होगी। एकत्रीकरण और टुकड़ी को रोकने के लिए माउस एनपीसी संस्कृतियों के अतिवृद्धि से बचें।

Astrocytes में माउस NPCs के 4. भेदभाव

  1. Astrocytes में माउस NPCs के भेदभाव की शुरुआत से पहले अग्रिम में पाली-एल Lysine (पीएलएल) / laminin लेपित 12 मिमी कवर चश्मा में कम से कम एक दिन की तैयारी। Cov जोड़ें24 अच्छी तरह से थाली में erslips और पर्याप्त पीएलएल (borate बफर में 1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ कुओं की पूरी सतह क्षेत्र को कवर किया।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात थाली सेते हैं। अगले दिन, पीएलएल को हटाने और 1x पीबीएस के साथ एक बार धो लें।
  2. फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 4 घंटे के लिए सेते हैं, फिर से अच्छी तरह से प्रत्येक की पूरी सतह क्षेत्र को कवर, (बर्फ ठंड DMEM / एफ-12 में 1 मिलीग्राम / एमएल) laminin जोड़ें।
  3. माउस एनपीसी संस्कृतियों से मीडिया निकालें और फिर पीबीएस बंद महाप्राण 1x पीबीएस के साथ एक बार धो लें।
  4. सभी कुओं / बोतल को कवर किया और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते करने के लिए पर्याप्त सेल टुकड़ी समाधान जोड़ें।
  5. सभी कोशिकाओं तो अलग DMEM / एफ-12 कुओं / बोतल के लिए सेल टुकड़ी समाधान के रूप में की दो बार राशि जोड़ है कि सुनिश्चित करें।
  6. 5 मिनट के लिए 200 XG पर एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में DMEM / एफ -12 युक्त कोशिकाओं स्थानांतरण।
  7. 5 मिलीलीटर अस्थिकणिका भेदभाव मध्यम (तालिका 1) में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं को निकाल दें। धीरे पिपेट सेल suspensioएन ऊपर और नीचे एकल कक्षों में सेल गोली को तोड़ने के लिए। एक hemocytometer के साथ एकल कक्षों की संख्या की गणना।
  8. 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं / सेमी 24 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से मध्यम 2 500 में μl पर प्लेट कोशिकाओं। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 प्लेटें सेते हैं। हर दूसरे दिन ताजा माध्यम के साथ मध्यम के आधे बदलें। माउस NPCs के तेजी से 2 दिनों के भीतर astrocytes में अंतर है और आगे के प्रयोगों के शुरू होने से पहले एक सप्ताह के लिए भेदभाव कर रहे हैं।

5. फसल काटने भ्रूण चूहे के दिमाग और cortical ऊतक हदबंदी

  1. अस्थिकणिका संस्कृतियों से अस्थिकणिका भेदभाव मध्यम (तालिका 1) निकालें और प्राथमिक न्यूरॉन मध्यम (तालिका 1) भ्रूण चूहे के दिमाग की फसल शुरू करने से पहले कम से कम 4 घंटा के साथ बदलें।
  2. 12.1 मिलीग्राम / एमएल एल सिस्टीन साथ 1 मिलीलीटर 1x EBSS (1% HEPES) प्रति papain 10 μl: विच्छेदन से पहले, cortical ऊतक पाचन समाधान तैयार है। लगभग 2 बनाओ0.5 ऊतक पाचन समाधान के मिलीलीटर और एक .20 माइक्रोन फिल्टर यूनिट का उपयोग कर इसे फिल्टर। उपयोग करें जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान गर्म रखें।
  3. संकुचित गैस के प्रयोग से कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation द्वारा गर्भवती बांध euthanize। पैर की अंगुली या पूंछ चुटकी के माध्यम से दर्द पलटा के लिए टेस्ट।
  4. एक शोषक पैड पर पशु उदर पक्ष रखना और 70% इथेनॉल के साथ अपने पेट क्षेत्र सोख। पेट को बेनकाब करने के लिए पर्याप्त चौड़ी, संदंश की एक जोड़ी के साथ त्वचा चुटकी और शल्य कैंची की एक जोड़ी के साथ एक पार्श्व चीरा बनाते हैं। संदंश के साथ पेरिटोनियम समझ और उदर गुहा खोलने में कटौती।
  5. संदंश के साथ गर्भाशय सींग उठा और mesometrium साथ यह मुफ्त में कटौती। बर्फ पर एक पेट्री डिश में विच्छेदित गर्भाशय रखें। उन दोनों के बीच गर्भाशय ऊतक काटने से प्रत्येक भ्रूण अलग करें।
    1. भ्रूण थैली में एक चीरा बनाओ। धीरे खोलने के माध्यम से भ्रूण बाहर खोल। भ्रूण सिर काटना और बर्फ पर एक पेट्री डिश में सिर जगह है।
  6. Embryon फसल के लिएआईसी चूहे के दिमाग, कदम 1.3-1.5 से वर्णन का पालन करें।
    1. , कोर्टिकल ऊतकों काटना एक मस्तिष्क गोलार्द्ध पार्श्व तरफ ऊपर जगह है। बीच में से पार्श्व दो में गोलार्द्ध काटें। मस्तिष्क के आधार पर आधा करीब त्यागें। मध्यमस्तिष्क दूर करने के लिए excised ऊतक ट्रिम।
  7. पूर्व गर्म cortical ऊतक पाचन समाधान युक्त एक डिश के लिए कॉर्टिकल ऊतकों स्थानांतरण। संभव के रूप में के रूप में ठीक करने के लिए cortical ऊतकों कीमा और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  8. पूर्व गर्म प्राथमिक न्यूरॉन मध्यम (तालिका 1) 10 मिलीग्राम से युक्त एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब ऊतक पाचन समाधान से कॉर्टिकल ऊतकों स्थानांतरण। कोई ऊतक टुकड़े के साथ एक समरूप समाधान प्राप्त किया जाता है, जब तक एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट में बार-बार उन्हें और नीचे pipetting द्वारा कोर्टिकल ऊतकों अलग कर देना।
  9. शेष ऊतक clumps के बाहर फिल्टर करने के लिए एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से ऊतक समाधान गुजरती हैं। 15 मिलीलीटर में ऊतक समाधान विभाज्यप्रत्येक ट्यूब में लगभग 3 मिलीलीटर जोड़ने अपकेंद्रित्र ट्यूब,।
  10. तल पर शीर्ष और बीएसए पर ऊतक समाधान के साथ दो परतों के गठन, प्रत्येक ट्यूब के नीचे करने के लिए 1x पीबीएस में 800 μl 7.5% बीएसए जोड़ें।
  11. 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र। दो परतों के इंटरफ़ेस से aspirating, सतह पर तैरनेवाला निकालें। ट्यूब के नीचे सेल गोली परेशान करने से बचें।
  12. 1 मिलीलीटर में प्राथमिक न्यूरॉन मध्यम (तालिका 1) प्रत्येक सेल गोली Resuspend और एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में उन्हें गठबंधन। एक hemocytometer का उपयोग सेल घनत्व निर्धारित करते हैं।

6. Electroporation और चढ़ाना प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स

नोट: जीन स्थानांतरण electroporation के, कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक और वायरल पारगमन सहित कई तरीकों का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम ChR2 प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स में निर्माण देने के लिए electroporation के वर्णन।

  1. अपकेंद्रित्र 6 एक्स 10 6 चूहा cortical न्यूरॉन्स एक5 मिनट के लिए 200 XG टी और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। कम से कम 6 एक्स 10 6 cortical न्यूरॉन्स न्यूरॉन्स जीवित द्वारा एक neuronal नेटवर्क के गठन सुनिश्चित करने के लिए electroporation के लिए आवश्यक हैं।
  2. गोली सेल और धीरे resuspend को electroporation के समाधान के 100 μl जोड़ें। PLenti-Synapsin-hChR2 के 6 माइक्रोग्राम प्रति (H134R) -EYFP-WPRE 4 प्लाज्मिड के साथ सेल निलंबन के 100 μl का मिश्रण है और एक प्रमाणित क्युवेट में हस्तांतरण। स्थानांतरण के दौरान हवा के बुलबुले का निर्माण करने से बचें।
  3. चुनें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार electroporation के लिए उपयुक्त कार्यक्रम लागू होते हैं।
  4. Electroporation के बाद, क्युवेट करने के लिए सेल / डीएनए निलंबन के लिए सदस्य के 500 μl जोड़ें। 11.5 मिलीलीटर में प्राथमिक न्यूरॉन मध्यम (तालिका 1) नमूना स्थानांतरण और धीरे resuspend। मीडिया की कुल राशि एक पूरे 24 अच्छी तरह से थाली के लिए पर्याप्त है। विभाज्य 24 अच्छी तरह से थाली की हर अच्छी तरह से करने के लिए माध्यम के 500 μl। 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली और 5% सीओ 2 सेते हैं।
  5. प्रेरित pluripotent स्टेम सेल 7. जनरेशन

    नोट:। इस विधि Okita एट अल से अनुकूलित किया गया है 10

    1. DMEM में संस्कृति मानव fibroblasts 6 अच्छी तरह प्लेटों में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक।
    2. Matrigel के साथ fibroblasts, कोट 6 कुओं की reprogramming के शुरू होने और कमरे के तापमान पर कम से कम एक घंटे के लिए सेते करने से पहले। 80% संगम पर तंतुप्रसू संस्कृतियों से मीडिया को दूर करने और 1x पीबीएस के साथ एक बार धो लें।
    3. पूरे प्लेट कवर और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते करने के लिए पर्याप्त 0.25% trypsin-EDTA जोड़ें।
    4. कोशिकाओं कुओं से उखाड़ फेंकना है एक बार trypsin के उस ट्रिप्सिन पाचन बुझाने के रूप में, 10% FBS के साथ DMEM के दो बार राशि जोड़ें। धीरे नीचे पिपेट सेल निलंबन ऊपर और कोशिकाओं को तोड़ने के लिए। एक hemocytometer के साथ एकल कक्षों की संख्या की गणना।
    5. एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र 5 के लिए 200 XG पर सेल निलंबन में स्थानांतरित 7 x 10 5 कोशिकाओंमि।
    6. सतह पर तैरनेवाला निकालें और electroporation समाधान में सेल गोली resuspend। निर्माता के निर्देशों के अनुसार fibroblasts के Electroporate। Electroporation के बफर के 100 μl में कोशिकाओं Resuspend और प्रत्येक episomal वेक्टर के एक माइक्रोग्राम प्रति जोड़ें। 1650 वी की सेटिंग, 10 एमएस और 3 समय दालों के साथ electroporate कोशिकाओं।
    7. DMEM में स्थानांतरण सेल निलंबन 10% FBS और थाली 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं के साथ पूरक। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 प्लेटें सेते हैं।
    8. 48 घंटे के बाद, ट्रांसफ़ेक्ट तंतुप्रसू संस्कृतियों से मीडिया को दूर करने और mTeSR मध्यम के साथ बदलें। प्रेरित स्टेम सेल (IPSC) कालोनियों अलग किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं जब तक दैनिक संस्कृति मीडिया की जगह। IPSC कालोनियों 28-35 दिनों के बाद देखा जा सकता है।
    9. जब अलगाव के लिए तैयार है, यंत्रवत् एक IPSC कॉलोनी में कटौती और एक Matrigel लेपित 6 अच्छी तरह से थाली 12 पर 10 माइक्रोन रो-जुड़े प्रोटीन काइनेज (रॉक) अवरोध करनेवाला (वाई 27,632) के साथ mTeSR माध्यम में reseed। दैनिक संस्कृति के माध्यम से बदलें।

    8. तंत्रिका प्रेरण और मानव NPCs के रखरखाव

    नोट:। इस विधि ली एट अल द्वारा वर्णित किया गया है 11

    1. IPSC संस्कृतियों 20% संगम के आसपास हैं, तो mTeSR मध्यम हटाने और तंत्रिका प्रेरण मध्यम (तालिका 1) के साथ बदलें। हर दूसरे दिन मध्यम भरपाई होगी।
    2. सात दिनों के बाद, तंत्रिका प्रेरण मध्यम हटाने और मानव एनपीसी रखरखाव मध्यम (तालिका 1) के साथ बदलें। संस्कृतियों passaging पहले 7 दिनों के लिए मध्यम हर दूसरे दिन की भरपाई होगी।
    3. करने से पहले कम से कम एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर Matrigel साथ संस्कृतियों, कोट प्लेटें / बोतल passaging।
    4. मिला हुआ मानव एनपीसी संस्कृतियों से मीडिया निकालें और फिर पीबीएस बंद महाप्राण 1x पीबीएस के साथ एक बार धो लें।
    5. सभी कुओं फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं कवर करने के लिए पर्याप्त सेल टुकड़ी समाधान जोड़ें।
    6. सभी कोशिकाओं को अलग कर दिया है कि यह सुनिश्चित करें। DMEM के दो बार राशि जोड़ें /एफ-12 कुओं / बोतल के लिए सेल टुकड़ी समाधान के रूप में।
    7. 5 मिनट के लिए 200 XG पर एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में DMEM / एफ -12 युक्त कोशिकाओं स्थानांतरण।
    8. 5 मिलीलीटर मानव एनपीसी रखरखाव मध्यम (तालिका 1) में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं को निकाल दें। धीरे नीचे पिपेट सेल निलंबन ऊपर और कोशिकाओं को तोड़ने के लिए।
    9. प्लेट Matrigel लेपित संस्कृति कुओं / बोतल और ऊपर 10 माइक्रोन वाई 27,632 के साथ पूरक पर्याप्त माध्यम में कुल कोशिकाओं का एक तिहाई है। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में संस्कृति वाहिकाओं को सेते हैं।
      1. स्प्लिट संस्कृतियों 1: 3 हर 3 से 4 दिन और हर दूसरे दिन मध्यम भरपाई होगी। भेदभाव को रोकने के लिए उच्च घनत्व पर मानव एनपीसी संस्कृतियों को बनाए रखने।

    सह-संस्कृतियों में न्यूरॉन्स में मानव NPCs के 9. भेदभाव

    1. न्यूरॉन्स में भेदभाव की शुरुआत से पहले मानव एनपीसी संस्कृति के लिए lentiviral वेक्टर Synapsin1-tdTomato जोड़ें। अस्थिकणिका / cortical न्यूरॉन सह संस्कृतियों को तैयारमानव NPCs के फर्क से पहले अग्रिम में एक दिन।
    2. 1x पीबीएस के साथ एक बार मानव एनपीसी संस्कृतियों धो लें और सभी कुओं को कवर करने के लिए पर्याप्त सेल टुकड़ी समाधान जोड़ने / बोतल फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. सभी कोशिकाओं को अलग कर दिया है कि यह सुनिश्चित करें। कुओं / बोतल के लिए सेल टुकड़ी के समाधान के रूप में है कि DMEM / एफ -12 की दो बार राशि जोड़ें। एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरण। 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र।
    4. 5 मिलीलीटर neuronal भेदभाव मध्यम (तालिका 1) में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं को निकाल दें। धीरे पिपेट सेल निलंबन ऊपर और नीचे एकल कक्षों में सेल गोली को तोड़ने के लिए। एक hemocytometer के साथ एकल कक्षों की संख्या की गणना।
    5. ध्यान से अस्थिकणिका / cortical न्यूरॉन संस्कृतियों से मध्यम महाप्राण। 5 एक्स 10 3 कोशिकाओं / सेमी neuronal भेदभाव माध्यम से 2 500 में μl प्रत्येक 24 अच्छी तरह से करने के लिए 10 माइक्रोन वाई 27,632 के साथ पूरक (तालिका 1) में प्लेट मानव NPCs के। धीरे प्रत्येक कुएं में मानव NPCs युक्त मध्यम जोड़नेastrocytes और cortical न्यूरॉन्स को परेशान करने से बचने के लिए।
    6. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 प्लेटें सेते हैं। कम से कम 28 दिनों के लिए नए सिरे से मध्यम के साथ हर दो से तीन दिन मध्यम के आधे बदलें।

    IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की 10 electrophysiological रिकॉर्डिंग

    1. मानव IPSCs परिपक्व न्यूरॉन्स की तरह व्यवहार करते हैं, चाहे पुष्टि करें।
      1. एक 60X (0.9 एनए) पानी विसर्जन लेंस से लैस एक ईमानदार confocal खुर्दबीन का उपयोग tdTomato के दृश्य के द्वारा मानव IPSCs से विभेदित कोशिकाओं का पता लगाएं।
      2. एक बाहरी समाधान में कमरे के तापमान पर 4 से 6 एम छिड़कना कोशिकाओं के एक प्रतिरोध करने के लिए पिपेट रिकॉर्डिंग खींचो (तालिका 1) 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ लगातार bubbled। आंतरिक समाधान (तालिका 1) के साथ रिकॉर्डिंग micropipette भरें।
      3. मौजूदा में वर्तमान इंजेक्शन (1 सेकंड की अवधि, 10 पीए वेतन वृद्धि) के जवाब में पूरे सेल मोड और रिकार्ड कार्रवाई संभावित फायरिंग में पैच tdTomato + सेलदबाना किराया।
    2. ChR2 व्यक्त cortical कोशिकाओं की कार्य क्षमता को मज़बूती प्रकाश उत्तेजना के द्वारा पैदा की जाती है तो पुष्टि करें।
      1. एक confocal खुर्दबीन के नीचे GFP के दृश्य द्वारा ChR2 व्यक्त cortical कोशिकाओं का पता लगाएं। चरणों 10.1.3 के लिए 10.1.2 का पालन करके cortical कोशिकाओं पर पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करते हैं।
      2. चेक कार्रवाई संभावित मज़बूती से पारा चाप दीपक (100 डब्ल्यू) के साथ प्रकाश रोशनी के द्वारा पैदा किया जाता है। उत्तेजना फिल्टर की तरंग दैर्ध्य 480/40 एनएम है।
    3. Optogenetic उत्तेजना प्रदर्शन।
      1. पैच tdTomato + पूरे सेल मोड में सेल और -70mV पर सेट वोल्टेज दबाना। 2 kHz पर मौजूदा संकेतों फिल्टर और 10 kHz पर digitize। 10 से रिकॉर्डिंग के दौरान स्थिरता के लिए 20 एम से लेकर श्रृंखला resistances मॉनिटर।
      2. 30 सेकंड के लिए 100 डब्ल्यू पारा दीपक के साथ 480/40 एनएम उत्तेजना फिल्टर द्वारा पूरे क्षेत्र को प्रोत्साहित।
      3. रिकॉर्ड पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं के photostimulation द्वारा प्रेरित समझौता सेल की (पीएससी) प्रीसानेप्टिक भ्रष्टाचार ChR2 व्यक्तराजनैतिक न्यूरॉन्स। का पता लगाने और पीएससी को मापने। क्रमशः 5 पीए और 20 पीसी, आयाम और धाराओं क्षेत्र के लिए निर्धारित सीमा। मैन्युअल किसी भी गैर पीएससी निशान त्यागने के लिए इन घटनाओं का निरीक्षण किया।

Representative Results

इधर, astrocytes मिलकर एक सह संस्कृति पैदा करने में शामिल कई कदम का वर्णन करने के लिए एक प्रोटोकॉल, cortical न्यूरॉन्स और मानव न्यूरॉन्स सचित्र है। मानव IPSCs उच्च घनत्व (चित्रा 1 ए) पर बनाए रखा गया है, जो NPCs के 11, जिससे छोटे अणु inhibitors के कॉकटेल के साथ एक तंत्रिका वंश में episomal का उपयोग कर fibroblasts के reprogramming द्वारा प्राप्त 10 वैक्टर और निर्दिष्ट किया गया। TdTomato (चित्रा 1 बी) के साथ टैग मानव NPCs के astrocytes में माउस NPCs के भेदभाव, ChR2 व्यक्त चूहा cortical न्यूरॉन्स के चढ़ाना, और बोने: कई चरणों सह संस्कृति उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हैं। भेदभाव के दिन 2 पर, glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) + astrocytes आसानी से हमारे संस्कृतियों (चित्रा 1C) में देखा जा सकता है। माउस NPCs के अस्थिकणिका monolayer (चित्रा -1) पर ChR2 व्यक्त cortical न्यूरॉन्स चढ़ाना पहले कम से कम एक सप्ताह के लिए अंतर करने के लिए अनुमति दी गई। 3 के बादमानव एनपीसी भेदभाव के 4 हफ्तों के लिए, tdTomato + न्यूरॉन्स संस्कृतियों (चित्रा 1E) में पाया गया।

यह सह-संस्कृति प्रणाली प्रकाश उत्तेजना (2A चित्रा) के जवाब में व्यक्तिगत IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स से पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं के अनुरूप पता लगाने की अनुमति देता है। प्रकाश द्वारा प्रेरित करते हैं, तो कार्रवाई क्षमता ChR2 (चित्रा 2 बी) को व्यक्त cortical न्यूरॉन्स में उत्पन्न किया गया। वर्तमान दालों depolarizing के आयाम के रूप में वृद्धि संभावित कार्रवाई फायरिंग दिखा, न्यूरॉन्स भी (चित्रा -2) उत्तेजनीय हैं IPSC व्युत्पन्न (चित्रा 2 डी) की वृद्धि हुई थी। इस प्रकार, इन कोशिकाओं को परिपक्व न्यूरोनल गुण दिखा रहे हैं। प्रकाश के अभाव में, IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स सहज अन्तर्ग्रथनी आदानों (चित्रा 2 ई) प्राप्त किया। GABA रिसेप्टर्स के माध्यम से धाराओं जावक होगा क्योंकि ये आवक पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं मुख्य रूप से, AMPA रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता कर रहे थे और NMDA रिसेप्टर्स मौजूदा एक नहीं ले लेते-70 एम वी की होल्डिंग क्षमता टी। प्रकाश उत्तेजना बहुत postsynaptic धाराओं (चित्रा 2 ई) की आवृत्ति में वृद्धि हुई है, क्योंकि कम से कम इन सूचनाओं में से कुछ, ChR2 व्यक्त प्रीसानेप्टिक cortical न्यूरॉन्स से थे। synaptic इनपुट में इस वृद्धि के समय के पाठ्यक्रम चित्रा 2 एफ में दिखाया गया है: cortical न्यूरॉन्स की photostimulation 30 सेकंड लंबा प्रकाश फ्लैश भर में निरंतर था। ChR2 व्यक्त cortical न्यूरॉन्स (चित्रा 2 जी) photostimulated गया जब पीएससी की आवृत्ति ऊपर उठाया गया था, वहीं उनके आयाम (चित्रा 2H) अप्रभावित था। सारांश में, इन परिणामों IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स परिपक्व न्यूरोनल गुणों का प्रदर्शन किया और प्रीसानेप्टिक cortical न्यूरॉन्स के साथ synaptic कनेक्शन फार्म सकता है कि संकेत मिलता है।

चित्र 1
चित्रा 1: सह संस्कृति की पीढ़ी के लिए योजनाबद्ध आरेखIPSCs और NPCs के लिए तंत्रिका प्रेरण में मानव fibroblasts reprogramming के लिए प्रणाली। (ए) के समय। cortical न्यूरॉन और अस्थिकणिका संस्कृतियों पर परिपक्व न्यूरॉन्स में मानव NPCs के टर्मिनल भेदभाव के लिए (बी) के समय। (सी) माउस NPCs के तेजी से GFAP में अंतर + astrocytes 2 के बाद इन विट्रो में दिन। (डी) एक सप्ताह के बाद, ChR2 व्यक्त cortical न्यूरॉन्स GFAP + astrocytes पर चढ़ाया गया था। (ई) 4 से 5 हफ्तों में मानव NPCs के भेदभाव के बाद, electrophysiological रिकॉर्डिंग tdTomato + न्यूरॉन्स पर प्रदर्शन किया गया। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं।

चित्र 2
चित्रा 2: कार्यात्मक synaptic कनेक्टिविटी की optogenetic विश्लेषण। TdTomato (लाल) के साथ टैग (ए) IPSC व्युत्पन्न कोशिकाओं cortical न्यूरॉन्स व्यक्त के साथ सह-सुसंस्कृत थे प्रकाश सक्रियचैनल, ChR2 (हरा)। IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग cortical न्यूरॉन्स या अन्य IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स या तो से आ सकता है जो पोस्टअन्तर्ग्रथनी वर्तमान (पीएससी) की प्रतिक्रियाएं, का पता चला। (बी) रोशनी (नीली पट्टी) ChR2 व्यक्त cortical न्यूरॉन्स में कार्रवाई क्षमता की एक श्रृंखला पैदा की। ( सी) IPSC व्युत्पन्न कोशिकाओं ChR2 व्यक्त cortical न्यूरॉन्स (ई) photostimulation (नीली पट्टी)। IPSC व्युत्पन्न कोशिकाओं की वर्तमान वक्र बनाम डी) निशानेबाजी (। मौजूदा इंजेक्शन द्वारा पैदा IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में पीएससी की आवृत्ति बढ़ रहे हैं । photostimulation द्वारा उत्पादित पीएससी आवृत्ति में वृद्धि की (एफ) समय बेशक। नीली पट्टी photostimulation के समय को इंगित करता है। पीएससी आवृत्ति photostimulation (जी) की वृद्धि हुई थी जबकि (जी, एच), पीएससी आयाम अप्रभावित (एच) था। * पी <0.05 छात्र की टी परीक्षण के साथ नियंत्रण की तुलना में इंगित करता है।

Discussion

Optogenetics न्यूरॉन्स 13 से परिभाषित आबादी के क्रियान्वयन के लिए अस्थायी और स्थानिक सटीक प्रदान करता है। हमारे प्रयोगों में, खुर्दबीन उद्देश्य के पूरे क्षेत्र ChR2 व्यक्त तस्वीर को प्रोत्साहित ही cortical न्यूरॉन्स के लिए 30 सेकंड के लिए प्रकाशित किया गया था। इस synaptic कनेक्शन सह संस्कृति के भीतर न्यूरॉन्स के विभिन्न आबादियों के बीच का गठन किया गया है कि क्या हमें यह निर्धारित करने की अनुमति दी। हमारे परिणाम photostimulation इन न्यूरॉन्स ChR2 व्यक्त प्रीसानेप्टिक cortical न्यूरॉन्स से synaptic इनपुट प्राप्त यह दर्शाता है कि जो, IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में पीएससी आवृत्ति बढ़ जाती है कि पता चला। यह, बारी में, IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स सफलतापूर्वक cortical न्यूरॉन्स के साथ सर्किट में शामिल है कि स्थापित किया।

इस सह-संस्कृति प्रणाली की पीढ़ी के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। यह चढ़ाना के साथ आगे बढ़ने से पहले माउस एनपीसी व्युत्पन्न अस्थिकणिका संस्कृतियों, न्यूनतम कोशिका मृत्यु के साथ, स्वस्थ रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैअन्य प्रकार की कोशिकाओं की। Cortical न्यूरॉन्स और मानव NPCs के स्वस्थ astrocytes पर अच्छी तरह से देते हैं और electrophysiological रिकॉर्डिंग संस्कृति शर्तों पर भारी निर्भर करते हैं। इस प्रोटोकॉल में अन्य महत्वपूर्ण कदम अस्थिकणिका संस्कृतियों पर electroporation और cortical न्यूरॉन्स की चढ़ाना हैं। कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या electroporation के बाद मर जाते हैं, यह कम से कम 6 लाख cortical न्यूरॉन्स 24 अच्छी तरह से प्लेट में अस्थिकणिका संस्कृतियों पर चढ़ाना के लिए electroporated कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। हम कम से कम 6 मिलियन कोशिकाओं electroporated थे, जब जीवित रहते हैं कि न्यूरॉन्स की संख्या electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रभावित जो एक घने neuronal नेटवर्क, फार्म नहीं था कि मनाया है। प्रत्येक सह संस्कृति प्रयोग विभिन्न अध्ययनों के बीच तुलना की अनुमति देने के लिए electroporated cortical न्यूरॉन्स की संख्या भी अनुरूप होना चाहिए। Enzymatic पाचन से जुड़े सभी चरणों के लिए, यह बहुत लंबा यह सेल मौत का कारण हो सकता है के रूप में के लिए पाचन समाधान में कोशिकाओं को छोड़ने के लिए आवश्यक नहीं है।

यहदृष्टिकोण अन्य न्यूरॉन्स के साथ synaptic संपर्कों के लिए फार्म रोगी विशेष fibroblasts से व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की क्षमता स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Neurodevelopmental विकार Rett सिंड्रोम (RTT) से पीड़ित रोगियों से fibroblasts से व्युत्पन्न न्यूरॉन्स synaptic प्रसारण दोष दिखा रहे हैं: RTT न्यूरॉन्स, शायद के कारण कम synaptic कनेक्टिविटी से 14 स्वस्थ न्यूरॉन्स की तुलना में पीएससी आवृत्ति और आयाम में एक महत्वपूर्ण कमी दिखा रहे हैं। हमारे सह-संस्कृति प्रणाली विकास संबंधी दोषों को प्रदर्शित करने न्यूरॉन्स पर दवा प्रभाव की परीक्षा की अनुमति देता है। यह रोगग्रस्त मानव NPCs के बोने के दौरान के रूप में अच्छी तरह से neuronal भेदभाव के समय के दौरान यौगिकों के लिए निरंतर प्रदर्शन के दौरान ब्याज की यौगिकों के अलावा के माध्यम से बाहर किया जा सकता है।

इस सह-संस्कृति प्रणाली भी दवा के परीक्षण के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, इस दृष्टिकोण के साथ एक सीमा प्रत्येक उम्मीदवार परिसर के प्रभाव की जांच की प्रक्रिया लंबी और के रूप में कठिन हो सकता हैयह एक उच्च throughput स्क्रीनिंग विधि नहीं है। उम्मीदवार यौगिकों के साथ उपचार के बाद, IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स को व्यक्तिगत रूप से पीएससी पर प्रत्येक परिसर के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए समझौता किया जाना है। इसके अलावा, वर्तमान में रोगियों से नहीं कई उपलब्ध fibroblasts और IPSCs कर रहे हैं। इसलिए, यह अधिक मरीज की कोशिकाओं के लिए है और यह भी उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूल करने के लिए निकट भविष्य में ब्याज की हो जाएगा। उदाहरण के लिए, इस तरह के आयनों या झिल्ली क्षमता की आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर के रूप में एक गतिविधि सूचक के साथ IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स, लेबलिंग के द्वारा, यह पक्ष निकलते समय लेने वाली electrophysiological प्रक्रिया से काफी throughput दर को बढ़ाने के लिए संभव हो जाएगा। Electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने fibroblasts के reprogramming से, इस सह-संस्कृति प्रणाली पैदा करने की पूरी प्रक्रिया के रूप में, 90 से अधिक दिनों, यह क्रमशः reprogramming और तंत्रिका प्रेरण कदम के बाद, मानव IPSCs या NPCs के लिए या तो विस्तार किया जा सिफारिश की है कि आवश्यकता है,और cryopreserved भविष्य प्रयोगों के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए।

हमारे प्रयोगों में, हम synapsin1 प्रमोटर के तहत cortical न्यूरॉन्स में ChR2 व्यक्त किया। इस प्रमोटर अखिल neuronal है, क्योंकि हम संभवतः दोनों निरोधात्मक और उत्तेजक cortical न्यूरॉन्स photostimulating थे। भविष्य प्रयोगों के लक्ष्य को विशेष रूप से निरोधात्मक या उत्तेजक या तो सर्किट से पूछताछ करने के लिए है, तो अधिक विशिष्ट प्रमोटरों इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, cortical न्यूरॉन्स ट्रांसजेनिक (या वायरस इंजेक्शन चूहों) ChR2 अभिव्यक्ति विशेष रूप से न्यूरॉन्स की आनुवंशिक रूप से परिभाषित उप-जनसंख्या के लिए लक्षित है जहाँ से प्राप्त किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, Cre recombinase है कि एक माउस से कटाई कॉर्टिकल ऊतकों ChR2 व्यक्त केवल cortical न्यूरॉन्स पीवी interneurons 15 हो जाएगा, जहां एक की स्थिति निकलेगा floxed ChR2 के साथ एक माउस के साथ पार कर जाता है कि parvalbumin युक्त interneurons (पीवी interneurons) में व्यक्त की है। ऐसे ChR2 व्यक्त हमारे में से interneurons सह-घन के उपयोगlture प्रणाली एक समझौता IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन पीवी interneurons के साथ एक सर्किट में शामिल करने में सक्षम है या नहीं के निर्धारण के लिए सक्षम हो जाएगा।

पिछले एक अध्ययन 9 के आधार पर, cortical न्यूरॉन्स इन विट्रो में 14 दिनों के बाद डेन्ड्राइट ओवरलैपिंग के साथ परिपक्व हो रहे हैं। Photostimulation एक समझौता IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन से एक प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना नहीं है, तो इस प्रकार, यह न्यूरॉन cortical न्यूरॉन्स के साथ synaptic कनेक्शन बनाने की क्षमता नहीं है जो संकेत चाहिए। एक IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन अन्य IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स या cortical न्यूरॉन्स से या तो सिनेप्टिक इनपुट प्राप्त करने में सक्षम है। पारंपरिक पैच दबाना रिकॉर्डिंग का उपयोग किया गया है, यह synaptic इनपुट से आ रही है जहां भेद करने के लिए संभव नहीं होगा। हमारी प्रणाली का लाभ कॉर्टिकल प्रीसानेप्टिक इनपुट से पोस्टअन्तर्ग्रथनी प्रतिक्रियाओं चुनिंदा पैदा की और पहचाना जा सकता है। यहां उल्लिखित प्रक्रियाओं को एकीकृत करने के IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण प्रदानएक परिभाषित न्यूरोनल नेटवर्क में।

Acknowledgments

हम IPSC पीढ़ी पर विशेषज्ञता और प्रोटोकॉल साझा करने के लिए क्रमश: ChR2 और Synapsin1-tdTomato lentiviral निर्माणों के लिए सी चाय लालकृष्ण Deisseroth और एस जे धन्यवाद, WY Leong तकनीकी सहायता के लिए, साझा अभिकर्मकों और विशेषज्ञता के लिए गोह प्रयोगशाला के सदस्य हैं। इस काम ELG करने के लिए अपने प्रतिस्पर्धी अनुसंधान कार्यक्रम (002-082 2008 एनआरएफ-सीआरपी एनआरएफ) के तहत नेशनल रिसर्च फाउंडेशन सिंगापुर से, एबट पोषण और ELG करने के लिए उत्कृष्टता के शैक्षणिक केंद्र (ऐस) ग्लैक्सोस्मिथक्लाइन (जीएसके) से अनुसंधान पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था और GJA, और शिक्षा, विज्ञान और कोरिया की प्रौद्योगिकी (MEST) मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन के वर्ल्ड क्लास संस्थान (WCI) प्रोग्राम (एनआरएफ) द्वारा (एनआरएफ अनुदान संख्या: WCI 2009-003) GJA को

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurocult Proliferation Kit (Mouse) STEMCELL Technologies 5702 Contains NSC Basal Medium and NSC Proliferation Supplement
Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit Invitrogen A15960
DMEM/F12 Lonza 12719F
Matrigel BD Biosciences 354277
Neurobasal medium Invitrogen 21103049
MEM without glutamine Invitrogen 11090081
N2 Invitrogen 17502048
B27 Invitrogen 17504044
L-glutamine Invitrogen 25030081
GlutaMAX supplement Invitrogen 35050061
PenStrep Invitrogen 15140122
BSA Sigma A7906
Human LIF Invitrogen PHC9484
CHIR99021 Miltenyi Biotech 130103926
SB431542 Sigma S4317
Compound E Merck Millipore 565790
EGF Merck Millipore 324856
FGF2 R&D Systems 233FB025
Research Grade FBS Thermo Scientific SV30160.03 For astrocyte differentiation medium
Defined FBS Thermo Scientific SH30070.03 For primary neuron medium
PBS Thermo Scientific SH30028.02
Glucose Sigma G8270 For primary neuron medium
Sucrose Sigma S0389
Heparin EMD Millipore 375095
Papain Worthington 3126
HBSS Invitrogen 14175095
DNase I Roche 10104159001
Dispase II STEMCELL Technologies 7923
HEPES Gibco 15630080 For harvesting brains
EBSS Invitrogen 14155063
L-Cysteine Sigma C7352
Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056
70 µm cell strainer BD Biosciences   352350
20 µm filter unit Sartorius Stedim 16534K
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P5405
NaHCO3 Sigma S5761
NaH2PO4 Fluka 71505
MgCl2 Sigma M8266
CaCl2 Sigma C1016
D(+)-Glucose Sigma G7520 For electrophysiological studies
K-gluconate Sigma P1847
KOH KANTO Chemical 3234400
HEPES Sigma H3375 For electrophysiological studies
EGTA Sigma E3889
Na2ATP Sigma A7699
Na3GTP Sigma G8877
Borosilicate glass capillaries World precision instruments, Inc 1604323
15 ml centrifuge tube BD Biosciences  352096
50 ml centrifuge tube BD Biosciences 352070
24-well plates Corning 9761146
6-well plates Corning 720083
T25 flasks Corning 430641
12 mm cover glasses Marienfeld-Superior 111520
AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit  Lonza VPG1003 For electroporation of primary cortical neurons
Neon Transfection System  Invitrogen MPK5000 For electroporation of human fibroblasts
Mini Analysis  Synaptosoft Mini Analysis v.6 For measurement of PSCs
Normal Dermal Human Fibroblasts PromoCell C12300
pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE Addgene 20945
Mercury short-arc lamp OSRAM HBO 103 W/2

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References

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एक सह-संस्कृति प्रणाली में neuronal कनेक्शन के गठन का आकलन करने के लिए एक optogenetic दृष्टिकोण
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Su, C. T. E., Yoon, S. I., Marcy, G., Chin, E. W. M., Augustine, G. J., Goh, E. L. K. An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System. J. Vis. Exp. (96), e52408, doi:10.3791/52408 (2015).More

Su, C. T. E., Yoon, S. I., Marcy, G., Chin, E. W. M., Augustine, G. J., Goh, E. L. K. An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System. J. Vis. Exp. (96), e52408, doi:10.3791/52408 (2015).

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