Introduction
In den letzten Jahren haben unser Verständnis des Neurons und der neuronalen Schaltungsfunktion durch mehrere optogenetische Werkzeuge, die neuronale Erregbarkeit steuern revolutioniert. Ein solches Instrument ist das Licht-aktivierten Kationen-Kanal, Channelrhodopsin-2 (ChR2): Neuronen, ChR2 Feuer Aktionspotentiale in Reaktion auf Lichtstimulation 1-3. Da Neuronen normalerweise nicht empfindlich auf Licht, öffnet sich diese bemerkenswerte Fähigkeit neue Wege für die genaue zeitliche und räumliche Steuerung der Aktivität von genetisch definierten Populationen von Neuronen 4 und hat sich stark beschleunigt Studien der Hirnfunktion. ChR2 wurde angewandt, um Zellforschung für verschiedene Zwecke ergeben, von der Überwachung der neuronalen Entwicklung 5 bis Regulierung Aktivität neuronaler Netzwerke 6.
Hier ChR2 verwendet wir, um die Nützlichkeit eines neuronalen Cokultursystem erhöhen. Co-Kultur-Systeme ermöglichen die Bewertung von Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen.Co-Kulturen von Neuronen und Gliazellen, die Hauptzelltypen des Nervensystems werden häufig verwendet, um zu untersuchen Signalisierung zwischen den verschiedenen Zelltypen, sowie die Bedeutung dieser Signalisierung für physiologische Reaktionen zu bewerten, die Ausbreitung des Schadens und die Studie molekularen Mechanismen, die möglicherweise in dieser Signal 7 beteiligt sind. Eine frühere Untersuchung zeigte, dass menschliche iPSCs unterscheiden sich sehr schnell in die Neuronen in Gegenwart von Rattenkortexprimärkultur enthält Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia 8.
In diesem Protokoll zeigen wir eine Methode, die ChR2 nutzt in einer Co-Kultursystem zur synaptischen Verbindungen zwischen Ratte kortikalen Neuronen und Neuronen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) abgeleitet verhören. Wir beschreiben Schritte zu zerlegen und zu ernten Hirngewebe 9 sowie zu pflegen und zu differenzieren Maus neurale Vorläuferzellen (NPCs) in Astrozyten und menschlichen NPCs into Neuronen, die Co-Kultursystem zu schaffen. Um diese Co-Kultursystem zu etablieren, haben wir die von Okita et al Integration freie Umprogrammierung Verfahren. 10 die menschliche iPS-Zellen zu erzeugen. Diese iPS-Zellen wurden dann effizient in NPCs in chemisch definierten Bedingungen differenziert mit niedermolekularen Inhibitoren wie von Li et al. 11
In den Co-Kulturen können die verschiedenen Populationen von Neuronen über Erkennung des ChR2 Expression in kortikale Neuronen und Markierung von iPSC abgeleiteten Neuronen über das fluoreszierende Protein, tandem-Dimer Tomate (tdTomato) identifiziert werden. Kombinieren elektrophysiologische Aufzeichnungen von iPSC abgeleiteten Neuronen mit optogenetische Photo der kortikalen Neuronen ermöglicht Einschätzung der Fähigkeit dieser zwei Arten von Neuronen zu einander bilden. Insbesondere Photo von ChR2-exprimierenden kortikalen Neuronen hervorrufen synaptischen Antworten in iPS-abgeleitete Neuronen, die synaptischen Schaltungen gebildet habenmit der photo kortikalen Neuronen-Netzwerk. Wir zeigen, dass erhöhte postsynaptische Ströme sind in der Tat in iPS-abgeleiteten Neuronen unter diesen Bedingungen erkannt werden. Dieses Protokoll ermöglicht die Beurteilung der synaptischen Schaltung unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen einschließlich Rekapitulation verschiedenen neurologischen Erkrankungsmodellen unter Verwendung iPSCs von Fibroblasten aus Patienten mit Morbus abgeleitet.
Protocol
HINWEIS: Alle Experimente werden durchgeführt, folgende Protokolle von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee Singhealth zugelassen.
1. Erntefrühpostnatale Mäuse Brains
- Vor der Präparation, bereiten Sie die Hippocampus-Gewebe Aufschlusslösung: 10 & mgr; Papain pro 1 ml 1x Earles Balanced Salt Solution (EBSS) (+ 1% HEPES) mit Deoxyribonuclease I (DNase I) (250 U / ml) und Dispase II (1 U / ml). Stellen Sie ca. 2,5 ml der Gewebeaufschlusslösung und filtern es mit einem 0,20 um-Filtereinheit. Warmhalten der Lösung bei 37 ° C bis zur Verwendung.
- Anesthetize die postnatalen Tag 5 (P5) Mäuse Welpen, indem sie in Eis für 5 min. Von Eis und Test entfernen Schmerzreflex über Zehe oder Schwanz kneifen. Sprühen Sie die Welpen mit 70% Ethanol. Enthaupten die Welpen und legen die Köpfe in einer Petrischale auf Eis.
- Einen Einschnitt in der Haut entlang der Mittellinie von der Basis des Schädels an der Nase, mit einem Paar von kleinen scissors oder feine Dissektionszangen. Reißen Sie die Haut und machen einen ähnlichen Schnitt durch den Schädel. Machen zwei zusätzliche horizontale Schnitte auf jeder Seite des Schädels eines rostral (am Bregma) und eine kaudale (am lambda).
- Reißen Sie den Schädel entlang der Ritzlinien, die zugrunde liegende Gehirn aus. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Schädel, die über den Riechkolben, und jede Mittellinie Knochen zwischen ihnen zu entfernen. Tun Sie dies, wenn Sie den Kopf mit einer Pinzette in der nicht-Sezieren Hand stabil halten.
- Erleichtern den flachen Teil einer Spachtel zwischen dem ventralen Teil des Gehirns und der Schädelbasis am Schwanzende. Halten Sie den Spachtel parallel zur Basis des Schädels unter dem Gehirn, bewegen Sie ihn in Richtung des rostralen Ende des Schädels, alle Verwachsungen zwischen dem Gehirn und der Basis des Schädels durchtrennen.
- Scoop das Gehirn mit dem Spachtel und legen Sie sie in eine Petrischale mit eiskaltem 1x EBSS (+ 1% HEPES). Zellgewebe zu jeder Zeit unter Wasser.
- Für alleMikrodissektion Schritte, Arbeit unter einem Binokular und verwenden Sie ein Paar feine Dissektionszangen in jeder Hand, eine zum Schneiden von Gewebe, und die andere zum Halten der Gewebe stabil.
- Machen Sie einen Schnitt nur posterior zur Großhirnrinde, um sie vom Hinterhirn zu trennen. Entlang der Mittellinie geschnitten, um die Hirnrinde in seine beiden Halbkugeln zu trennen. Entfernen Sie die Hirnhäute aus den Gehirnhälften.
- Legen Sie eine Hemisphäre medialen Seite nach oben und setzen Sie die Pinzette in den lateralen Ventrikel unterhalb des Hippocampus. Schneiden Sie den Mittelhirn.
- Stellen Schnitte an den oberen und unteren Enden des Hippocampus und in der Nähe des Gyrus / entorhinalen Kortex Kreuzung, um den Hippocampus von der Rinde zu isolieren. Sammeln Sie die hippocampi in eine Schale mit eiskaltem 1x EBSS (+ 1% HEPES).
2. Hippocampus Gewebedissoziation
- Übertragen Sie die hippocampi, um ein Gericht, das die vorgewärmten hippokampalen Gewebeaufschlusslösung. Mince ter Hippocampus-Gewebe so fein wie möglich und Inkubation für 30 min bei 37 ° C.
- Sanft dissoziieren Gewebe in einzelne Zellen durch mechanische Pipettieren und Übertragungszellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.
- Zentrifuge bei 200 xg für 5 min und Überstand.
- Resuspendieren Zellpellet in 20 ml 0,5X ausgeglichener Hank-Salzlösung (HBSS) Saccharose (0.9 M) und Zentrifuge enthält bei 200 × g für 10 min.
- Entfernen des Überstandes und Resuspension Zellpellet in 2 ml NPC Erhaltungsmedium (Tabelle 1), auf die Oberseite von 10 ml von 4% Rinderserumalbumin (BSA) in 1X EBSS-Lösung und Zentrifuge 5 min bei 200 xg platziert.
- Überstand entfernen und fügen Maus NPC Erhaltungsmedium (Tabelle 1) zum Zellpellet. Gently Pipette auf und ab 5-10 mal, um sicherzustellen, Zellpellet wird in Einzelzellen zerlegt.
- Übertragungsmedium enthaltenden Zellen in vorbeschichteten Matrigel Platten und fügen den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und fibroblast-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) (beide 20 ng / ml) in Heparin (5 mg / ml). Inkubation erfolgt bei 37 ° C und 5% CO 2.
3. Wartung von adhärenten Maus Hippocampus NPCs
- Bereiten Sie die beschichteten Platten / Kolben mindestens eine Stunde vor der Passage der Maus Hippocampus NPCs. Fügen Sie genug Matrigel, die Oberfläche jeder Platte oder Kolben abdecken und bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
- Entfernen Sie das Medium aus 90% konfluent Maus NPC Kulturen und sofort abwaschen mit 1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), dann absaugen PBS ab.
- Fügen Sie genug Zellablösung Lösung in jede Vertiefung / Flaschen bedecken und Inkubation für 5 min bei 37 ° C.
- Stellen Sie sicher, dass alle Zellen, indem du unter einem inversen Hellfeld-Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung abgelöst. Wenn es noch Zellen angebracht, Inkubation Kulturgefäß für eine weitere 1-2 min und prüfen Zellen wieder. Ist die doppelte Menge von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium / Ham-F-12 Nutrient Mixture (DMEM / F-12)wie die der Zellentfernungslösung in die Vertiefungen / Kolben einmal alle Zellen abgelöst.
- Übertragen DMEM / F-12 enthaltenden Zellen in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 200 × g für 5 min.
- Überstand entfernen und resuspendieren Zellpellet in 5 ml Maus NPC Erhaltungsmedium (Tabelle 1). Gently Pipette auf und ab, um in einzelne Zellen aufzubrechen Zellpellet.
- Platte ein Drittel der gesamten Zellen in neue Kulturschalen / Kolben und füllen Sie ausreichend Kulturmedium mit EGF und FGF2 ergänzt. Kulturgefäßen bei 37 ° C und 5% CO 2. Tanken Medium jeden zweiten Tag und geteilte Zellen 1: 3 alle 3 bis 4 Tage. Vermeiden Sie übermäßiges Wachstum von Maus NPC Kulturen, um die Aggregation und Ablösung zu verhindern.
4. Differenzierung von Maus-NPCs in Astrozyten
- Bereiten Poly-L-Lysin (PLL) / Laminin 12 mm Deckgläser mindestens einen Tag im Voraus vor Beginn der Differenzierung von Maus-NPCs in Astrozyten. Cov hinzufügenerslips in eine 24-Well-Platte und Deckel gesamten Oberflächenbereich der Vertiefungen mit genügend PLL (1 mg / ml in Boratpuffer).
- Inkubieren der Platte über Nacht bei 4 ° C. Am folgenden Tag, entfernen PLL und einmal mit 1x PBS waschen.
- Hinzufügen Laminin (1 mg / ml in eiskaltem DMEM / F-12), wiederum über die gesamte Oberfläche von jeder Vertiefung, dann Inkubieren für mindestens 4 Stunden bei 37 ° C.
- Entfernen Sie das Medium aus der Maus NPC Kulturen und sofort abwaschen mit 1x PBS dann absaugen PBS ab.
- Fügen Sie genug Zellablösung Lösung in jede Vertiefung / Flaschen bedecken und Inkubation für 5 min bei 37 ° C.
- Sicherzustellen, dass alle Zellen abgeplatzt ist die doppelte Menge an DMEM / F-12 als derjenigen der Zellentfernungslösung in die Vertiefungen / Kolben.
- Übertragen DMEM / F-12 enthaltenden Zellen in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 200 × g für 5 min.
- Überstand entfernen und Zellen in 5 ml Astrozyten Differenzierungsmedium (Tabelle 1). Gently Pipette Zell suspension nach oben und unten, um in einzelne Zellen aufzubrechen Zellpellet. Die Anzahl der einzelnen Zellen mit einer Zählkammer.
- Platten Zellen bei 5 × 10 4 Zellen / cm 2 in 500 ul Medium pro Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen. Inkubation erfolgt bei 37 ° C und 5% CO 2. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums mit frischem Medium jeden zweiten Tag. Maus NPCs schnell in Astrozyten in 2 Tagen zu unterscheiden und sind für eine Woche vor Beginn der weiteren Experimenten unterschieden.
5. Ernte embryonalen Rattenhirnen und Rindengewebe Dissoziation
- Entfernen Astrozyten Differenzierungsmedium (Tabelle 1) von Astrozytenkulturen und ersetzen mit primären Neuronen Medium (Tabelle 1) mindestens 4 Stunden vor Beginn der Ernte der embryonalen Rattenhirnen.
- Vor der Präparation, bereiten Sie die Rindengewebe Aufschlusslösung: 10 & mgr; mit 12,1 mg / ml L-Cystein Papain pro 1 ml 1x EBSS (+ 1% HEPES). Stellen Sie ungefähr 20,5 ml der Gewebeaufschlusslösung und filtern es mit einem 0,20 um-Filtereinheit. Warmhalten der Lösung bei 37 ° C bis zur Verwendung.
- Euthanize die schwangere Mutter von Erstickung mit Kohlendioxid mit Hilfe von Druckgas. Test für Schmerzreflex über Zehe oder Schwanz kneifen.
- Legen Sie das Tier Bauchseite nach oben auf ein absorbierendes Kissen und genießen ihren Bauchbereich mit 70% Ethanol. Klemmen Sie die Haut mit einer Pinzette und eine laterale Inzision mit einem Paar von chirurgische Scheren, breit genug, um den Bauch aus. Fassen Sie das Bauchfell mit der Pinzette und schneiden Sie die Bauchhöhle.
- Heben Sie das Uterushorn mit der Pinzette und schneiden Sie es kostenlos an der Mesometrium. Legen Sie die seziert Gebärmutter in einer Petrischale auf Eis. Trennen Sie die einzelnen Embryos, indem das Gebärmuttergewebe zwischen ihnen.
- Einen Einschnitt in der Fruchtblase. Schale vorsichtig den Fötus durch die Öffnung. Enthaupten den Fötus und legen den Kopf in einer Petrischale auf Eis.
- Um embryon erntenic Rattenhirnen, folgen Sie der Beschreibung der Schritte 1.3 bis 1.5.
- Um kortikalen Gewebe zu sezieren, legen Sie eine Gehirnhälfte lateralen Seite nach oben. Schneiden Sie die Halbkugel in zwei seitlich von der Mitte. Entsorgen der Hälfte näher an der Basis des Gehirns. Schneiden Sie das Gewebe herausgeschnitten, um das Mittelhirn zu entfernen.
- Übertragen Sie die kortikalen Gewebe, um ein Gericht, das die vorgewärmten Rindengewebe Aufschlusslösung. Blatt vor den kortikalen Gewebe so fein wie möglich und Inkubation für 30 min bei 37 ° C.
- Übertragen der kortikalen Gewebe aus der Gewebeverdauungslösung in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 10 ml vorgewärmten primären Neuron-Medium (Tabelle 1). Distanzieren die kortikale Gewebe durch wiederholtes Pipettieren sie nach oben und unten in einer serologischen Pipette, bis eine homogene Lösung ohne Gewebestücke erhalten wird.
- Übergeben Sie die Gewebe Lösung durch ein 70 um Zellsieb um verbleibende Gewebe Klumpen herausfiltern. Aliquot der Gewebelösung in 15 mlZentrifugenröhrchen, indem etwa 3 ml in jedes Röhrchen.
- Zugabe von 800 & mgr; l 7,5% BSA in 1 × PBS auf den Boden jeder Röhre, welche zwei Schichten mit dem Gewebe-Lösung auf die Oberseite und BSA an der Unterseite.
- Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. Entfernen des Überstandes, Ansaugen von der Schnittstelle der zwei Schichten. Vermeiden das Zellpellet am Boden des Röhrchens zu stören.
- Resuspendieren Zellpellets in 1 ml primäre Neuron-Medium (Tabelle 1), und sie in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Bestimmen Sie die Zelldichte mit einer Zählkammer.
6. Die Elektroporation und Oberflächen der Primär kortikalen Neuronen
HINWEIS: Gentransfer kann mit verschiedenen Verfahren, einschließlich Elektroporation, Calciumphosphat-Transfektion und viralen Transduktion erzielen. In diesem Protokoll beschreiben wir Elektroporation zu liefern ChR2 Konstrukts in primären kortikalen Neuronen.
- Zentrifuge 6 x 10 6 kortikale Neuronen der Ratte at 200 xg für 5 min und Überstand. Mindestens 6 x 10 6 kortikalen Neuronen für die Elektroporation benötigt, um die Bildung eines neuronalen Netzwerks von überlebenden Neuronen gewährleisten.
- 100 l Elektroporation Lösung Pellet resuspendieren Zell und sanft. Kombinieren Sie 100 ul der Zellsuspension mit 6 ug pLenti-Synapsin-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE 4 Plasmid und Transfer in einem zertifizierten Küvetten. Vermeiden Herstellung von Luftblasen während der Übertragung.
- Auswahl und Anwendung der entsprechenden Programm für die Elektroporation gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Nach der Elektroporation, fügen Sie 500 ul MEM zu Zell / DNA-Suspension in die Küvette. Übertragen Sie die Probe in 11,5 ml primären Neuron Medium (Tabelle 1) und resuspendieren sanft. Die Gesamtmenge der Medien für eine ganze Platte mit 24 Vertiefungen ausreichend. Aliquot 500 ul Medium zu jedem Well einer 24-Well-Platte. Inkubieren Platte bei 37 ° C und 5% CO 2. 7. Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen
- Kultur humaner Fibroblasten in DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) in 6-Well-Platten.
- Vor Beginn der Reprogrammierung von Fibroblasten, Mantel 6-Vertiefungen, die mit Matrigel und Inkubation für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur. Bei 80% Konfluenz, entfernen Medien aus Fibroblastenkulturen und einmal mit 1x PBS waschen.
- Füge hinreichend 0,25% Trypsin-EDTA, ganze Platte abdecken und bei 37 ° C für 10 min.
- Sobald Zellen wurden aus den Vertiefungen verdrängt, ist die doppelte Menge von DMEM mit 10% FBS wie die Trypsin Trypsinverdau quenchen. Gently Pipette Zellsuspension nach oben und unten zu brechen Zellen. Die Anzahl der einzelnen Zellen mit einer Zählkammer.
- Übertragungs 7 x 10 5 Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere die Zellsuspension bei 200 xg für 5Minute
- Überstand entfernen und Zellpellet resuspendieren in Elektroporation Lösung. Elektroporieren die Fibroblasten gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zellen in 100 ul Elektroporationspuffer und mit 1 ug jedes episomalen Vektor. Elektroporieren Zellen mit Einstellungen von 1.650 V, 10 ms und 3 Zeitimpulse.
- Transferzellsuspension in DMEM, ergänzt mit 10% FBS und die Platte 5 x 10 4 Zellen pro Well einer 6-Well-Platte. Inkubation erfolgt bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Nach 48 Stunden, entfernen Medien von transfizierten Fibroblastenkulturen und ersetzen mTeSR Medium. Ersetzen Kulturmedien täglich bis induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) Kolonien sind bereit, isoliert werden. Nach 28 bis 35 Tagen können iPSC Kolonien beobachtet werden.
- Wenn Sie bereit sind für die Isolierung, mechanisch geschnitten eine iPSC Kolonie und ein erneutes Seeding in mTeSR Medium mit 10 & mgr; Rho-associated protein kinase (ROCK) Inhibitor (Y-27632) auf eine Matrigel beschichtete Platte mit 6 Vertiefungen 12. Ersetzen Kulturmedium täglich.
- Wenn iPSC Kulturen sind etwa 20% Konfluenz entfernen mTeSR Medium und tauschen Sie mit neuronalen Induktionsmedium (Tabelle 1). Tanken an jedem zweiten Tag Medium.
- Nach 7 Tagen entfernen neuronalen Induktionsmedium und ersetzen menschliches NPC Erhaltungsmedium (Tabelle 1). Tanken Medium jeden zweiten Tag bis zu 7 Tage vor Passage Kulturen.
- Vor der Passage Kulturen, Mantel Platten / Kolben mit Matrigel bei Raumtemperatur für mindestens eine Stunde.
- Entfernen Sie das Medium von konfluenten menschlichen NPC Kulturen und einmal abwaschen mit 1x PBS dann absaugen PBS ab.
- Fügen Sie genug Zellablösung Lösung decken alle Vertiefungen dann Inkubation für 5 min bei 37 ° C.
- Stellen Sie sicher, dass alle Zellen abgelöst. Ist die doppelte Menge an DMEM /F-12 als derjenigen der Zellentfernungslösung in die Vertiefungen / Kolben.
- Übertragen DMEM / F-12 enthaltenden Zellen in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 200 × g für 5 min.
- Überstand entfernen und Zellen in 5 ml Human NPC Erhaltungsmedium (Tabelle 1). Gently Pipette Zellsuspension nach oben und unten zu brechen Zellen.
- Platte ein Drittel der gesamten Zellen in Matrigel beschichteten Kultur Wells / Kolben und füllen Sie ausreichend Medium mit 10 & mgr; Y-27632 ergänzt. Kulturgefäßen bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Split Kulturen 1: 3 alle 3 bis 4 Tage und füllt jeden zweiten Tag Medium. Pflegen menschlichen NPC Kulturen mit hoher Dichte, die Differenzierung zu verhindern.
- Fügen Sie den lentiviralen Vektor-Synapsin1 tdTomato die menschliche NPC Kultur vor der Einleitung der Differenzierung in Neuronen. Bereiten Astrozyten / kortikalen Neuronen Co-Kultureneinen Tag im Voraus vor der differenzierenden humanen NPCs.
- Menschen NPC Kulturen einmal abwaschen mit 1x PBS und fügen Sie genug Zellablösung Lösung in jede Vertiefung bedecken / Kolben dann Inkubation für 5 min bei 37 ° C.
- Stellen Sie sicher, dass alle Zellen abgelöst. Ist die doppelte Menge von DMEM / F-12 als derjenigen der Zellentfernungslösung in die Vertiefungen / Kolben. In einen 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min.
- Überstand entfernen und Zellen in 5 ml neuronalen Differenzierungsmedium (Tabelle 1). Gently Pipette Zellsuspension auf und ab, um in einzelne Zellen aufzubrechen Zellpellet. Die Anzahl der einzelnen Zellen mit einer Zählkammer.
- Sorgfältig absaugen Medium von Astrozyten / Kulturen von kortikalen Neuronen. Platte menschlichen Charaktere bei 5 x 10 3 Zellen / cm 2 in 500 ul neuronalen Differenzierungsmedium (Tabelle 1) mit 10 & mgr; M Y-27632 für jede 24-Well ergänzt. Medium mit menschlichen NPCs hinzufügen vorsichtig in jedes Wellum zu vermeiden, die Astrozyten und kortikalen Neuronen stören.
- Inkubation erfolgt bei 37 ° C und 5% CO 2. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums mit frischem Medium alle zwei bis drei Tage für mindestens 28 Tage.
- Überprüfen Sie, ob die menschliche iPS-Zellen verhalten sich wie reife Nervenzellen.
- Suche Zellen aus menschlichen iPS-Zellen durch Visualisierung tdTomato differenziert mit einem aufrechten konfokalen Mikroskop mit einem 60x (0,9 NA) Eintauchen in Wasser-Objektiv ausgestattet.
- Ziehen Aufzeichnungspipette auf einen Widerstand von 4 bis 6 M. perfundieren Zellen bei Raumtemperatur in einer externen Lösung (Tabelle 1) eingeblasen ständig mit 95% O 2/5% CO 2. Füllen Sie den Aufnahme-Mikropipette mit internen Lösung (Tabelle 1).
- Patch tdTomato + Zelle in Ganzzellmodus und Aufnahme neuronaler Aktivität als Reaktion auf Stromeinspeisung (1 sec Dauer, 10 pA-Schritten) in curmieten Klemme.
- Bestätigen Sie, ob Aktionspotential der kortikalen Zellen, ChR2 zuverlässig durch Lichtstimulation hervorgerufen.
- Suche kortikalen Zellen, ChR2 durch Visualisierung von GFP unter einem konfokalen Mikroskop. Führen Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung auf kortikalen Zellen durch folgende Schritte 10.1.2 bis 10.1.3.
- Aktion Überprüfen Potenzial zuverlässig durch Lichtbeleuchtung mit Quecksilberdampflampe (100 W) hervorgerufen. Die Wellenlänge der Anregungsfilter 480/40 nm.
- Führen optogenetische Stimulation.
- Patch tdTomato + Zelle in Ganzzell-Modus und stellen Spannungsklemme an -70mV. Filter Stromsignale bei 2 kHz und bei 10 kHz zu digitalisieren. Monitor-Serienwiderstände im Bereich von 10 bis 20 M auf Konsistenz während Aufnahmen.
- Stimulieren ganze Feld von 100 W-Quecksilberlampe mit 480/40 nm Anregungsfilter 30 Sek.
- Nehmen postsynaptischen Ströme (PSCs) der gepatchten Zelle durch Foto induzierter ChR2-exprimierenden präsynaptischen corschen Neuronen. Erkennen und messen PSCs. Stellen Schwelle für Amplitude und Ströme Bereich bei 5 pA und 20 pC auf. Manuell überprüfen diese Ereignisse, um alle nicht PSC Spuren zu verwerfen.
. HINWEIS: Diese Methode wurde von Okita et al angepasst 10
8. Neural Einleitung und Aufrechterhaltung von Menschen NPCs
. HINWEIS: Diese Methode wurde von Li et al 11
9. Differenzierung humaner NPCs in Neuronen in Co-Kulturen
10. Elektrophysiologische Aufnahmen von iPS-abgeleiteten Neuronen
Representative Results
Hier wird ein Protokoll der mehreren Schritte beim Erzeugen einer Co-Kultur, die aus Astrozyten beteiligt beschreiben, kortikale Neuronen und humanen Neuronen dargestellt. Menschen iPSCs wurden durch Neuprogrammierung Fibroblasten mit episomalen erhalten Vektoren 10 und spezifiziert in ein neuronales Linie mit einem Cocktail aus niedermolekularen Inhibitoren, so dass NPCs 11, die bei hoher Dichte (1A) gehalten wurden. Mehrere Schritte sind nötig, um die Co-Kultur zu generieren: Differenzierung von Maus-NPCs in Astrozyten, Beschichtung der Ratte kortikalen Neuronen, ChR2, und Aussaat der menschlichen NPCs mit tdTomato (1B) markiert. An Tag 2 der Differenzierung, können saure Gliafaserprotein (GFAP) + Astrozyten ohne weiteres in unseren Kulturen (1C) zu beachten. Maus NSC wurden für mindestens eine Woche vor dem Beschichten unterscheiden kortikalen Neuronen, ChR2 in die Astrozyten Monoschicht (1D). Nach 3bis 4 Wochen menschlicher NPC Differenzierung wurden tdTomato + -Neuronen in Kulturen (1E) detektiert.
Diese Co-Kultursystem ermöglicht die konsistente Erfassung der postsynaptischen Ströme von einzelnen iPSC abgeleiteten Neuronen in Reaktion auf Lichtstimulation (2A). Wenn sie durch Licht angeregt wurden Aktionspotentiale in kortikalen Neuronen, ChR2 (2B) erzeugt wird. iPSC abgeleiteten Neuronen auch erregbaren (2C), welche erhöhte neuronaler Aktivität als die Amplitude der depolarisierenden Stromimpulse erhöht wurde (2D). Damit diese Zellen reife neuronale Eigenschaften. In der Abwesenheit von Licht, empfangen iPSC abgeleiteten Neurone spontan synaptischen Eingaben (2E). Diese inneren postsynaptischen Ströme wurden überwiegend von AMPA-Rezeptoren vermittelt, da Ströme durch GABA-Rezeptoren würde nach außen und NMDA-Rezeptoren tragen keine aktuellen eint die Haltepotential von -70 mV. Mindestens einige dieser Eingänge den von präsynaptische kortikale Neuronen, ChR2, weil Lichtstimulation der Frequenz des postsynaptischen Ströme (2E) stark erhöht. Der Zeitverlauf der Erhöhung der synaptischen Eingang in 2F dargestellt: Photo der kortikalen Neuronen wurde während des 30 s langen Lichtblitz aufrechterhalten. Während die Frequenz der PSCs wurde erhöht, wenn ChR2-exprimierende Neurone wurden photostimulierte (Figur 2G), war ihre Amplitude unbeeinflusst (Figur 2H). Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die iPS-abgeleiteten Neuronen zeigte reife neuronale Eigenschaften und könnte synaptischen Verbindungen mit präsynaptischen Neurone zu bilden.
Abbildung 1: Schematische Darstellung zur Erzeugung KokulturSystem. (A) Timeline zur Umprogrammierung menschlichen Fibroblasten in iPS-Zellen und neurale Induktion an NPCs. (B) Zeitleiste für die terminale Differenzierung der menschlichen NPCs zu reifen Neuronen auf kortikalen Neuronen und Astrozyten-Kulturen. (C) Maus NPCs schnell in GFAP unterscheiden + Astrozyten nach 2 Tagen in vitro. (D) nach einer Woche kortikalen Neuronen, ChR2 wurden auf GFAP + Astrozyten bei 4 bis 5 Wochen nach der Differenzierung menschlicher NSC plattiert. (E), wurden elektrophysiologische Aufzeichnungen auf tdTomato + Neuronen durchgeführt. Maßstabsbalken entspricht 100 & mgr; m.
Abbildung 2: optogenetische Analyse der funktionalen synaptischer Verbindungen. (A) iPS-abgeleiteten Zellen mit tdTomato (rot) markiert waren mit kortikalen Neuronen, co-kultiviert das lichtaktivierteKanal, ChR2 (grün). Aufnahmen aus iPS-abgeleiteten Neuronen zeigte postsynaptischen Strom (PSC) Antworten, die entweder von den kortikalen Neuronen oder andere iPSC abgeleiteten Neuronen kommen könnte. (B) Beleuchtung (blauer Balken) rief eine Reihe von Aktionspotentialen in kortikalen Neuronen, ChR2. ( C) iPS-abgeleiteten Zellen sind durch Strominjektion hervorgerufen. (D) Brenn vs Stromkurve von iPS-Zellen abgeleitet. (E) Photostimulation der ChR2-exprimierenden kortikalen Neuronen (blauer Balken) erhöht die Frequenz der PSCs in iPS-abgeleiteten Neuronen . (F) den zeitlichen Verlauf der Zunahme der PSC Frequenz durch Ausleuchtung erzeugt. Blaue Balken zeigt die Zeit der Photostimulation. (G, H) Während PSC Frequenz wurde durch Photo (G) erhöht wird, PSC Amplitude unverändert war (H). * Zeigt Ihnen, p <0,05 im Vergleich zu mit Student-t-Test zu kontrollieren.
Discussion
Optogenetik stellt zeitliche und räumliche Präzision für die Aktivierung von definierten Populationen von Neuronen 13. In unseren Experimenten wurde der gesamte Bereich des Mikroskopobjektivs 30 Sek Photo stimulieren nur kortikalen Neuronen, ChR2 beleuchtet. Dies erlaubte uns, zu bestimmen, ob die synaptische Verbindungen wurden zwischen den verschiedenen Populationen von Neuronen in der Co-Kultur gebildet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Photo erhöht PSC Frequenz in iPS-abgeleitete Neuronen, was zeigt, dass diese Neuronen erhalten synaptischen Input von präsynaptischen Neurone Ausdruck ChR2. Dies wiederum festgestellt, dass die iPSC abgeleiteten Neuronen erfolgreich in Schaltungen mit den kortikalen Neuronen aufgenommen.
Es gibt mehrere wichtige Schritte zur Erzeugung des Co-Kultursystem. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Maus NPC abgeleiteten Astrocytenkulturen gesund sind, mit minimalem Zelltod, bevor mit Überzug ausgehendvon anderen Zelltypen. Kortikalen Neuronen und menschlichen NPCs und befestigen auf gesunde Astrozyten und elektrophysiologischen Ableitungen hängen stark von den Kulturbedingungen. Die andere wichtige Schritte in diesem Protokoll sind die Elektroporation und Plattieren von kortikalen Neuronen auf Astrozytenkulturen. Da eine große Anzahl von Zellen nach der Elektroporation sterben, ist es wichtig, sicherzustellen, dass zumindest 6 Millionen kortikalen Neuronen zum Ausplattieren auf Astrocytenkulturen in Platten mit 24 Vertiefungen elektroporiert. Wir haben beobachtet, dass, wenn weniger als 6 Millionen Zellen wurden elektroporiert, die Anzahl der Neuronen, die überlebt haben, nicht einen dichten neuronalen Netzwerk, das elektrophysiologische Aufzeichnungen betroffen bilden. Die Anzahl der durch Elektroporation kortikalen Neuronen sollte auch konsequent sein für jeden Co-Kultur-Experiment Vergleich zwischen unterschiedlichen Studien zu ermöglichen. Für alle Schritte, welche die enzymatische Verdauung, ist es wesentlich, die nicht an Zellen in Verdauungslösung zu lange, weil es zum Zelltod führen lassen.
DieseAnsatz kann verwendet werden, um die Fähigkeit von Neuronen aus patientenspezifischen Fibroblasten synaptische Kontakte mit anderen Neuronen bilden screenen. Neuronen aus Fibroblasten von Patienten mit der Erkrankung des Nervensystems Rett-Syndrom (RTT) abgeleitet aufweisen synaptischen Übertragung Defekte: RTT Neuronen zeigen eine signifikante Abnahme der PSC Frequenz und Amplitude im Vergleich zu gesunden Neuronen, was vermutlich auf weniger synaptischer Verbindungen 14. Unsere Co-Kultursystem erlaubt die Untersuchung der Wirkung von Medikamenten auf Neuronen anzeigt Entwicklungsdefekte. Dies kann durch Zugabe von Verbindungen von Interesse bei der Aussaat von erkrankten menschlichen NSC sowie bei kontinuierlicher Exposition zu Verbindungen der ganzen Zeit der neuronalen Differenzierung durchgeführt werden.
Während diese Co-Kultursystem kann auch als Modell für Drogentests verwendet werden, ist eine Einschränkung bei diesem Ansatz, dass der Prozess der Untersuchung der Auswirkungen der einzelnen Kandidatenverbindung kann lang und mühsam sein, wiees ist nicht ein Hochdurchsatz-Screening-Verfahren. Nach der Behandlung mit Wirkstoffkandidaten haben iPSC abgeleiteten Neuronen einzeln gepatcht werden, um die Auswirkungen der einzelnen Verbindungen auf PSCs zu bestimmen. Darüber hinaus gibt es noch nicht viele vorhanden Fibroblasten und iPS-Zellen von Patienten. Daher wird es von Interesse, in der nahen Zukunft sein, mehr Patientenzellen und auch auf dieses Protokoll für Hochdurchsatz-Screening angepasst werden. Zum Beispiel durch Markierung iPSC abgeleiteten Neuronen mit einem Indikator, wie beispielsweise genetisch codierten Sensoren von Ionen oder des Membranpotentials, wäre es möglich, die Durchlaufgeschwindigkeit im Wesentlichen durch Seitenschritt die zeitraubelektrophysiologische Prozedur zu erhöhen. Da der gesamte Vorgang der Erzeugung dieses Co-Kultursystem, von Umprogrammierung Fibroblasten zur Durchführung elektrophysiologischen Ableitungen, benötigt mehr als 90 Tage, ist es empfehlenswert, entweder die menschlichen iPSCs oder NSC erweitert werden, nach der Umprogrammierung und neurale Induktion Schritte jeweilsund kryokonserviert, um die Zeit für zukünftige Experimente nötig zu verringern.
In unseren Experimenten haben wir ausgedrückt ChR2 in kortikalen Neuronen unter synapsin1 Promotors. Da dieser Promotor pan-neuronalen wir vermutlich wurden beide hemmenden und erregenden kortikalen Neuronen photostimulating. Wenn das Ziel der zukünftigen Experimenten ist, spezifisch abzufragen entweder inhibitorisch oder exzitatorischer Schaltungen könnten spezifischeren Promotoren verwendet werden. Alternativ könnte kortikalen Neuronen aus transgenen (oder Virus-injizierten Mäusen) wobei ChR2 Expression spezifisch genetisch definierte Subpopulationen von Neuronen gezielt erhalten werden. Zum Beispiel, Ernte kortikalen Gewebe von einer Maus, die Cre-Rekombinase hat ausgedrückt in Parvalbumin haltige Inter (PV Inter), die mit einer Maus mit floxed ChR2 gekreuzt ist eine Situation, in der nur kortikalen Neuronen, ChR2 wird PV Inter 15 werden erhalten. Die Verwendung solcher ChR2-exprimierenden Inter in unserer gleichzeitig culture System ermöglichen die Bestimmung, ob ein patched iPSC abgeleiteten Neuron ist in der Lage, in einen Stromkreis mit PV Inter integrieren.
Basierend auf einer früheren Studie 9, sind kortikalen Neuronen reifen mit überlappenden Dendriten nach 14 Tagen in vitro. Wenn also die Photo keine Antwort von einem patched iPSC abgeleiteten Neuron hervorrufen sollte darauf hinweisen, dass das Neuron nicht die Fähigkeit, synaptische Verbindungen mit kortikalen Neuronen zu machen. Ein iPSC abgeleiteten Neuron kann synaptischen Eingang entweder von anderen iPSC abgeleiteten Neuronen oder kortikalen Neuronen empfangen. Wenn traditionelle Patch-Clamp-Messungen verwendet wurden, wäre es nicht möglich, zu unterscheiden, wo das synaptische Eingabe kommt. Der Vorteil unseres Systems ist die postsynaptische Reaktionen aus kortikalem präsynaptischen Eingang selektiv evozierten und identifiziert werden. Die hier beschriebenen Verfahren bieten einen einfachen Einstieg in die Fähigkeit der iPS-abgeleiteten Neuronen bewerten zu integrierenin einen definierten neuronalen Netzwerks.
Acknowledgments
Wir danken K. Deisseroth und S. Je nach den ChR2 und Synapsin1-tdTomato lentiviralen Konstrukte bzw. C. Chai für den Austausch von Know-how und das Protokoll auf iPSC Generation, WY Leong für die technische Unterstützung, die Mitglieder der Goh-Labor für den Austausch von Reagenzien und Know-how. Diese Arbeit wurde von Abbott Nutrition and Academic Centre of Excellence (ACE) Forschungspreis von Glaxosmithkline (GSK) zu ELG im Rahmen ihrer wettbewerbsfähiges Forschungsprogramm (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) zu ELG, die von der National Research Foundation Singapur und GJA und von der Weltklasse Institute (WCI) Programm der National Research Foundation of Korea (NRF), die vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie Korea (MEST) gefördert (NRF Förderkennzeichen: WCI 2009-003) zu GJA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurocult Proliferation Kit (Mouse) | STEMCELL Technologies | 5702 | Contains NSC Basal Medium and NSC Proliferation Supplement |
| Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | |
| DMEM/F12 | Lonza | 12719F | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| MEM without glutamine | Invitrogen | 11090081 | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| GlutaMAX supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140122 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Human LIF | Invitrogen | PHC9484 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotech | 130103926 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | |
| Compound E | Merck Millipore | 565790 | |
| EGF | Merck Millipore | 324856 | |
| FGF2 | R&D Systems | 233FB025 | |
| Research Grade FBS | Thermo Scientific | SV30160.03 | For astrocyte differentiation medium |
| Defined FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | For primary neuron medium |
| PBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | For primary neuron medium |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Heparin | EMD Millipore | 375095 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175095 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dispase II | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | For harvesting brains |
| EBSS | Invitrogen | 14155063 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 70 µm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 20 µm filter unit | Sartorius Stedim | 16534K | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4 | Fluka | 71505 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| D(+)-Glucose | Sigma | G7520 | For electrophysiological studies |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| KOH | KANTO Chemical | 3234400 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | For electrophysiological studies |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma | A7699 | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| Borosilicate glass capillaries | World precision instruments, Inc | 1604323 | |
| 15 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352070 | |
| 24-well plates | Corning | 9761146 | |
| 6-well plates | Corning | 720083 | |
| T25 flasks | Corning | 430641 | |
| 12 mm cover glasses | Marienfeld-Superior | 111520 | |
| AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit | Lonza | VPG1003 | For electroporation of primary cortical neurons |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | For electroporation of human fibroblasts |
| Mini Analysis | Synaptosoft | Mini Analysis v.6 | For measurement of PSCs |
| Normal Dermal Human Fibroblasts | PromoCell | C12300 | |
| pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE | Addgene | 20945 | |
| Mercury short-arc lamp | OSRAM | HBO 103 W/2 |
References
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