Introduction
في السنوات الأخيرة، وقد أحدثت ثورة في فهمنا من الخلايا العصبية والخلايا العصبية وظيفة الدوائر بواسطة عدة أدوات optogenetic التي تتحكم في استثارة الخلايا العصبية. واحدة من هذه الأداة هي القناة الموجبة لتنشيط ضوء، channelrhodopsin-2 (ChR2): الخلايا العصبية معربا عن ChR2 إمكانات العمل النار ردا على التحفيز خفيفة 1-3. لأن الخلايا العصبية ليست حساسة عادة للضوء، وهذه القدرة الرائعة تفتح آفاقا جديدة لمكافحة الزمانية والمكانية دقيقة لنشاط السكان محددة وراثيا من الخلايا العصبية (4) ولقد تسارعت بشكل كبير من الدراسات وظيفة الدماغ. وقد تم تطبيق ChR2 لأبحاث الخلايا الجذعية لأغراض مختلفة، من رصد التنمية العصبية 5 إلى تنظيم نشاط الشبكات العصبية 6.
نحن هنا تستخدم ChR2 لزيادة فائدة نظام شارك في ثقافة العصبية. تمكن أنظمة شارك في ثقافة تقييم التفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا.شارك الثقافات من الخلايا العصبية والدبقية، أنواع الخلايا الرئيسية للجهاز العصبي، وتستخدم عادة للتحقيق مما يشير بين هذه أنواع مختلفة من الخلايا، وكذلك لتقييم أهمية هذه الإشارات لالاستجابات الفسيولوجية، والإكثار من الضرر ودراسة الآليات الجزيئية التي يحتمل أن تشارك في هذه إشارات 7. وكشفت دراسة سابقة أن iPSCs الإنسان تفرق بسرعة كبيرة في الخلايا العصبية في وجود ثقافة تحتوي على الخلايا العصبية الفئران القشرية الأولية، الخلايا النجمية، قليلة التغصن، والخلايا الدبقية الصغيرة 8.
في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود طريقة التي تستخدم ChR2 في نظام شارك في ثقافة لاستجواب الاتصالات المشبكية بين الخلايا العصبية والخلايا العصبية القشرية الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة من صنع الإنسان (iPSCs). وصفنا خطوات لتشريح وأنسجة المخ الحصاد 9 وكذلك للحفاظ على وتفرق الماوس الخلايا الاصلية العصبية (الشخصيات) في الخلايا النجمية والشخصيات البشرية كثافة العملياتس الخلايا العصبية لخلق نظام المشاركة في الثقافة. لإنشاء هذا النظام المشترك والثقافة، واستخدمنا طريقة إعادة برمجة خالية من التكامل وصفها أوكيتا وآخرون. 10 لتوليد iPSCs الإنسان. ثم تم ميز هذه iPSCs بكفاءة في اللجان التحضيرية الوطنية في ظروف محددة كيميائيا باستخدام مثبطات الصغيرة جزيء كما وصفها لي وآخرون. 11
في الثقافات المشترك، يمكن التعرف على مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية عن طريق الكشف عن ChR2 التعبير في الخلايا العصبية القشرية ووضع علامات على الخلايا العصبية IPSC المشتقة عن طريق بروتين الفلورسنت، جنبا إلى جنب ديمر الطماطم (tdTomato). الجمع بين التسجيلات الكهربية من الخلايا العصبية IPSC المستمدة مع ضوئي optogenetic من الخلايا العصبية القشرية يسمح تقييم قدرة هذين النوعين من الخلايا العصبية لتشكيل الدوائر مع بعضها البعض. على وجه التحديد، ضوئي من ChR2 معربا عن الخلايا العصبية القشرية تثير ردود متشابك في الخلايا العصبية IPSC المشتقة التي شكلت الدوائر متشابكمع شبكة الخلايا العصبية القشرية photostimulated. علينا أن نبرهن على زيادة التيارات بعد المشبكي يتم الكشف عنها بالفعل في الخلايا العصبية IPSC المشتقة في ظل هذه الظروف. هذا البروتوكول يسمح تقييم الدوائر متشابك في إطار مجموعة من الظروف التجريبية، بما في ذلك خلاصة من نماذج مختلفة المرض العصبية باستخدام iPSCs المستمدة من الخلايا الليفية من المرضى المرض.
Protocol
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع التجارب التالية البروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في SingHealth.
1. العقول حصاد المبكر بعد الولادة ماوس
- قبل تشريح، وإعداد الحصين حل الهضم الأنسجة: 10 ميكرولتر غراء في محلول الملح 1 مل 1X ايرل المتوازن (EBSS) (+ 1٪ HEPES) مع ديوكسي ريبونيوكلياز I (الدناز I) (250 U / مل)، وDispase II (1 U / مل). جعل ما يقرب من 2.5 مل من محلول الهضم الأنسجة وتصفية باستخدام وحدة 0.20 ميكرون التصفية. إبقاء الحارة الحل عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- تخدير بعد الولادة اليوم 5 (P5) الجراء الفئران عن طريق وضعها في الثلج لمدة 5 دقائق. إزالة من الجليد واختبار للألم المنعكس عبر أخمص القدمين أو قرصة الذيل. رش الجراء مع 70٪ من الإيثانول. قطع رأس الجراء ووضع رؤساء في طبق بتري على الجليد.
- إجراء شق في الجلد على طول خط الوسط، من قاعدة الجمجمة إلى الأنف، مع زوج من scisso صغيرالتمرير أو ملقط تشريح غرامة. قشر فتح الجلد وجعل شق مماثل من خلال الجمجمة. جعل اثنين تخفيضات إضافية الأفقية على كل جانب من الجمجمة، منقاري واحد (في bregma) والذيلية واحد (في لامدا).
- قشر فتح الجمجمة على طول خطوط قطعي لفضح الدماغ الكامنة. استخدام زوج من ملقط لإزالة الجمجمة التي تغمر بصيلات الشم، وأي عظم خط الوسط بينهما. هل هذا في حين عقد رئيس مستقرة مع زوج من الملقط في اليد غير تشريح.
- تخفيف جزء مسطح من ملعقة بين الجزء البطني من الدماغ وقاعدة الجمجمة في نهاية الذيلية. الحفاظ على بالتوازي ملعقة إلى قاعدة الجمجمة تحت الدماغ، وتحريكه نحو نهاية منقاري من الجمجمة لقطع أي التصاقات بين الدماغ وقاعدة الجمجمة.
- مغرفة الدماغ بها مع ملعقة ووضعه في طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة 1X EBSS (+ 1٪ HEPES). إبقاء الأنسجة مغمورة في جميع الأوقات.
- للجميعخطوات تشريح الصغيرة، والعمل تحت المجهر تشريح واستخدام زوج من ملقط تشريح الجميلة في كل يد، واحدة لقطع الأنسجة، وغيرها لعقد الأنسجة مستقرة.
- اجراء خفض مجرد الخلفي لقشرة الدماغ لفصلها عن الدماغ المؤخر. قطع على طول خط الوسط لفصل القشرة المخية إلى اثنين من نصفي الكرة الأرضية. إزالة السحايا من نصفي الكرة المخية.
- ضع نصف الكرة الجانب الإنسي صعودا وإدراج ملقط في البطين الجانبي تحت الحصين. قطع بعيدا المخ الأوسط.
- إجراء تخفيضات في نهايات الأعلى والأدنى من الحصين، وبالقرب من المسنن / القشرة المخية الأنفية الداخلية تقاطع لعزل الحصين من القشرة. جمع الحصين في صحن يحتوي على الجليد الباردة 1X EBSS (+ 1٪ HEPES).
2. الحصين الأنسجة التفكك
- نقل الحصين إلى طبق يحتوي على ما قبل تحسنت الحصين حل الهضم الأنسجة. اللحم المفروم رانه الحصين الأنسجة إلى غرامة قدر الإمكان، واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C.
- بلطف فصل الأنسجة إلى الخلايا واحد من الخلايا pipetting لونقل الميكانيكية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
- أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة طاف.
- بيليه الخلية resuspend في 20 مل 0.5X محلول الملح هانك المتوازن (HBSS) التي تحتوي على السكروز (0.9 M) وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة.
- إزالة طاف و resuspend الخلية بيليه في 2 مل من NPC صيانة المتوسطة (الجدول 1)، وضعت على رأس 10 مل من 4٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) في 1X EBSS حل والطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
- إزالة طاف وإضافة الماوس NPC المتوسطة الصيانة (الجدول 1) إلى بيليه الخلية. ماصة بلطف صعودا وهبوطا 5-10 مرات لضمان كسر بيليه الخلية إلى خلايا واحدة.
- نقل الخلايا التي تحتوي المتوسطة في لوحات المغلفة قبل Matrigel وإضافة عامل نمو البشرة (EGF) وfibroblaالحادي وعامل النمو 2 (FGF2) (على حد سواء 20 نانوغرام / مل) في الهيبارين (5 ملغ / مل). احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
3. صيانة تمسكا ماوس الحصين الشخصيات
- إعداد لوحات المغلفة / قوارير على الأقل ساعة قبل الركض الماوس الشخصيات الحصين. إضافة ما يكفي من Matrigel لتغطية مساحة سطح كل لوحة أو قارورة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- إزالة وسائل الاعلام من 90٪ متموجة الماوس الثقافات مجلس الشعب ويغسل مرة واحدة مع 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ثم نضح PBS قبالة.
- إضافة ما يكفي من حل مفرزة خلية لتغطية جميع الآبار / قوارير واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- التأكد من أن جميع الخلايا قد فصل من خلال النظر تحت مجهر حقل مشرق مقلوب في 10X التكبير. إذا لا تزال هناك خلايا المرفقة، احتضان سفينة الثقافة ل1-2 دقيقة أخرى وتحقق من خلايا مرة أخرى. إضافة مرتين كمية Dulbecco لتعديل F-12 المغذيات خليط النسر متوسطة / هام ل(DMEM / F-12)كما ان من حل مفرزة الخلية إلى الآبار / قوارير مرة واحدة وقد فصل كل الخلايا.
- نقل DMEM / F-12 إلى الخلايا التي تحتوي على 15 مل أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
- إزالة طاف وبيليه الخلية resuspend في 5 مل من صيانة الماوس NPC المتوسطة (الجدول 1). ماصة بلطف صعودا ونزولا لتفريق بيليه الخلية في الخلايا واحد.
- لوحة ثلث مجموع الخلايا إلى ثقافة جديدة الآبار / قوارير وأعلى حتى كاف مستنبت تستكمل مع EGF وFGF2. احتضان السفن الثقافة في 37 ° C وCO 2 5٪. تجديد المتوسطة في كل ثانية اليوم وانقسام الخلايا 1: 3 كل 3 إلى 4 أيام. تجنب فرط نمو الثقافات الماوس مجلس الشعب لمنع تجميع وانفصال.
4. تمايز ماوس الشخصيات في النجمية
- إعداد بولي-L-ليسين (PLL) / laminin المغلفة 12 ملم نظارات غطاء على الأقل في اليوم في وقت مبكر قبل الشروع في التفريق بين الشخصيات الماوس إلى الخلايا النجمية. إضافة COVerslips في لوحة 24-جيدا، وتغطي مساحة كاملة من الآبار مع ما يكفي من PLL (1 ملغ / مل في المخزن بورات).
- احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في اليوم التالي، وإزالة PLL ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X.
- إضافة laminin (1 ملغ / مل في الجليد الباردة DMEM / F-12)، وتغطي مساحة السطح مرة أخرى كاملة من كل بئر، ثم احتضان لمدة لا تقل عن 4 ساعة على 37 درجة مئوية.
- إزالة وسائل الاعلام من ثقافات مجلس الشعب الماوس ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X ثم نضح PBS قبالة.
- إضافة ما يكفي من حل مفرزة خلية لتغطية جميع الآبار / قوارير واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- التأكد من أن جميع الخلايا وفصل ثم يضاف ضعف كمية DMEM / F-12 كما ان من حل مفرزة الخلية إلى الآبار / قوارير.
- نقل DMEM / F-12 إلى الخلايا التي تحتوي على 15 مل أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
- إزالة الخلايا وطاف resuspend في 5 مل نجمية المتوسطة التمايز (الجدول 1). بلطف suspensio خلية ماصةن صعودا وهبوطا لتفريق بيليه الخلية في الخلايا واحد. حساب عدد الخلايا واحد مع عدادة الكريات.
- خلايا لوحة في 5 × 10 4 خلية / سم 2 في 500 ميكرولتر من المتوسطة لكل بئر من لوحة 24-جيدا. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. استبدال نصف المتوسطة مع المتوسطة الطازجة كل يوم الثاني. الماوس الشخصيات تفرق بسرعة إلى الخلايا النجمية في حدود 2 أيام ويتم التمييز لمدة أسبوع قبل بدء مزيد من التجارب.
5. العقول حصاد الجنينية الجرذ والقشرية الأنسجة التفكك
- إزالة نجمية التمايز المتوسطة (الجدول 1) من الثقافات نجمية واستبدالها مع المتوسطة الخلايا العصبية الأولية (الجدول 1) لا يقل عن 4 ساعة قبل بدء موسم الحصاد من أدمغة الفئران الجنينية.
- قبل تشريح، وإعداد القشرية حل الهضم الأنسجة: 10 ميكرولتر غراء لكل 1 مل 1X EBSS (+ 1٪ HEPES) مع 12.1 ملغ / مل L-السيستين. جعل ما يقرب من 2.5 مل من محلول الهضم الأنسجة وتصفية باستخدام وحدة 0.20 ميكرون التصفية. إبقاء الحارة الحل عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- الموت ببطء السد حامل خنقا غاز ثاني أكسيد الكربون باستخدام الغاز المضغوط. اختبار لردة فعل الألم عن طريق القدمين أو قرصة الذيل.
- وضع الجانب البطني الحيوان حتى على وسادة ماصة ونقع منطقة البطن مع الايثانول 70٪. قرصة الجلد مع زوج من ملقط وجعل شق الجانبي مع زوج من مقص جراحي، واسعة بما يكفي لفضح البطن. فهم الصفاق مع ملقط وقطع فتح تجويف البطن.
- ارفع قرن الرحم مع ملقط وقطع عليه مجانا على طول مسراق الرحم. وضع الرحم تشريح في طبق بيتري على الجليد. فصل كل الجنين عن طريق قطع أنسجة الرحم بينهما.
- إجراء شق في الكيس الجنيني. قصف بلطف الجنين من خلال الفتحة. قطع رأس الجنين ووضع رأسه في طبق بتري على الجليد.
- لحصاد embryonأدمغة الفئران جيم، اتبع وصف من الخطوات 1،3-1،5.
- لتشريح الأنسجة القشرية، ضع الجانب المخ نصف الكرة الجانبي يصل. قطع نصف الكرة الأرضية في اثنين أفقيا من الوسط. تجاهل أقرب النصف إلى قاعدة الدماغ. تقليم النسيج رفعه لإزالة المخ الأوسط.
- نقل الأنسجة القشرية إلى طبق يحتوي على ما قبل تحسنت القشرية حل الهضم الأنسجة. تخطر على الأنسجة القشرية إلى غرامة قدر الإمكان، واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C.
- نقل الأنسجة القشرية من الحل الهضم الأنسجة لأنبوب 50 مل الطرد المركزي التي تحتوي على 10 مل قبل تحسنت المتوسطة الخلايا العصبية الأولية (الجدول 1). فصل الأنسجة القشرية من قبل pipetting لهم مرارا وتكرارا صعودا وهبوطا في ماصة المصلية، حتى يتم الحصول على حل متجانسة مع أي قطعة نسيج.
- تمرير الحل الأنسجة من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر لتصفية ما تبقى كتل الأنسجة. قسامة الحل الأنسجة في 15 ملأنابيب الطرد المركزي، مضيفا حوالي 3 مل في كل أنبوب.
- إضافة 800 ميكرولتر 7.5٪ BSA في برنامج تلفزيوني 1X إلى الجزء السفلي من كل أنبوب، وتشكيل طبقتين مع الحل الأنسجة على رأس وBSA في الأسفل.
- أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف، الشفط من واجهة من طبقتين. تجنب تعكير الخلية بيليه في أسفل الأنبوب.
- و resuspend كل بيليه خلية في 1 مل المتوسطة العصبية الأولية (الجدول 1) والجمع بينهما في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. تحديد كثافة الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
6. Electroporation للوالتصفيحات الابتدائي العصبونات القشرية
ويمكن تحقيق نقل الجينات باستخدام عدة طرق، بما في ذلك Electroporation لل، ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم وتنبيغ الفيروسية: ملاحظة. في هذا البروتوكول، وصفنا Electroporation لللتقديم ChR2 بناء في الخلايا العصبية القشرية الأولية.
- الطرد المركزي 6 × 10 6 الفئران الخلايا العصبية القشرية لر 200 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة طاف. ويلزم على الأقل 6 × 10 6 الخلايا العصبية القشرية ل electroporation لضمان تشكيل شبكة العصبية التي كتبها قيد الحياة الخلايا العصبية.
- إضافة 100 ميكرولتر من حل Electroporation للإلى الخلية بيليه و resuspend بلطف. الجمع بين 100 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 6 ميكروغرام من pLenti-سينابسينات-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE 4 البلازميد ونقل إلى كوفيت المعتمدة. تجنب إنتاج فقاعات الهواء أثناء عملية النقل.
- اختيار وتطبيق البرنامج المناسب ل electroporation وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- بعد Electroporation لل، إضافة 500 ميكرولتر من MEM إلى تعليق خلية / الحمض النووي للكفيت. نقل العينة إلى 11.5 مل المتوسطة العصبية الأولية (الجدول 1) و resuspend بلطف. المبلغ الإجمالي وسائل الإعلام كافية لكامل لوحة 24-جيدا. قسامة 500 ميكرولتر من المتوسطة لكل بئر من لوحة 24-جيدا. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. 7. توليد المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية
- ثقافة الخلايا الليفية الإنسان في DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) في 6 لوحات جيدة.
- قبل البدء في إعادة برمجة الخلايا الليفية، ومعطف 6 آبار مع Matrigel واحتضان لمدة ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. في 80٪ التقاء، وإزالة وسائل الاعلام من الثقافات الخلايا الليفية ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X.
- إضافة يكفي 0.25٪ التربسين-EDTA لتغطية لوحة كاملة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- مرة واحدة وقد طردت الخلايا من الآبار، إضافة لضعف الكمية من DMEM مع 10٪ FBS كما ان من التربسين لإرواء التربسين الهضم. بلطف ماصة تعليق خلية صعودا وهبوطا لتفريق الخلايا. حساب عدد الخلايا واحد مع عدادة الكريات.
- نقل 7 × 10 5 الخلايا في 15 مل أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي تعليق خلية في 200 x ج لمدة 5دقيقة.
- إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في حل Electroporation لل. Electroporate الخلايا الليفية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. الخلايا resuspend في 100 ميكرولتر من العازلة Electroporation للوإضافة 1 ميكروغرام لكل ناقلات episomal. خلايا Electroporate مع إعدادات 1،650 V، و 10 مللي و 3 البقول الوقت.
- تعليق خلية نقل إلى DMEM تستكمل مع 10٪ FBS وصفيحة 5 × 10 4 خلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
- بعد 48 ساعة، وإزالة وسائل الاعلام من الثقافات الخلايا الليفية transfected واستبدالها مع mTeSR المتوسطة. استبدال وسائل الإعلام ثقافة يوميا حتى يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (IPSC) مستعمرات جاهزة للعزل. المستعمرات IPSC يمكن ملاحظة بعد 28-35 يوما.
- عندما تصبح جاهزة للعزلة، وقطع ميكانيكيا مستعمرة IPSC وRESEED في mTeSR المتوسطة مع 10 ميكرومتر رو المصاحب بروتين كيناز (ROCK) المانع (Y-27632) في الصعود إلى Matrigel المغلفة لوحة 6 جيدا 12. استبدال مستنبت يوميا.
- عندما الثقافات IPSC هي حوالي 20٪ التقاء، وإزالة mTeSR المتوسطة واستبدالها مع العصبية المتوسطة تحريض (الجدول 1). تجديد المتوسط كل يوم الثاني على التوالي.
- بعد 7 أيام، وإزالة العصبي المتوسطة تحريض واستبدالها مع الإنسان NPC المتوسطة الصيانة (الجدول 1). تجديد المتوسط كل يوم الثاني يصل إلى 7 أيام قبل الركض الثقافات.
- قبل الركض الثقافات، لوحات معطف / قوارير مع Matrigel في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل على ساعة.
- إزالة وسائل الاعلام من متموجة الثقافات NPC الإنسان ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X ثم نضح PBS قبالة.
- إضافة ما يكفي من حل مفرزة خلية لتغطية جميع الآبار ثم احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- التأكد من أن جميع الخلايا ومنفصلة. إضافة مرتين مبلغ DMEM /F-12 كما ان من حل مفرزة الخلية إلى الآبار / قوارير.
- نقل DMEM / F-12 إلى الخلايا التي تحتوي على 15 مل أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
- إزالة الخلايا وطاف resuspend في 5 مل البشري NPC المتوسطة الصيانة (الجدول 1). بلطف ماصة تعليق خلية صعودا وهبوطا لتفريق الخلايا.
- لوحة ثلث مجموع الخلايا في Matrigel المغلفة الثقافة الآبار / قوارير وأعلى حتى المتوسطة كافية تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632. احتضان السفن الثقافة في 37 ° C وCO 2 5٪.
- ثقافات انقسام 1: 3 كل 3 إلى 4 أيام وتجديد المتوسط كل يوم. الحفاظ على الثقافات NPC الإنسان في كثافة عالية لمنع التمييز.
- إضافة ناقلات lentiviral Synapsin1-tdTomato للثقافة NPC الإنسان قبل البدء التمايز في الخلايا العصبية. إعداد نجمية / الخلايا العصبية القشرية المشترك الثقافاتفي اليوم في وقت مبكر قبل التفريق الشخصيات البشرية.
- غسل الثقافات NPC الإنسان مرة واحدة مع 1X PBS وإضافة ما يكفي من حل مفرزة خلية لتغطية جميع الآبار / قوارير ثم احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- التأكد من أن جميع الخلايا ومنفصلة. إضافة مرتين مبلغ DMEM / F-12 كما ان من حل مفرزة الخلية إلى الآبار / قوارير. نقل في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
- إزالة الخلايا وطاف resuspend في 5 مل الخلايا العصبية المتوسطة التمايز (الجدول 1). بلطف ماصة تعليق خلية صعودا وهبوطا لتفريق بيليه الخلية في الخلايا واحد. حساب عدد الخلايا واحد مع عدادة الكريات.
- نضح بعناية المتوسطة من نجمية / الثقافات الخلايا العصبية القشرية. الشخصيات البشرية لوحة في 5 × 10 3 خلية / سم 2 في 500 ميكرولتر من الخلايا العصبية المتوسطة التمايز (الجدول 1) تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632 لكل 24-جيدا. إضافة بلطف المتوسطة التي تحتوي على الشخصيات الإنسان في كل بئرلتجنب إزعاج الخلايا النجمية والخلايا العصبية القشرية.
- احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. استبدال نصف المتوسطة مع المتوسطة الطازجة كل يومين أو ثلاثة أيام لمدة 28 يوما على الأقل.
- تأكيد ما إذا كان iPSCs البشرية تتصرف مثل الخلايا العصبية الناضجة.
- البحث عن خلايا متباينة من iPSCs الإنسان من خلال تصور tdTomato باستخدام مجهر متحد البؤر تستقيم مجهزة 60X (0.9 NA) عدسة الغمر بالماء.
- سحب تسجيل ماصة للمقاومة من 4 إلى 6 خلايا M. يروي في درجة حرارة الغرفة في حل خارجي (الجدول 1) فقاعات باستمرار مع 95٪ O 05/02٪ CO 2. ملء ممص مكروى تسجيل مع حل داخلي (الجدول 1).
- التصحيح tdTomato + خلية في وضع خلية كاملة والعمل سجل اطلاق محتمل ردا على حقن الحالي (1 مدة ثانية، 10 الزيادات السلطة الفلسطينية) في لئيماستئجار المشبك.
- تأكد ما إذا كانت أثار إمكانات العمل من الخلايا القشرية معربا عن ChR2 موثوق عن طريق تحفيز الضوء.
- البحث عن الخلايا القشرية معربا عن ChR2 التي تصور GFP تحت المجهر متحد البؤر. أداء كامل الخلية المشبك التصحيح تسجيل على الخلايا القشرية باتباع الخطوات 10.1.2 إلى 10.1.3.
- وأثار إمكانية الاختيار العمل بشكل موثوق من الإضاءة الخفيفة مع مصباح قوس الزئبق (100 W). الطول الموجي للمرشح الإثارة هو 480/40 نانومتر.
- أداء التحفيز optogenetic.
- التصحيح tdTomato + خلية في وضع خلية كاملة ووضع المشبك الجهد في -70mV. تصفية الإشارات الحالية في 2 كيلو هرتز ورقمنة في 10 كيلوهرتز. مراقبة سلسلة المقاومة تتراوح من 10 إلى 20 M من أجل التناسق خلال التسجيلات.
- تحفيز الحقل بالكامل بنسبة 100 W مصباح الزئبق مع 480/40 نانومتر الإثارة مرشح لمدة 30 ثانية.
- التيارات بعد المشبكي قياسية (الأمنية الخاصة) من الخلايا مصححة الناجمة عن ضوئي من ChR2 معربا عن كور قبل المشبكيالخلايا العصبية متماثلة. كشف وقياس الأمنية الخاصة. تعيين الحد الأدنى لسعة ومساحة التيارات في 5 السلطة الفلسطينية و 20 جهاز كمبيوتر، على التوالي. تفقد يدويا هذه الأحداث لتجاهل أي آثار غير تكاليف خدمات المشروعات.
ملاحظة: لقد تم تكييف هذه الطريقة من أوكيتا وآخرون 10
8. العصبية التعريفي والصيانة من الشخصيات البشرية
ملاحظة: وقد وصفت هذه الطريقة التي كتبها لي وآخرون 11
9. تمايز الشخصيات الإنسان في الخلايا العصبية في المشارك الثقافات
10. تسجيلات الكهربية من الخلايا العصبية IPSC المشتقة
Representative Results
هنا، بروتوكول يصف الخطوات المتعددة التي ينطوي عليها توليد الثقافة المشتركة التي تتكون الخلايا النجمية، ويتضح الخلايا العصبية والخلايا العصبية القشرية الإنسان. تم الحصول على iPSCs الإنسان عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية باستخدام episomal ناقلات 10 و محدد في النسب العصبي مع كوكتيل من مثبطات جزيء صغير، مما يجعل الشخصيات 11 التي حافظت على كثافة عالية (الشكل 1A). مطلوبة عدة خطوات لتوليد الثقافة المشتركة: التفريق بين الشخصيات الماوس إلى الخلايا النجمية، والطلاء من الفئران الخلايا العصبية القشرية معربا عن ChR2، وزرع البذور من الشخصيات الإنسان الموسومة ب tdTomato (الشكل 1B). في يوم 2 من التمايز، الدبقية ييفي الحمضية البروتين (GFAP) + الخلايا النجمية يمكن بسهولة ملاحظة في ثقافاتنا (الشكل 1C). سمح الماوس الشخصيات التفريق لمدة أسبوع على الأقل قبل الطلاء العصبونات القشرية معربا عن ChR2 على أحادي الطبقة نجمية (1D الشكل). بعد 3إلى 4 أسابيع من التمايز البشري مجلس الشعب، تم الكشف عن tdTomato + الخلايا العصبية في الثقافات (الشكل 1E).
هذا النظام شارك في ثقافة يسمح كشف ثابت من التيارات بعد المشبكي من الخلايا العصبية الفردية IPSC المشتقة ردا على التحفيز الضوء (الشكل 2A). عندما يحفزه الضوء، تم إنشاؤها إمكانات العمل في الخلايا العصبية القشرية معربا عن ChR2 (الشكل 2B). IPSC المشتقة من الخلايا العصبية هي أيضا منفعل (الشكل 2C)، والتي تبين زيادة العمل المحتملين اطلاق مثل اتساع إزالة إستقطاب البقول الحالية وزيادة (الشكل 2D). وهكذا، وهذه الخلايا يحمل خصائص الخلايا العصبية الناضجة. في غياب الضوء، تلقت الخلايا العصبية IPSC المستمدة من مدخلات متشابك عفوية (الشكل 2E). تم بوساطة هذه التيارات بعد المشبكي إلى الداخل في الغالب عن طريق مستقبلات أمبا، لأن التيارات من خلال مستقبلات GABA ستكون الخارج ومستقبلات NMDA لا تحمل الحالير المحتمل عقد -70 بالسيارات. بعض من هذه المدخلات كانت على الأقل من الخلايا العصبية القشرية قبل المشبكي معربا عن ChR2، لأن التحفيز ضوء زيادة كبيرة في تواتر التيارات بعد المشبكي (الشكل 2E). يظهر مدار الساعة من هذه الزيادة في مدخلات متشابك في الشكل 2F: واستمر ضوئي من الخلايا العصبية القشرية طوال 30 ثانية ضوء فلاش طويلة. في حين تم رفع وتيرة الأمنية الخاصة عندما تم photostimulated ChR2 معربا عن الخلايا العصبية القشرية (الشكل 2G)، وكانت السعة بهم لم تتأثر (الشكل 2H). وباختصار، فإن هذه النتائج تشير إلى أن الخلايا العصبية IPSC المشتقة أظهرت خصائص الخلايا العصبية الناضجة، ويمكن أن تشكل اتصالات متشابك مع الخلايا العصبية القشرية قبل المشبكي.
الشكل 1: المخططات التخطيطي لتوليد شارك في ثقافةالنظام. (A) الجدول الزمني لإعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان في iPSCs والحث العصبي إلى اللجان التحضيرية الوطنية. (ب) الجدول الزمني للالتمايز النهائي من الشخصيات الإنسان في الخلايا العصبية الناضجة على الخلايا العصبية ونجمية الثقافات القشرية. (C) الفأر الشخصيات تفرق بسرعة إلى GFAP + الخلايا النجمية بعد 2 أيام في المختبر. (D) بعد أسبوع واحد، كانت مطلية الخلايا العصبية القشرية معربا عن ChR2 على GFAP + الخلايا النجمية. (E) في 4 إلى 5 أسابيع بعد تمايز الشخصيات البشرية، وأجريت التسجيلات الكهربية على tdTomato + الخلايا العصبية. الحانات النطاق تمثل 100 ميكرون.
الشكل 2: تحليل Optogenetic من اتصال متشابك وظيفية. وكانت (A) IPSC المشتقة من خلايا ذات الكلمات الدلالية مع tdTomato (الحمراء) شارك في تربيتها مع الخلايا العصبية القشرية معربا عن ضوء تنشيطقناة، ChR2 (الخضراء). تسجيلات من الخلايا العصبية IPSC المشتقة كشفت بعد المشبكي الحالية (PSC) الاستجابات، والتي يمكن أن تأتي إما من الخلايا العصبية القشرية أو الخلايا العصبية الأخرى IPSC مشتقة. (B) الإضاءة (الشريط الأزرق) أثار سلسلة من إمكانات العمل في الخلايا العصبية القشرية معربا عن ChR2. ( وأثار خلايا C) IPSC المشتقة عن طريق الحقن الحالي. (D) إطلاق النار مقابل منحنى الحالي للخلايا IPSC مشتقة. (E) ضوئي من الخلايا العصبية القشرية ChR2 معربا عن (الشريط الأزرق) زيادة وتيرة الأمنية الخاصة في الخلايا العصبية IPSC المشتقة . (F) الوقت بالطبع من الزيادة في وتيرة تكاليف دعم المشروعات التي تنتجها ضوئي. ويشير الشريط الأزرق وقت ضوئي. (G، H) في حين تم زيادة تواتر PSC التي كتبها ضوئي (G)، وكانت السعة PSC تتأثر (H). * يشير P <0.05 مقارنة مع السيطرة اختبار t الطالب.
Discussion
علم البصريات الوراثي يوفر الدقة الزمنية والمكانية لتفعيل السكان محددة من الخلايا العصبية (13). في تجاربنا، كانت مضاءة الحقل بأكمله من الهدف المجهر لمدة 30 ثانية إلى الصور تحفيز الخلايا العصبية القشرية الوحيدة معربا عن ChR2. وهذا ما سمح لنا لتحديد ما إذا تم تشكيل اتصالات متشابك بين مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية داخل الثقافة المشتركة. كشفت نتائجنا أن ضوئي يزيد تردد PSC في الخلايا العصبية IPSC المشتقة، والذي يدل على أن هذه الخلايا العصبية تستقبل مدخلات متشابك من الخلايا العصبية القشرية قبل المشبكي معربا عن ChR2. وهذا، بدوره، على أن الخلايا العصبية IPSC المستمدة من دمج بنجاح في الدوائر مع الخلايا العصبية القشرية.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة لتوليد هذا النظام المشترك الثقافة. من المهم للتأكد من أن الثقافات نجمية الماوس NPC المستمدة من يتمتعون بصحة جيدة، مع الحد الأدنى من موت الخلايا، قبل الشروع في الطلاءمن أنواع الخلايا الأخرى. العصبونات القشرية والشخصيات البشرية نعلق كذلك على الخلايا النجمية صحية والتسجيلات الكهربية تعتمد بشكل كبير على الظروف الثقافة. الخطوات الرئيسية الأخرى في هذا البروتوكول هي Electroporation للوالطلاء من الخلايا العصبية القشرية على الثقافات نجمية. كما عدد كبير من الخلايا تموت بعد Electroporation لل، فمن المهم التأكد من أن 6 ملايين على الأقل العصبونات القشرية وelectroporated لتصفيح على الثقافات نجمية في 24 لوحات جيدا. وقد لاحظنا أنه عندما تم electroporated أقل من 6 ملايين الخلايا، وعدد الخلايا العصبية التي البقاء على قيد الحياة لم تشكل شبكة العصبية الكثيفة، والتي أثرت التسجيلات الكهربية. وينبغي أيضا أن يكون عدد الخلايا العصبية القشرية electroporated ثابت لكل تجربة ثقافة مشتركة للسماح للمقارنة بين الدراسات المختلفة. لجميع الخطوات التي تنطوي على الهضم الأنزيمي، فمن الضروري عدم ترك الخلايا في حل الهضمي لفترة طويلة جدا لأنها قد تؤدي إلى موت الخلايا.
هذايمكن استخدام نهج لفحص قدرة الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الليفية المريض محددة لتشكيل اتصالات متشابك مع الخلايا العصبية الأخرى. الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الليفية من المرضى الذين يعانون من اضطراب النمو العصبي ريت المكتسب (RTT) يحمل عيوب انتقال متشابك: الخلايا العصبية RTT يحمل انخفاض ملحوظ في وتيرة PSC والسعة مقارنة مع الخلايا العصبية السليمة، ويفترض نظرا لأقل اتصال متشابك 14. يسمح نظامنا شارك في ثقافة فحص آثار المخدرات على الخلايا العصبية التي تظهر العيوب الخلقية. هذا يمكن القيام بها عن طريق إضافة مركبات من الفائدة خلال زرع البذور من الشخصيات البشرية المريضة وكذلك خلال التعرض المستمر لمركبات طوال الوقت من تمايز الخلايا العصبية.
في حين أن هذا النظام شارك في الثقافة يمكن أن تستخدم أيضا بوصفها نموذجا لاختبار المخدرات، وجود قيود مع هذا النهج هو أن عملية التحقيق في آثار كل مجمع مرشح يمكن أن تكون طويلة ومملة كماأنها ليست طريقة الفرز الإنتاجية العالية. بعد العلاج مع مركبات مرشح، الخلايا العصبية IPSC المشتقة يجب أن تكون مصححة بشكل فردي لتحديد الآثار المترتبة على كل مجمع على شركات الأمن الخاصة. وعلاوة على ذلك، هناك حاليا العديد من الخلايا الليفية لا المتاحة وiPSCs من المرضى. ولذلك، فإنه سوف تكون ذات فائدة في المستقبل القريب أن يكون أكثر خلايا المريض وأيضا على التكيف مع هذا البروتوكول لارتفاع الفرز الإنتاجية. على سبيل المثال، من خلال وصفها الخلايا العصبية IPSC المشتقة مع مؤشر النشاط، مثل أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا من الأيونات أو غشاء المحتملة، سيكون من الممكن زيادة معدل الإنتاجية بشكل كبير عن طريق إجراء الكهربية تستغرق وقتا طويلا، خطوة جانبية. كما أن العملية برمتها لتوليد هذا النظام شارك في الثقافة، من إعادة برمجة الخلايا الليفية إلى أداء التسجيلات الكهربية، يتطلب أكثر من 90 يوما، فمن المستحسن أن إما iPSCs الإنسان أو الشخصيات يتم توسيع، بعد إعادة برمجة والخطوات تحريض العصبية على التوالي،وcryopreserved إلى تقليص الوقت اللازم لإجراء التجارب في المستقبل.
في تجاربنا، عبرنا عن ChR2 في الخلايا العصبية القشرية تحت المروج synapsin1. لأن هذا هو المروج لعموم العصبية، ونحن يفترض تم photostimulating كل من الخلايا العصبية القشرية المثبطة ومثير. إذا كان الهدف من التجارب في المستقبل هو لاستجواب تحديدا الدوائر إما المثبطة أو مثير، يمكن أن تستخدم المروجين أكثر تحديدا. بدلا من ذلك، يمكن الحصول على الخلايا العصبية القشرية من المعدلة وراثيا (أو حقن فيروس الفئران) حيث يتم استهداف ChR2 التعبير خصيصا لمجموعات سكانية فرعية محددة وراثيا من الخلايا العصبية. على سبيل المثال، أعربت الأنسجة القشرية حصاد من ماوس التي لديها لجنة المساواة العرقية recombinase في interneurons التي تحتوي على parvalbumin (interneurons PV) التي عبرت مع ماوس مع floxed ChR2 سوف تسفر عن الحالة التي تكون فيها الخلايا العصبية القشرية الوحيدة معربا عن ChR2 سيكون interneurons PV 15. استخدام هذا ChR2 معربا عن interneurons في مشاركتنا في مكعبسوف نظام lture تمكين تحديد ما إذا كانت الخلايا العصبية مصححة IPSC المشتقة هي قادرة على أن تدرج في الدائرة مع interneurons PV.
واستنادا إلى دراسة سابقة 9، الخلايا العصبية القشرية ناضجة مع تداخل التشعبات بعد 14 يوما في المختبر. وهكذا، إذا لا ضوئي حصول على رد من الخلايا العصبية مصححة IPSC المشتقة، فإنه ينبغي أن تشير إلى أن الخلايا العصبية لا يملك القدرة على إجراء اتصالات متشابك مع الخلايا العصبية القشرية. والخلايا العصبية IPSC المشتقة هي قادرة على الحصول على مدخلات متشابك إما من الخلايا العصبية IPSC المشتقة الأخرى أو العصبونات القشرية. إذا استخدمت التصحيح التقليدي التسجيلات المشبك، فإنه لن يكون من الممكن التمييز حيث مدخلات متشابك قادم من. ميزة نظامنا هو أن الردود بعد المشبكي من المدخلات قبل المشبكي القشرية يمكن أثار انتقائي والتعرف. توفر الإجراءات المذكورة هنا مقاربة بسيطة لتقييم قدرة الخلايا العصبية IPSC المشتقة لدمجإلى شبكة الخلايا العصبية المحددة.
Acknowledgments
نشكر K. Deisseroth وS. جي للChR2 وSynapsin1-tdTomato يبني lentiviral على التوالي، C. تشاي لتبادل الخبرات وبروتوكول بشأن الجيل IPSC، WY يونغ للدعم الفني، وأعضاء المختبر جوه للمواد تقاسم والخبرات. وأيد هذا العمل من قبل ابوت التغذية ومركز الأكاديمية للتميز (ACE) على جائزة بحثية من شركة جلاكسو سميث كلاين (GSK) لELG، من مؤسسة أبحاث سنغافورة الوطنية في إطار برنامجها للبحوث التنافسية (جبهة الخلاص الوطني 2008 جبهة الخلاص الوطني-CRP 002-082) إلى ELG و GJA، ومعهد عالمي (WCI) برنامج المؤسسة الوطنية للبحوث كوريا (جبهة الخلاص الوطني) بتمويل من وزارة التعليم والعلوم والتكنولوجيا في كوريا (MEST) (جبهة الخلاص الوطني جرانت رقم: 2009-003 WCI) إلى GJA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurocult Proliferation Kit (Mouse) | STEMCELL Technologies | 5702 | Contains NSC Basal Medium and NSC Proliferation Supplement |
| Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | |
| DMEM/F12 | Lonza | 12719F | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| MEM without glutamine | Invitrogen | 11090081 | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| GlutaMAX supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140122 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Human LIF | Invitrogen | PHC9484 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotech | 130103926 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | |
| Compound E | Merck Millipore | 565790 | |
| EGF | Merck Millipore | 324856 | |
| FGF2 | R&D Systems | 233FB025 | |
| Research Grade FBS | Thermo Scientific | SV30160.03 | For astrocyte differentiation medium |
| Defined FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | For primary neuron medium |
| PBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | For primary neuron medium |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Heparin | EMD Millipore | 375095 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175095 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dispase II | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | For harvesting brains |
| EBSS | Invitrogen | 14155063 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 70 µm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 20 µm filter unit | Sartorius Stedim | 16534K | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4 | Fluka | 71505 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| D(+)-Glucose | Sigma | G7520 | For electrophysiological studies |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| KOH | KANTO Chemical | 3234400 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | For electrophysiological studies |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma | A7699 | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| Borosilicate glass capillaries | World precision instruments, Inc | 1604323 | |
| 15 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352070 | |
| 24-well plates | Corning | 9761146 | |
| 6-well plates | Corning | 720083 | |
| T25 flasks | Corning | 430641 | |
| 12 mm cover glasses | Marienfeld-Superior | 111520 | |
| AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit | Lonza | VPG1003 | For electroporation of primary cortical neurons |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | For electroporation of human fibroblasts |
| Mini Analysis | Synaptosoft | Mini Analysis v.6 | For measurement of PSCs |
| Normal Dermal Human Fibroblasts | PromoCell | C12300 | |
| pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE | Addgene | 20945 | |
| Mercury short-arc lamp | OSRAM | HBO 103 W/2 |
References
- Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Stroh, A., et al. Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation. Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).
- Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -C. Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).
- Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).
- Braun, H., Günther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).
- Shivaraj, M. C., et al. Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain. PLoS ONE. 7, e42935 (2012).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).
- Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
- Marchetto, M. C. N., et al. A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, 160 (2013).
