Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

En optogenetic fremgangsmåde for vurdering af Dannelse af neuronal forbindelser i en co-kultur System

Published: February 17, 2015 doi: 10.3791/52408
* These authors contributed equally

Introduction

I de seneste år har vores forståelse af neuron og neuronal kredsløbsfunktion blevet revolutioneret af flere optogenetic værktøjer, der styrer neuronal excitabilitet. Et af midlerne hertil er lysaktiveret kation kanal, channelrhodopsin-2 (CHR2): neuroner udtrykker CHR2 brand aktionspotentialer som reaktion på lys stimulation 1-3. Fordi neuroner er normalt ikke følsomme over for lys, denne bemærkelsesværdige evne åbner nye muligheder for den præcise tidsmæssige og rumlige styring af aktiviteten af genetisk definerede populationer af neuroner 4 og har i høj grad accelereret studier af hjernens funktion. CHR2 er blevet anvendt på stamcelleforskning til forskellige formål, fra overvågning neuronal udvikling 5 til at regulere aktiviteten af neurale netværk 6.

Her anvendte vi CHR2 at øge anvendeligheden af ​​en neuronal co-dyrkningssystem. Co-kultur systemer gør det muligt at vurdere samspillet mellem forskellige celletyper.Co-kulturer af neuroner og glia, de vigtigste celletyper i nervesystemet, er almindeligt anvendt til at undersøge signalering mellem disse forskellige celletyper, samt at vurdere betydningen af ​​denne signalering for fysiologiske reaktioner, spredning af skader og til at undersøge molekylære mekanismer, der potentielt er involveret i denne signalering 7. En tidligere undersøgelse har vist, at humane iPSCs differentiere meget hurtigt til neuroner i nærvær af rotte corticale primær kultur indeholdende neuroner, astrocytter, oligodendrocytter og mikroglia 8.

I denne protokol, viser vi en metode, der udnytter CHR2 i en co-kultur for at afhøre synaptiske forbindelser mellem rotte corticale neuroner og neuroner fra humane inducerede pluripotente stamceller (iPSCs). Vi beskriver skridt til at dissekere og høst hjernevæv 9 samt at vedligeholde og differentiere mus neurale stamceller (NPCs) i astrocytter og menneskelige NPCs into neuroner at skabe co-kultur-systemet. For at etablere dette samarbejde dyrkningssystem, vi brugte den beskrevet af Okita et al integration uden omprogrammering metode. 10 til at generere humane iPSCs. Disse iPSCs blev derefter effektivt differentieret i NPC'ere i kemisk definerede betingelser ved brug små molekyler inhibitorer som beskrevet af Li et al. 11

I co-kulturer, kan identificeres af de forskellige populationer af neuroner via påvisning af CHR2 ekspression i corticale neuroner og tagging af iPSC-afledte neuroner via fluorescerende protein, tandem-dimer Tomat (tdTomato). Kombination elektrofysiologiske optagelser fra iPSC-afledte neuroner med optogenetic photostimulation af kortikale neuroner muligt at vurdere evnen af ​​disse to typer af neuroner til at danne kredsløb med hinanden. Specifikt photostimulation af CHR2-udtrykkende kortikale neuroner fremkalde synaptiske reaktioner i iPSC-afledte neuroner, der har dannet synaptiske kredsløbmed photostimulated cortical neuron netværk. Vi viser, at øget postsynaptiske strømme faktisk opdages i iPSC-afledte neuroner under sådanne forhold. Denne protokol tillader vurdering af synaptisk kredsløb under en række eksperimentelle betingelser, herunder sammenfatning af forskellige neurologiske sygdomsmodeller ved hjælp iPSCs afledt fra fibroblaster fra patienter sygdom.

Protocol

BEMÆRK: Alle forsøg udføres efter protokoller godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på SingHealth.

1. Høst tidlige postnatale Mouse Brains

  1. Før dissektion forberede hippocampus vævsfordøjelse opløsning: 10 pi papain pr 1 ml 1x Earles Balanced Salt Solution (EBSS) (+ 1% HEPES) med Deoxyribonuclease I (DNase I) (250 U / ml) og Dispase II (1 U / ml). Gør ca. 2,5 ml af vævsfordøjelse opløsningen og filtreres under anvendelse af en 0,20 um filterenhed. Hold opløsningen varm ved 37 ° C indtil anvendelse.
  2. Bedøve postnatal dag 5 (P5) mus hvalpe ved at sætte dem i is i 5 min. Fjern fra is og test for smerte refleks via tå eller hale knibe. Spray hvalpene med 70% ethanol. Halshugge hvalpene og placere hovedet i en petriskål over is.
  3. Lave et snit i huden langs midterlinjen fra bunden af ​​kraniet til næsen, med et par små scissors eller fine Dissecting pincet. Peel åbne huden og gør et lignende snit gennem kraniet. Lav to yderligere horisontale snit på hver side af kraniet, en rostralt (ved bregma) og en caudal (ved lambda).
  4. Peel åbne kraniet langs snit linier for at eksponere den underliggende hjerne. Brug en pincet til at fjerne kraniet overliggende olfaktoriske pærer, og enhver midterlinjen knogle mellem dem. Gør dette, mens du holder hovedet stabilt med en pincet i den ikke-dissekere hånd.
  5. Ease den flade del af en spatel mellem den ventrale del af hjernen og basen af ​​kraniet ved den kaudale ende. Holde spatel parallelt med bunden af ​​kraniet under hjernen, flytte den mod rostrale ende af kraniet for at adskille eventuelle adhæsioner mellem hjernen og bunden af ​​kraniet.
    1. Scoop hjernen ud med spatel og læg den i en petriskål indeholdende iskold 1x EBSS (+ 1% HEPES). Hold væv nedsænket på alle tidspunkter.
  6. For allemikro-dissektion trin, arbejder under et dissektionsmikroskop og bruge et par fine Dissecting tang i hver hånd, en til at skære væv og andre til at holde vævet stabil.
  7. Lav et snit lige posteriort for hjernebarken at adskille den fra baghjerne. Skær langs midterlinjen at adskille hjernebarken i sine to halvdele. Fjern meninges fra hjernehalvdele.
  8. Placer en halvkugle mediale side op og sæt pincet i den laterale ventrikel under hippocampus. Skær væk midthjernen.
    1. Foretag udskæringer ved de øvre og nedre ender af hippocampus, og i nærheden gyrus / entorhinal cortex junction at isolere hippocampus fra cortex. Opsaml hippocampi i en skål indeholdende iskold 1x EBSS (+ 1% HEPES).

2. Hippocampal Tissue Dissociation

  1. Overfør hippocampi til en skål indeholdende forvarmet hippocampus vævsfordøjelse opløsning. Mince than Hippocampale væv til så fint som muligt, og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C.
  2. Forsigtigt adskille væv i enkelte celler ved mekaniske pipettering og overførsel celler i et 15 ml centrifugerør.
  3. Centrifuger ved 200 xg i 5 minutter, og supernatanten fjernes.
  4. Resuspender cellepellet i 20 ml 0,5X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) indeholdende saccharose (0,9 M) og centrifugeres ved 200 xg i 10 min.
  5. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 2 ml NPC vedligeholdelse medium (tabel 1), placeret på toppen af 10 ml 4% bovint serumalbumin (BSA) i 1X EBSS opløsning og centrifugeres ved 200 xg i 5 min.
  6. Fjern supernatanten og tilsæt mus NPC vedligeholdelse medium (tabel 1) til cellepelleten. Forsigtigt pipettere op og ned 5-10 gange for at sikre cellepellet er opdelt i enkelte celler.
  7. Overfør medium indeholdende celler i præcoatede Matrigel plader og tilføj epidermal vækstfaktor (EGF) og fibroblast vækstfaktor 2 (FGF2) (både 20 ng / ml) i heparin (5 mg / ml). Pladerne inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.

3. Vedligeholdelse af adhærente Mouse Hippocampal NPCs

  1. Forbered de coatede plader / kolber mindst en time før passage mus hippocampale NPC. Tilføj nok Matrigel at dække overfladearealet af hver plade eller kolbe og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
  2. Fjern medier fra 90% konfluente mus NPC kulturer og vask en gang med 1x phosphatpufret saltvand (PBS) og derefter aspireres PBS off.
  3. Tilføj nok celle løsrivelse løsning til at dække alle brønde / kolber og inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C.
  4. Sørg for, at alle celler har fritliggende ved at kigge under et omvendt lyse felt mikroskop ved 10X forstørrelse. Hvis der stadig er celler fastgjort, inkuberes dyrkningsbeholderen i yderligere 1-2 min og tjek celler igen. Tilføj dobbelte af Dulbeccos Modified Eagle Medium / Hams F-12 Nutrient Mixture (DMEM / F-12)som celle løsrivelse opløsning til brøndene / kolber, når alle cellerne er fritliggende.
  5. Overførsel DMEM / F-12 indeholdende celler i et 15 ml centrifugerør og centrifugeres ved 200 xg i 5 min.
  6. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 5 ml af muse NPC vedligeholdelse medium (tabel 1). Forsigtigt pipettere op og ned for at bryde op cellepellet i enkeltceller.
  7. Plate en tredjedel af de samlede celler i nye dyrkningsbrønde / kolber og top op tilstrækkelig dyrkningsmedium suppleret med EGF og FGF2. Inkuber dyrkningsbeholdere ved 37 ° C og 5% CO2. Påfyld medium hver anden dag og opdele celler 1: 3 hver 3 til 4 dage. Undgå overvækst af muse NPC kulturer at forhindre aggregering og løsgørelse.

4. Differentiering af Mouse NPCs i Astrocyter

  1. Forbered poly-L-lysin (PLL) / lamininovertrukne 12 mm dækglas mindst en dag i forvejen, før du starter differentiering af muse NPC'ere i astrocytter. Tilføj coverslips i en 24-brønds plade og dækker hele overfladen af ​​brønde med tilstrækkelig PLL (1 mg / ml i boratpuffer).
    1. Inkubér pladen natten over ved 4 ° C. Den følgende dag fjernes PLL og vaskes en gang med 1x PBS.
  2. Tilføj laminin (1 mg / ml i iskold DMEM / F-12), igen dækker hele overfladen af ​​hver brønd, derefter inkuberes i mindst 4 timer ved 37 ° C.
  3. Fjern medier fra mus NPC kulturer og vask en gang med 1x PBS derefter aspireres PBS off.
  4. Tilføj nok celle løsrivelse løsning til at dække alle brønde / kolber og inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C.
  5. Sørg for, at alle celler har løsrevet derefter tilføje det dobbelte af DMEM / F-12 som for celle detachement løsning til brøndene / kolber.
  6. Overførsel DMEM / F-12 indeholdende celler i et 15 ml centrifugerør og centrifugeres ved 200 xg i 5 min.
  7. Fjern supernatanten og resuspender cellerne i 5 ml astrocyt differentiering medium (tabel 1). Forsigtigt pipette celle suspension op og ned for at bryde op cellepellet i enkeltceller. Tæl antallet af enlige celler med en hæmocytometer.
  8. Plate celler ved 5 x 10 4 celler / cm2 i 500 pi medium til hver brønd i en 24-brønds plade. Pladerne inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2. Erstat halvdelen af ​​mediet med frisk medium hver anden dag. Mus NPC'ere hurtigt differentiere til astrocytter inden for 2 dage, og er differentieret i en uge, før de påbegynder yderligere eksperimenter.

5. Høst embryonale rottehjerner og cortexvæv Dissociation

  1. Fjern astrocyt differentiering medium (tabel 1) fra astrocytkulturer og erstatte med primære neuron medium (tabel 1) mindst 4 timer forud for påbegyndelse af høst af embryonale rottehjerner.
  2. Før dissektion, forberede cortexvæv fordøjelsen løsning: 10 pi papain per 1 ml 1x EBSS (+ 1% HEPES) med 12,1 mg / ml L-cystein. Gør cirka 2.5 Ml af væv fordøjelsen løsning og filtrere det ved hjælp af en 0,20 um filterenhed. Hold opløsningen varm ved 37 ° C indtil anvendelse.
  3. Aflive den gravide dæmningen ved kuldioxid kvælning med komprimeret gas. Test for smerte refleks via tå eller hale knibe.
  4. Læg dyret ventrale side op på en absorberende pude og suge sin maveregion med 70% ethanol. Klem huden med en pincet og gøre en lateral incision med et par kirurgiske sakse, bred nok til at eksponere maven. Tag fat bughinden med pincet og skar bughulen.
  5. Løft livmoderhorn med pincet og skær det fri langs mesometrium. Placer dissekerede livmoderen i en petriskål over is. Adskil hvert foster ved at skære livmodervæv mellem dem.
    1. Lav et snit i embryonale vej. Shell forsigtigt fosteret ud gennem åbningen. Halshugge fosteret og placere hovedet i en petriskål over is.
  6. For at høste embryonic rottehjerner Følg beskrivelsen fra trin 1,3-1,5.
    1. At dissekere kortikale væv, placere en hjernehalvdel lateral side op. Skær halvkugle i to sideværts fra midten. Kassér halvdel tættere på bunden af ​​hjernen. Trim det udskårne væv for at fjerne midthjernen.
  7. Overfør corticale væv til en skål indeholdende forvarmet cortexvæv fordøjelse opløsning. Mos corticale væv til så fint som muligt, og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C.
  8. Overfør corticale væv fra vævsfordøjelse opløsningen til en 50 ml centrifugerør indeholdende 10 ml forvarmet primære neuron-medium (tabel 1). Adskille de kortikale væv ved gentagen pipettering dem op og ned i en serologisk pipette, indtil en homogen opløsning uden væv stykker opnås.
  9. Pass vævet løsning gennem en 70 pm cellefilter at bortfiltrere resterende væv klumper. Alikvot vævet opløsning i 15 mlcentrifugerør, tilsætte ca. 3 ml i hvert rør.
  10. Tilføj 800 pi 7,5% BSA i 1X PBS til bunden af ​​hvert rør, der danner to lag med vævet løsning på toppen og BSA i bunden.
  11. Centrifuger ved 200 x g i 5 min. Fjern supernatanten, opsugning fra grænsefladen af ​​de to lag. Undgå forstyrre cellepelleten ved bunden af ​​røret.
  12. Resuspender hver celle pellet i 1 ml primære neuron-medium (tabel 1) og kombinere dem i en 15 ml centrifugerør. Bestem celledensiteten anvendelse af et hæmocytometer.

6. Elektroporation og Plating af Primary corticalneuroner

BEMÆRK: Genoverførsel kan opnås ved hjælp af flere metoder, herunder elektroporering, calciumphosphat-transfektion og viral transduktion. I denne protokol, beskriver vi elektroporation at levere CHR2 konstruere i primære kortikale neuroner.

  1. Centrifuge 6 x 10 6 rotte corticale neuroner ett 200 xg i 5 minutter, og supernatanten fjernes. Der kræves mindst 6 x 10 6 kortikale neuroner for elektroporation at sikre dannelsen af en neuronal netværk ved at overleve neuroner.
  2. Tilsæt 100 pi elektroporation løsning til celle pellet og resuspenderes forsigtigt. Kombiner 100 pi af cellesuspensionen med 6 ug pLenti-synapsin-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE 4 plasmid og overføres til en certificeret kuvette. Undgå at producere luftbobler under overførslen.
  3. Vælg og anvende passende program for elektroporation i henhold til producentens anvisninger.
  4. Efter elektroporation, tilsættes 500 pi MEM til celle / DNA suspension til kuvetten. Overfør prøven i 11,5 ml primære neuron-medium (tabel 1) og resuspenderes forsigtigt. Den totale mængde af mediet er tilstrækkelig til en hel plade med 24 brønde. Aliquot 500 pi medium til hver brønd af en 24-brønds plade. Inkubér pladen ved 37 ° C og 5% CO2.
  5. 7. generation af induceret pluripotente stamceller

    BEMÆRK:. Denne metode er blevet tilpasset fra Okita et al 10

    1. Kultur humane fibroblaster i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) i 6-brønds plader.
    2. Forud for påbegyndelse af omprogrammering af fibroblaster, coat 6-brønde med Matrigel og inkuberes i mindst en time ved stuetemperatur. Ved 80% konfluens, fjernes mediet fra fibroblastkulturer og vaskes en gang med 1x PBS.
    3. Tilsæt tilstrækkeligt 0,25% trypsin-EDTA at dække hele pladen og inkuber ved 37 ° C i 10 min.
    4. Når cellerne er løsnet fra brønde, tilsæt to gange mængden af ​​DMEM med 10% FBS som i trypsin for at standse trypsin fordøjelse. Forsigtigt pipette cellesuspension op og ned for at bryde op celler. Tæl antallet af enlige celler med en hæmocytometer.
    5. Transfer 7 x 10 5 celler i et 15 ml centrifugerør og centrifugeres cellesuspensionen ved 200 xg i 5min.
    6. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i elektroporation opløsning. Elektroporere fibroblasterne i henhold til producentens anvisninger. Resuspender celler i 100 pi elektroporering buffer og tilsættes 1 ug af hver episomal vektor. Elektroporere celler med indstillinger af 1.650 V, 10 ms og 3 gang pulser.
    7. Transfer cellesuspension i DMEM suppleret med 10% FBS og pladen 5 x 10 4 celler pr brønd i en 6-brønds plade. Pladerne inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
    8. Efter 48 timer, fjerne medier fra transficerede fibroblastkulturer og erstatte med mTeSR medium. Udskift dyrkningsmedier dagligt indtil induceret pluripotente stamceller (IPSC) kolonier er klar til at blive isoleret. IPSC kolonier kan observeres efter 28-35 dage.
    9. Når klar til isolering, mekanisk skåret en iPSC koloni og reseed i mTeSR medium med 10 uM Rho-associeret protein kinase (ROCK) inhibitor (Y-27632) på en Matrigel coated 6-brønds plade 12. Erstat dyrkningsmedium dagligt.

    8. Neural Induktion og vedligeholdelse af menneskelige NPCs

    BEMÆRK:. Denne metode er beskrevet af Li et al 11

    1. Da IPSC kulturer er omkring 20% konfluens, fjernes mTeSR medium og erstatte med neural induktion medium (tabel 1). Replenish medium hver anden dag.
    2. Efter 7 dage fjerne neural induktion medium og erstatte med human NPC vedligeholdelse medium (tabel 1). Påfyld medium hver anden dag op til 7 dage før passage kulturer.
    3. Forud for passage kulturer, coat plader / kolber med Matrigel ved stuetemperatur i mindst en time.
    4. Fjern medier fra konfluerende humane NPC kulturer og vask en gang med 1x PBS derefter aspireres PBS off.
    5. Tilføj nok celle løsrivelse løsning til at dække alle brønde derefter inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C.
    6. Sørg for, at alle celler har fritliggende. Tilføj dobbelte af DMEM /F-12 som celle løsrivelse opløsning til brøndene / kolber.
    7. Overførsel DMEM / F-12 indeholdende celler i et 15 ml centrifugerør og centrifugeres ved 200 xg i 5 min.
    8. Fjern supernatanten og resuspender cellerne i 5 ml human NPC vedligeholdelse medium (tabel 1). Forsigtigt pipette cellesuspension op og ned for at bryde op celler.
    9. Plade en tredjedel af de samlede celler i Matrigel coatede dyrkningsbrønde / kolber og top op tilstrækkelig medium suppleret med 10 pM Y-27632. Inkuber dyrkningsbeholdere ved 37 ° C og 5% CO2.
      1. Split kulturer 1: 3 hver 3 til 4 dage og genopbygge medium hver anden dag. Oprethold humane NPC kulturer med høj densitet for at forhindre differentiation.

    9. differentiering af humane NPCs til neuroner i co-kulturer

    1. Tilføj lentivirusvektoren Synapsin1-tdTomato til humant NPC kultur, før du starter differentiering i neuroner. Forbered astrocyt / kortikal neuron co-kultureren dag i forvejen, før differentiere menneskelige NPC'ere.
    2. Vask humane NPC kulturer gang med 1x PBS og tilføje nok celle løsrivelse løsning til at dække alle brønde / kolber derefter inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C.
    3. Sørg for, at alle celler har fritliggende. Tilføj to gange mængden af ​​DMEM / F-12 som celle løsrivelse opløsning til brøndene / kolber. Overførsel til en 15 ml centrifugerør. Centrifuger ved 200 x g i 5 min.
    4. Fjern supernatanten og resuspender cellerne i 5 ml neuronal differentiering medium (tabel 1). Forsigtigt pipette cellesuspension op og ned for at bryde op cellepellet i enkeltceller. Tæl antallet af enlige celler med en hæmocytometer.
    5. Aspireres forsigtigt medium fra astrocyt / corticale neuron kulturer. Plate menneskelige NPCs på 5 x 10 3 celler / cm2 i 500 pi neuronal differentiering medium (tabel 1) suppleret med 10 pM Y-27632 for hver 24 brønde. Forsigtigt tilføje medium indeholdende humane NPC i hver brøndat undgå at forstyrre astrocytter og corticale neuroner.
    6. Pladerne inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2. Erstat halvdelen af ​​mediet med frisk medium hver to til tre dage i mindst 28 dage.

    10. Elektrofysiologiske Optagelser af iPSC-afledte Neuroner

    1. Bekræft, om menneskelige iPSCs opfører sig som modne neuroner.
      1. Find celler differentierede fra humane iPSCs ved visualisering af tdTomato hjælp af en opretstående konfokal mikroskop udstyret med en 60X (0,9 NA) vand nedsænkning linse.
      2. Træk optagelse pipette til en modstand på 4 til 6 M. perfundere celler ved stuetemperatur i en ekstern opløsning (tabel 1) boblet konstant med 95% O 2/5% CO2. Fyld optagelsen mikropipette med indre opløsning (tabel 1).
      3. Patch tdTomato + celle i hel-celle-tilstand og optage aktionspotentiale fyring som reaktion på aktuelle injektion (1 sek varighed, 10 Pa trin) i CURleje klemme.
    2. Bekræft hvis virkningspotentiale af kortikale celler, der udtrykker CHR2 pålideligt er fremkaldt af lys stimulation.
      1. Find corticale celler, der udtrykker CHR2 ved visualisering af GFP under et konfokalt mikroskop. Udfør hel-celle patch clamp optagelse på kortikale celler ved at følge trin 10.1.2 til 10.1.3.
      2. Check handling potentiale pålideligt fremkaldt af lys belysning med kviksølv bue lampe (100 W). Bølgelængden af ​​excitation filter er 480/40 nm.
    3. Udfør optogenetic stimulation.
      1. Patch tdTomato + celle i hel-celle-funktion og sæt spænding klemme på -70mV. Filter aktuelle signaler ved 2 kHz og digitalisere ved 10 kHz. Overvåg serie modstande fra 10 til 20 m for konsistens under optagelser.
      2. Stimuler hele feltet med 100 W kviksølv lampe med 480/40 nm excitationsfilter i 30 sek.
      3. Optag postsynaptiske strømme (PSC) af patched celle induceret af photostimulation af CHR2-udtrykkende præsynaptiske cortiske neuroner. Detektere og måle kvikskrankerne. Indstil tærskel for amplitude og strømforhold område ved 5 pA og 20 pct hhv. Manuelt inspicere disse begivenheder til at skille sig enhver ikke-PSC spor.

Representative Results

Her en protokol beskriver flere trin involveret i frembringelse af en co-kultur bestående astrocytter, corticale neuroner og humane neuroner er illustreret. Humane iPSCs blev opnået ved omprogrammering fibroblaster hjælp episomal vektorer 10 og specificeret i et neuralt afstamning med en cocktail af lille-molekyle-inhibitorer, hvilket gør NPC 11, som blev opretholdt ved høj densitet (figur 1A). Flere trin er nødvendige for at generere co-kultur: differentiering af muse NPC'ere i astrocytter, plating af rotte corticale neuroner udtrykker CHR2, og såning af menneskelige NPCs tagget med tdTomato (figur 1B). På dag 2 af differentiering, kan let observeres gliafibrillært surt protein (GFAP) + astrocytter i vore kulturer (figur 1C). Mouse NPC'ere fik lov til at differentiere i mindst en uge før udpladning corticale neuroner udtrykker CHR2 på astrocyt monolag (figur 1D). Efter 3til 4 uger human NPC differentiering blev tdTomato + neuroner påvist i kulturer (figur 1E).

Denne co-kultur system tillader konsekvent detektering af postsynaptiske strømme fra individuelle iPSC-afledte neuroner som reaktion på lys stimulation (figur 2A). Når de stimuleres af lys, blev virkningspotentialer genereres i corticale neuroner udtrykker CHR2 (figur 2B). iPSC afledt neuroner er også samledes (figur 2C), hvilket viser øget aktionspotentialet fyring som amplituden af depolariserende strømpulser blev forøget (figur 2D). Således udviser disse celler modne neuronale egenskaber. I mangel af lys, iPSC-afledte neuroner modtaget spontane synaptiske input (Figur 2E). Disse indad postsynaptiske strømninger blev overvejende medieret af AMPA-receptorer, fordi strømme gennem GABA-receptorer ville være passiv og NMDA-receptorer ikke bære strøm at bedriften potentiale -70 mV. I det mindste nogle af disse indgange var fra præsynaptiske corticale neuroner udtrykker CHR2, fordi lyset stimulation stærkt forøget hyppighed af postsynaptiske strømme (figur 2e). Tidsforløbet for denne stigning i synaptisk input er vist i figur 2F: photostimulation af kortikale neuroner blev opretholdt i hele 30 sek lange lys flash. Mens hyppigheden af PSC blev forhøjet, når CHR2-udtrykkende kortikale neuroner blev photostimulated (figur 2G), deres amplitude var upåvirket (fig 2H). Sammenfattende indikerer disse resultater, at de iPSC-afledte neuroner udviste modne neuronale egenskaber og kan danne synaptiske forbindelser med præsynaptiske corticale neuroner.

Figur 1
Figur 1: Skematisk tegning for genereringen af co-kultursystem. (A) Tidslinje for omprogrammering humane fibroblaster i iPSCs og neurale induktion til NPC'ere. (B) Tidslinje for terminal differentiering af humane NPC'ere til modne neuroner på kortikale neuron og astrocytkulturer. (C) mus NPC'ere hurtigt differentiere til GFAP + astrocytter efter 2 dage in vitro (D). Efter en uge blev corticale neuroner udtrykker CHR2 udpladet på GFAP + astrocytter. (E) ved 4 til 5 uger efter differentiering af humane NPC blev elektrofysiologiske optagelser udført på tdTomato + neuroner. Scale søjler repræsenterer 100 um.

Figur 2
Figur 2: optogenetic analyse af funktionel synaptisk forbindelse. (A) iPSC-afledte celler mærket med tdTomato (rød) blev co-dyrket med corticale neuroner udtrykker lysaktiveretkanal, CHR2 (grøn). Optagelser fra iPSC-afledte neuroner afslørede postsynaptiske nuværende (PSC) svar, som kunne komme fra enten kortikale neuroner eller andre iPSC-afledte neuroner. (B) Belysning (blå bjælke) fremkaldte en række aktionspotentialer i kortikale neuroner udtrykker CHR2. ( C) iPSC-afledte celler fremkaldt af aktuelle injektion. (D) Firing vs nuværende kurve for iPSC-afledte celler. (E) Photostimulation af CHR2-udtrykkende kortikale neuroner (blå bjælke) øgede hyppigheden af kvikskranker i iPSC-afledte neuroner . (F) Tidsforløb af stigningen i PSC frekvens produceret af photostimulation. Blå bjælke angiver tidspunkt for photostimulation. (G, H) Mens PSC frekvens blev forhøjet med photostimulation (G), PSC amplitude var upåvirket (H). * Angiver p <0,05 sammenlignet med kontrol med T-test.

Discussion

Optogenetics giver tidsmæssig og rumlig præcision for aktivering af definerede populationer af neuroner 13. I vores forsøg blev hele området for mikroskopobjektivet belyst i 30 sek til foto-stimulere kun kortikale neuroner udtrykker CHR2. Dette tillod os at bestemme, om synaptiske forbindelser blev dannet mellem forskellige populationer af neuroner i co-kultur. Vores resultater viste, at photostimulation øger PSC frekvens i iPSC-afledte neuroner, der viser, at disse neuroner modtager synaptisk input fra præsynaptiske corticale neuroner udtrykker CHR2. Dette, til gengæld fast, at IPSC-afledte neuroner held indarbejdet i kredsløb med de kortikale neuroner.

Der er flere kritiske trin til generering af denne co-kultur-systemet. Det er vigtigt at sikre, at de muse NPC-afledte astrocytkulturer er sunde, med minimal celledød, inden der fortsættes med pletteringaf andre celletyper. Corticalneuroner og menneskelige NPCs vedhæfte godt på sunde astrocytter og elektrofysiologiske optagelser er stærkt afhængige af dyrkningsbetingelser. De andre vigtige skridt i denne protokol er det elektroporation og plettering af kortikale neuroner på astrocytkulturer. Da et stort antal af celler dør efter elektroporering, er det vigtigt at sikre, at mindst 6 millioner kortikale neuroner er elektroporeret for udpladning på astrocytkulturer i 24-brønds plader. Vi har observeret, at når færre end 6 millioner celler blev elektroporeret, havde antallet af neuroner, der overlever ikke danner en tæt neuronal netværk, hvilket påvirkede elektrofysiologiske optagelser. Antallet af elektroporerede kortikale neuroner bør også være i overensstemmelse for hver co-kultur eksperiment for at muliggøre sammenligning mellem forskellige studier. For alle trin, der involverer enzymatisk fordøjelse, er det vigtigt ikke at lade celler i fordøjelsessystemet løsning for længe, ​​da det kan føre til celledød.

Dettefremgangsmåde kan anvendes til at screene evnen af ​​neuroner afledt fra patient-specifikke fibroblaster til dannelse synaptiske kontakter med andre neuroner. Neuroner afledt fra fibroblaster fra patienter, der lider af neurologisk lidelse Rett Syndrome (RTT) udviser synaptisk transmission fejl: RTT neuroner udviser et signifikant fald i PSC frekvens og amplitude sammenlignet med raske neuroner, formodentlig på grund af mindre synaptisk forbindelse 14. Vores co-kultur system tillader undersøgelse af effekter narkotika på neuroner udviser udviklingsmæssige defekter. Dette kan udføres ved tilsætning af forbindelser af interesse under såning af syge humane NPC samt under kontinuerlig eksponering til forbindelser hele tiden af ​​neuronal differentiering.

Mens dette co-kultursystem kan også anvendes som en model for test af lægemidler, en begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at processen med at undersøge virkningerne af hver kandidat forbindelse kan være lang og kedelig somdet er ikke en high-throughput screening-metode. Efter behandling med kandidatforbindelser, iPSC-afledte neuroner skal være individuelt lappet at bestemme virkningerne af hver forbindelse på kvikskranker. Desuden er der i øjeblikket ikke mange tilgængelige fibroblaster og iPSCs fra patienter. Derfor vil det være af interesse i den nærmeste fremtid for at få mere tålmodig celler og også for at tilpasse denne protokol til high throughput screening. For eksempel ved mærkning iPSC-afledte neuroner med en indikator, såsom genetisk kodede sensorer ioner eller membranpotentiale, ville det være muligt i væsentlig grad at øge gennemløb rente med side-stepping tidskrævende elektrofysiologiske procedure. Da hele processen med at generere denne co-kultur-systemet, fra omprogrammering fibroblaster til at udføre elektrofysiologiske optagelser, kræver mere end 90 dage, anbefales det, at enten de menneskelige iPSCs eller NPC'ere udvides efter omprogrammering og neurale induktion skridt henholdsvisog kryokonserveret at reducere den nødvendige tid for fremtidige eksperimenter.

I vores eksperimenter, vi udtrykte CHR2 i corticale neuroner under synapsin1 promotoren. Fordi denne promotor er pan-neuronal vi formentlig blev photostimulating både inhiberende og excitatoriske corticale neuroner. Hvis målet for fremtidige eksperimenter er specifikt afhøre enten hæmmende eller excitatoriske kredsløb, kunne mere specifikke promotorer anvendes. Alternativt kunne kortikale neuroner opnås fra transgene (eller virus-injicerede mus) hvor CHR2 udtryk er specifikt målrettet til genetisk definerede subpopulationer af neuroner. For eksempel høst corticale væv fra en mus, der har Cre-rekombinase udtrykt i parvalbumin indeholdende interneuroner (PV interneuroner), der krydses med en mus med floxed CHR2 vil give en situation, hvor de eneste corticale neuroner udtrykker CHR2 bliver PV interneuroner 15. Anvendelsen af ​​sådanne CHR2-udtrykkende interneuroner i vores co-culture systemet vil gøre det muligt at fastslå, om en lappet iPSC-afledt neuron er i stand til at indarbejde i et kredsløb med PV interneuroner.

Baseret på en tidligere undersøgelse 9 kortikale neuroner er modne med overlappende dendritter efter 14 dage in vitro. Således, hvis photostimulation ikke fremkalder en reaktion fra en patched iPSC-afledt neuron, bør det indikere, at neuron ikke har evnen til at gøre synaptiske forbindelser med corticale neuroner. En iPSC afledt neuron er i stand til at modtage synaptisk input fra enten andre iPSC-afledte neuroner eller corticale neuroner. Hvis der blev anvendt traditionelle patch clamp optagelser, ville det ikke være muligt at skelne, hvor synaptiske input kommer fra. Fordelen ved vores system er, at postsynaptiske svar fra kortikal præsynaptiske indgang kan selektivt fremkaldte og identificeret. Procedurerne her tilvejebringe en enkel fremgangsmåde til at evaluere evnen til iPSC-afledte neuroner til at integrerei et afgrænset neuronal netværk.

Acknowledgments

Vi takker K. Deisseroth og S. Je for CHR2 og Synapsin1-tdTomato lentivirale konstruktioner henholdsvis C. Chai til deling ekspertise og protokol om iPSC generation, WY Leong for teknisk support, medlemmer af Goh laboratorium for deling reagenser og ekspertise. Dette arbejde blev støttet af Abbott Ernæring og Akademisk Centre of Excellence (ACE) forskningspris fra GlaxoSmithKline (GSK) til ELG, af National Research Foundation Singapore under sin konkurrencemæssige Research Program (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) til ELG og GJA, og af World Class Institute (WCI) Program for National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for undervisning, videnskab og teknologi Korea (MEST) (NRF Grant Nummer: WCI 2009-003) til GJA

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurocult Proliferation Kit (Mouse) STEMCELL Technologies 5702 Contains NSC Basal Medium and NSC Proliferation Supplement
Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit Invitrogen A15960
DMEM/F12 Lonza 12719F
Matrigel BD Biosciences 354277
Neurobasal medium Invitrogen 21103049
MEM without glutamine Invitrogen 11090081
N2 Invitrogen 17502048
B27 Invitrogen 17504044
L-glutamine Invitrogen 25030081
GlutaMAX supplement Invitrogen 35050061
PenStrep Invitrogen 15140122
BSA Sigma A7906
Human LIF Invitrogen PHC9484
CHIR99021 Miltenyi Biotech 130103926
SB431542 Sigma S4317
Compound E Merck Millipore 565790
EGF Merck Millipore 324856
FGF2 R&D Systems 233FB025
Research Grade FBS Thermo Scientific SV30160.03 For astrocyte differentiation medium
Defined FBS Thermo Scientific SH30070.03 For primary neuron medium
PBS Thermo Scientific SH30028.02
Glucose Sigma G8270 For primary neuron medium
Sucrose Sigma S0389
Heparin EMD Millipore 375095
Papain Worthington 3126
HBSS Invitrogen 14175095
DNase I Roche 10104159001
Dispase II STEMCELL Technologies 7923
HEPES Gibco 15630080 For harvesting brains
EBSS Invitrogen 14155063
L-Cysteine Sigma C7352
Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056
70 µm cell strainer BD Biosciences   352350
20 µm filter unit Sartorius Stedim 16534K
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P5405
NaHCO3 Sigma S5761
NaH2PO4 Fluka 71505
MgCl2 Sigma M8266
CaCl2 Sigma C1016
D(+)-Glucose Sigma G7520 For electrophysiological studies
K-gluconate Sigma P1847
KOH KANTO Chemical 3234400
HEPES Sigma H3375 For electrophysiological studies
EGTA Sigma E3889
Na2ATP Sigma A7699
Na3GTP Sigma G8877
Borosilicate glass capillaries World precision instruments, Inc 1604323
15 ml centrifuge tube BD Biosciences  352096
50 ml centrifuge tube BD Biosciences 352070
24-well plates Corning 9761146
6-well plates Corning 720083
T25 flasks Corning 430641
12 mm cover glasses Marienfeld-Superior 111520
AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit  Lonza VPG1003 For electroporation of primary cortical neurons
Neon Transfection System  Invitrogen MPK5000 For electroporation of human fibroblasts
Mini Analysis  Synaptosoft Mini Analysis v.6 For measurement of PSCs
Normal Dermal Human Fibroblasts PromoCell C12300
pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE Addgene 20945
Mercury short-arc lamp OSRAM HBO 103 W/2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  3. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  4. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  5. Stroh, A., et al. Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation. Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).
  6. Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -C. Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).
  7. Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).
  8. Braun, H., Günther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).
  9. Shivaraj, M. C., et al. Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain. PLoS ONE. 7, e42935 (2012).
  10. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  11. Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).
  12. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).
  13. Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
  14. Marchetto, M. C. N., et al. A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  15. Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, 160 (2013).

Tags

Developmental Biology Neuroscience Channelrhodopsin-2 Co-kultur neuroner astrocytter inducerede pluripotente stamceller Neurale stamceller differentiering cellekultur Cortex
En optogenetic fremgangsmåde for vurdering af Dannelse af neuronal forbindelser i en co-kultur System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Su, C. T. E., Yoon, S. I., Marcy,More

Su, C. T. E., Yoon, S. I., Marcy, G., Chin, E. W. M., Augustine, G. J., Goh, E. L. K. An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System. J. Vis. Exp. (96), e52408, doi:10.3791/52408 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter