Introduction
בשנים האחרונות, ההבנה של נוירון ותפקוד מעגל העצבי שלנו כבר מהפכה ידי מספר כלים optogenetic השולטים רגישות עצבית. כלי אחד כזה הוא ערוץ קטיון מופעל אור, channelrhodopsin-2 (ChR2): תאי עצב המבטאים פוטנציאל פעולת אש ChR2 בתגובה לגירוי אור 1-3. מכיוון שתאי עצב אינם בדרך כלל רגישים לאור, יכולת המופלאה זה פותחת אפיקים חדשים לשליטה של זמן ומרחב המדויק של הפעילות של אוכלוסיות גנטית מוגדרות של נוירונים 4 והואצה מחקרים של תפקוד המוח מאוד. ChR2 הוחל על תא גזע מחקר למטרות שונות, ממעקב אחר ההתפתחות עצבית 5 להסדרת פעילות של רשתות עצביות 6.
כאן השתמשנו ChR2 להגדיל את התועלת של מערכת שיתוף תרבות עצבית. מערכות שיתוף התרבות לאפשר ההערכה של יחסי גומלין בין תאים מסוגים שונים.שיתוף תרבויות של תאי עצב וגליה, סוגי התאים העיקריים של מערכת העצבים, משמשים בדרך כלל כדי לחקור איתות בין סוגי התאים השונים הללו, כמו גם כדי להעריך את המשמעות של זה איתות לתגובות פיסיולוגיות, התפשטות של נזק ולבחון את מנגנונים מולקולריים הפוטנציאליים מעורבים בזה איתות 7. מחקר קודם גילה כי iPSCs האנושי להבחין מהר מאוד לתאי עצב בנוכחות של תאי עצב בקליפת המוח חולדה עיקרי תרבות המכילה, האסטרוציטים, oligodendrocytes, ומיקרוגליה 8.
בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים שיטה שמנצלת ChR2 במערכת שיתוף תרבות לחקור את קשרים סינפטיים בין תאי עצב בקליפת המוח חולדה ותאי עצב שמקורם בתאים אנושיים הנגרם pluripotent גזע (iPSCs). אנו מתארים את שלבים לנתח ורקמות מוח קציר 9, כמו גם לשמור ולבדל את תאים עצביים עכבר (NPCs) להאסטרוציטים וNPCs אדם intנוירונים o ליצור מערכת שיתוף התרבות. להקים מערכת שיתוף תרבות זו, השתמשנו בשיטת תכנות מחדש ללא אינטגרציה שתוארה על ידי אל Okita et. 10 כדי ליצור iPSCs האנושי. iPSCs אלה אז נבדל ביעילות לתוך NPCs בתנאים כימי מוגדרים באמצעות מעכבי מולקולה קטנה כפי שתוארה על ידי et al לי. 11
בשיתוף התרבויות, אוכלוסיות השונות של תאי עצב יכולות להיות מזוהות באמצעות זיהוי של ביטוי ChR2 בנוירונים בקליפת המוח ותיוג של נוירונים נגזרים iPSC באמצעות חלבון הניאון, בד בבד דימר העגבניות (tdTomato). שילוב קלטות אלקטרו מהנוירונים נגזרים iPSC עם photostimulation optogenetic של נוירונים בקליפת המוח מאפשר הערכה של היכולת של שני סוגים של תאי עצב כדי ליצור מעגלים אחד עם השני. באופן ספציפי, photostimulation של ChR2 להביע תאי עצב בקליפת המוח לעורר תגובות הסינפטי בנוירונים נגזרים iPSC שיצרו מעגלים הסינפטיעם רשת נוירון בקליפת המוח photostimulated. אנו מראים כי זרמי postsynaptic מוגברים אכן זוהו בתאי עצב שמקורם בiPSC בתנאים כאלה. פרוטוקול זה מאפשר ההערכה של מעגלים הסינפטי תחת מגוון רחב של תנאי ניסוי, כוללים סיכום של דגמי מחלה נוירולוגית שונים באמצעות iPSCs נגזר מfibroblasts מחולי מחלה.
Protocol
הערה: כל הניסויים מבוצעים הבאים פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש בSingHealth.
1. מוח הקציר מוקדם אחרי הלידה עכבר
- לפני הנתיחה, להכין את פתרון עיכול הרקמה בהיפוקמפוס: פפאין 10 μl למאוזן תמיסת מלח של 1 מיליליטר 1x ארל (EBSS) (1% HEPES +) עם Deoxyribonuclease אני (DNase I) (250 U / ml) וDispase II (U 1 / מיליליטר). הפוך כ 2.5 מיליליטר של פתרון עיכול רקמה ולסנן אותו באמצעות יחידת 0.20 מיקרומטר סינון. שמור חם פתרון על 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- להרדים את גורי עכברי יום 5 (P5) לאחר לידה על ידי לשים אותם בקרח במשך 5 דקות. מוציאים מקרח והמבחן לרפלקס כאב באמצעות הבוהן או קמצוץ זנב. לרסס את הגורים עם 70% אתנול. לערוף את הגורים ולמקם את הראשים בצלחת פטרי על קרח.
- עושה חתך בעור לאורך קו האמצע, מבסיס הגולגולת לאף, עם זוג scisso הקטןrs או מלקחיים לנתח בסדר. פיל לפתוח את העור ולעשות חתך דומה דרך הגולגולת. שני חתכים אופקיים נוספים בכל צד של הגולגולת, מקורי אחד (בגבחת) וזנב אחד (למבדה).
- פיל לפתוח את הגולגולת לאורך הקווים חרותים לחשוף את המוח הבסיסי. השתמש זוג מלקחיים כדי להסיר את הגולגולת מעל נורות חוש הריח, וכל עצם קו האמצע ביניהם. לעשות את זה בזמן שמחזיק את הראש יציב עם זוג מלקחיים שבאינם לנתח יד.
- להקל על החלק השטוח של מרית בין החלק הגחוני של המוח ובסיס הגולגולת בסוף הזנב. שמירה המקבילה מרית לבסיס הגולגולת מתחת למוח, להעביר אותה לקראת הסוף מקורי של הגולגולת לנתק את כל הידבקויות בין המוח ובסיס הגולגולת.
- סקופ המוח עם המרית ומניח אותו בצלחת פטרי המכילה קר כקרח 1x EBSS (+ 1% HEPES). שמור רקמות שקועות בכל העת.
- לכלצעדי מיקרו לנתיחה, עבודה תחת מיקרוסקופ לנתח ולהשתמש בזוג מלקחיים לנתח משובחים בכל יד, אחד לחיתוך רקמות, והשני להחזקת הרקמות יציבים.
- לעשות חתך רק אחורי לקליפת המוח להפריד אותו מהמוח האחורי. לחתוך לאורך קו האמצע כדי להפריד את קליפת המוח לשתי האונות שלו. הסר את קרומי המוח מאונות המוח.
- הנח בצד המדיאלי עד חצי הכדור ולהכניס את המלקחיים לתוך החדר לרוחב מתחת להיפוקמפוס. לחתוך את המוח התיכון.
- לבצע חתכים בקצוות העליונים ונחותים של ההיפוקמפוס, וליד משוננת / צומת קליפת entorhinal לבודד את ההיפוקמפוס מהקליפה. לאסוף את hippocampi בצלחת המכילה קר כקרח 1x EBSS (+ 1% HEPES).
2. דיסוציאציה רקמות בהיפוקמפוס
- העבר את hippocampi לצלחת המכילה את פתרון עיכול הרקמה בהיפוקמפוס המחומם מראש. הבשר הטחון tהוא היפוקמפוס רקמות לקנס ככל האפשר ודגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- בעדינות לנתק רקמות לתוך תאים בודדים על ידי תאי pipetting והעברה מכאניים לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר.
- צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
- גלולה תא הגלולה ב 20 מיליליטר 0.5x מאוזן תמיסת מלח של האנק (HBSS) המכילה סוכרוז (0.9 מ ') וצנטריפוגות ב XG 200 עבור 10 דקות.
- הסר את התא גלולה supernatant ו resuspend ב 2 מיליליטר של מדיום תחזוקת NPC (טבלת 1), ממוקם על גבי 10 מיליליטר של 4% בסרום אלבומין שור (BSA) בפתרון 1X EBSS ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות.
- הסר supernatant ולהוסיף בינוני NPC עכבר תחזוקה (טבלת 1) לתא גלולה. פיפטה בעדינות מעלה ומטה 5-10 פעמים כדי להבטיח תא גלולה מחולקת לתאים בודדים.
- העבר את התאים המכילים בינוניים לתוך צלחות Matrigel מצופים מראש ולהוסיף גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) וfibroblaגורם st צמיחה 2 (FGF2) (שניהם 20 ng / ml) בהפרין (5 מ"ג / מיליליטר). דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
3. תחזוקה של חסיד העכבר בהיפוקמפוס NPCs
- הכן את צלחות / צלוחיות מצופים לפחות שעה לפני NPCs בהיפוקמפוס עכבר passaging. הוסף מספיק Matrigel כדי לכסות את שטח הפנים של כל צלחת או בקבוק ודגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
- הסר את המדיה מתרבויות NPC עכבר ומחוברות 90% ולשטוף פעם עם 1x בופר פוספט (PBS) ולאחר מכן לשאוב PBS את.
- הוסף פתרון ניתוק תא מספיק כדי לכסות את כל הבארות / צלוחיות ודגירה של 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- ודא שכל התאים יש מנותקים ע"י הסתכלות תחת מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך בהגדלה 10x. אם יש עדיין תאים מצורפים, דגירה כלי תרבות ל1-2 דקות נוספות ולבדוק תאים שוב. להוסיף כמות כפולה של F-12 התערובת השתנה Dulbecco נשר בינוני / חם של מזון (DMEM / F-12)כמו זה של פתרון ניתוק תא לבארות / צלוחיות פעם שכל התאים מנותקים.
- העבר את DMEM / F-12 תאים המכילים לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות.
- הסר supernatant ו resuspend תא גלולה ב 5 מיליליטר של מדיום תחזוקת NPC העכבר (טבלה 1). פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לשבור את התא גלולה לתוך תאים בודדים.
- צלחת שלישית של תאים כולל לתוך בארות / צלוחיות חדשות תרבות והעליונה עד בינוני תרבות מספיקה בתוספת EGF וFGF2. דגירה כלי תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לחדש בינוני כל תאים שני יום ופיצול 1: 3 בכל 3 עד 4 ימים. הימנע יתר של תרבויות NPC העכבר כדי למנוע צבירה וניתוק.
4. התמיינות של העכבר NPCs לתוך האסטרוציטים
- הכן poly-L-ליזין (PLL) / משקפיים כיסוי 12 מ"מ laminin מצופה לפחות יום מראש לפני ביצוע בידול של NPCs עכבר להאסטרוציטים. להוסיף coverslips לתוך צלחת 24 גם ולכסות את כל שטח הפנים של בארות עם מספיק PLL (1 מ"ג / מיליליטר במאגר borate).
- דגירה את צלחת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. למחרת, להסיר PLL ולשטוף פעם עם 1x PBS.
- להוסיף laminin (1 מ"ג / מיליליטר בקרח DMEM הקר / F-12), שוב מכסה את כל פני השטח של כל טוב, אז דגירה של לפחות 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
- הסר את המדיה מתרבויות NPC עכבר ולשטוף פעם עם 1x PBS אז לשאוב PBS את.
- הוסף פתרון ניתוק תא מספיק כדי לכסות את כל הבארות / צלוחיות ודגירה של 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- ודא שכל התאים יש מנותקים ולאחר מכן להוסיף כמות כפולה של DMEM / F-12 כמו זה של פתרון ניתוק תא לבארות / צלוחיות.
- העבר את DMEM / F-12 תאים המכילים לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות.
- הסרת תאי supernatant ו resuspend ב 5 מיליליטר בינוני astrocyte בידול (טבלת 1). בעדינות suspensio תא פיפטהn למעלה ולמטה כדי לשבור את התא גלולה לתוך תאים בודדים. לספור את מספר התאים בודדים עם hemocytometer.
- תאי צלחת ב 5 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר ב500 μl של מדיום לכל גם צלחת 24 גם. דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. להחליף מחצית הבינונית עם בינוני טרי בכל יום שני. עכבר NPCs להבחין במהירות לתוך האסטרוציטים בתוך 2 ימים והם מובחנים במשך שבוע לפני תחילת ניסויים נוספים.
5. מוח הקציר עוברי חולדה ודיסוציאציה רקמת קליפת המוח
- הסר בינוני בידול astrocyte (טבלת 1) מתרבויות astrocyte ולהחליף עם מדיום עיקרי נוירון (טבלת 1) לפחות 4 שעות לפני תחילת קציר של מוח חולדה העוברי.
- לפני הנתיחה, להכין את פתרון עיכול רקמת קליפת המוח: 10 μl פפאין לכל 1 מיליליטר 1x EBSS (+ 1% HEPES) עם 12.1 מ"ג / L-ציסטאין מיליליטר. הפוך כ 2.5 מיליליטר של פתרון עיכול רקמה ולסנן אותו באמצעות יחידת 0.20 מיקרומטר סינון. שמור חם פתרון על 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- להרדים את הסכר בהריון בחנק פחמן דו חמצני באמצעות גז דחוס. מבחן לרפלקס כאב באמצעות הבוהן או קמצוץ זנב.
- הנח את הצד הגחוני של בעלי החיים על משטח סופג ולספוג אזור הבטן שלה עם 70% אתנול. לצבוט את העור עם זוג המלקחיים ולעשות חתך לרוחב עם זוג המספריים כירורגיות, רחב מספיק כדי לחשוף את הבטן. לתפוס את הצפק עם המלקחיים ולחתוך לפתוח את חלל הבטן.
- להרים את קרן הרחם עם המלקחיים ולחתוך אותו חופשי לאורך mesometrium. מניחים את הרחם גזור בצלחת פטרי על קרח. להפריד כל עובר על ידי חיתוך רקמת הרחם ביניהם.
- עושה חתך בשק העוברי. בעדינות להפגיז את העובר החוצה דרך הפתח. לערוף את העובר ומניח את הראש בצלחת פטרי על קרח.
- למסוק embryonמוח החולדה ic, בצע את התיאור מצעדים 1.3-1.5.
- לנתח רקמות קליפת המוח, למקם הצד עד לרוחב חצי הכדור במוח. חותך את חצי הכדור בשני רוחבי מהאמצע. מחק את המחצית קרובה יותר לבסיס המוח. חתוך את הרקמה שהוסרה כדי להסיר את המוח התיכון.
- העבר את רקמות קליפת המוח למנה המכילה את פתרון עיכול רקמת קליפת המוח המחומם מראש. לרכך את רקמות קליפת המוח לקנס ככל האפשר ודגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- העבר את רקמות קליפת המוח מפתרון עיכול רקמה לצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר בינוני מחוממת מראש העיקרית נוירון (טבלת 1). לנתק את רקמות קליפת המוח על ידי pipetting אותם שוב ושוב ושוב בפיפטה סרולוגיות, עד לפתרון הומוגני ללא חתיכות רקמה מתקבל.
- להעביר את פתרון רקמת דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לסנן גושי רקמה הנותרות. Aliquot פתרון הרקמה לתוך 15 מיליליטרצינורות צנטריפוגה, הוסיפו כ 3 מיליליטר בצינור אחד.
- להוסיף BSA 800 μl 7.5% ב 1x PBS לתחתית צינור אחד, ויוצר שתי שכבות עם פתרון הרקמה על גבי וBSA בתחתית.
- צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות. הסר את supernatant, aspirating מהממשק של שתי שכבות. הימנע מלהפריע לתא גלולה בחלק התחתון של הצינור.
- Resuspend כל תא גלולה ב 1 מיליליטר המדיום עיקרי נוירון (טבלת 1) ולשלב אותם בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. לקבוע את צפיפות התאים באמצעות hemocytometer.
6. Electroporation והציפוי של נוירונים קליפתיים ראשיים
הערה: העברת גנים יכולה להיות מושגת באמצעות מספר שיטות, כוללים electroporation, transfection סידן פוספט ותמרה ויראלית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים electroporation לספק ChR2 לבנות לתוך תאי עצב בקליפת המוח עיקרי.
- צנטריפוגה 6 x 10 נוירונים בקליפת המוח חולדה 6t XG 200 במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. לפחות 6 x 10 6 תאי עצב בקליפת המוח נדרשים לelectroporation כדי להבטיח את הקמתה של רשת עצבית ששרדו תאי עצב.
- הוספה של פתרון electroporation 100 μl לתא גלולה ו resuspend בעדינות. שלב של ההשעיה התא 100 μl עם 6 מיקרוגרם של pLenti-synapsin-hChR2 (H134R) -EYFP-wpre 4 פלסמיד ולהעביר לתוך קובט מוסמך. הימנע לייצר בועות אוויר בעת ההעברה.
- לבחור וליישם תכנית מתאימה לelectroporation על פי הוראות יצרן.
- לאחר electroporation, להוסיף 500 μl של MEM להשעיה התא / DNA לקובט. להעביר את המדגם ל11.5 מיליליטר המדיום עיקרי נוירון (טבלת 1) וresuspend בעדינות. הסכום הכולל של תקשורת הוא מספיק לצלחת 24 גם כולו. Aliquot 500 μl של מדיום לכל גם צלחת 24 גם. דגירה צלחת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. 7. דור של גזע תאים המושרה pluripotent
- fibroblasts אדם התרבות בDMEM בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ב6-גם צלחות.
- לפני תחילת תכנות מחדש של fibroblasts, מעיל 6-בארות עם Matrigel דגירה במשך שעה לפחות בטמפרטורת חדר. ב 80% מפגש, להסיר תקשורת מתרבויות פיברובלסטים ולשטוף פעם עם 1x PBS.
- להוסיף 0.25% טריפסין-EDTA מספיק כדי לכסות את כל הצלחת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- לאחר תאים וחילצה מבארות, להוסיף כמות כפולה של DMEM עם 10% FBS כמו זה של טריפסין כדי להרוות את עיכול טריפסין. בעדינות השעיה את תא פיפטה ולמטה כדי לשבור את התאים. לספור את מספר התאים בודדים עם hemocytometer.
- העברת 7 x 10 5 תאים לתוך צינור 15 מיליליטר צנטריפוגות ו צנטריפוגות ההשעיה תא XG 200 עבור 5דקות.
- הסר supernatant ו resuspend תא גלולה בפתרון electroporation. Electroporate fibroblasts על פי הוראות יצרן. Resuspend תאים במאגר של electroporation 100 μl ולהוסיף 1 מיקרוגרם של כל וקטור episomal. תאי electroporate עם הגדרות של 1,650 V, 10 ms ו -3 פעימות זמן.
- השעיה תא העברה לDMEM בתוספת 10% FBS וצלחת 5 x 10 4 תאים לכל טוב של 6-גם צלחת. דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לאחר 48 שעות, להסיר את התקשורת מתרבויות פיברובלסטים transfected ולהחליף עם מדיום mTeSR. החלף תקשורת התרבות יומי עד תאי גזע pluripotent מושרה מושבות (iPSC) מוכנות להיות מבודד. יכולות להיות שנצפו מושבות iPSC לאחר 28-35 ימים.
- כאשר מוכן לבידוד, מכאני לחתוך מושבה iPSC ולזרוע במדיום mTeSR עם 10 kinase הקשורים Rho מיקרומטר החלבון (ROCK) מעכב (Y-27632) על צלחת Matrigel מצופה 6-גם 12. החלף בינוני תרבות יומית.
- כאשר תרבויות iPSC הן סביב 20% מפגש, להסיר בינוני mTeSR ולהחליף עם מדיום עצבי אינדוקציה (טבלה 1). לחדש בינוני בכל יום שני.
- לאחר 7 ימים, להסיר בינוני אינדוקציה עצבית ולהחליף בינוני אנושי NPC תחזוקה (טבלת 1). לחדש בינוני בכל יום שני עד 7 ימים לפני passaging תרבויות.
- לפני passaging תרבויות, צלחות מעיל / צלוחיות עם Matrigel בטמפרטורת חדר למשך לפחות שעה.
- הסר את המדיה מתרבויות NPC אנושיות ומחוברות ולשטוף פעם עם 1x PBS אז לשאוב PBS את.
- הוסף פתרון ניתוק תא מספיק כדי לכסות את כל הבארות אז דגירה של 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- ודא שכל התאים יש מנותקים. להוסיף כמות כפולה של DMEM /F-12 לזה של פתרון ניתוק תא לבארות / צלוחיות.
- העבר את DMEM / F-12 תאים המכילים לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות.
- הסרת תאי supernatant ו resuspend ב 5 מיליליטר בינוני אנושית NPC תחזוקה (טבלת 1). בעדינות השעיה את תא פיפטה ולמטה כדי לשבור את התאים.
- צלחת שלישית של תאים כולל לתוך בארות / צלוחיות תרבות Matrigel מצופים ועליון עד בינוני מספיק בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632. דגירה כלי תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- תרבויות פיצול 1: 3 בכל 3 עד 4 ימים ולחדש בינוניים בכל יום אחר. לשמור על תרבויות NPC אדם בצפיפות גבוהה כדי למנוע בידול.
- הוסף את וקטור lentiviral Synapsin1-tdTomato לתרבות NPC אדם לפני ביצוע בידול לתוך הנוירונים. הכן שיתוף תרבויות astrocyte / נוירון בקליפת המוחיום מראש לפני ההבחנה NPCs האנושי.
- לשטוף תרבויות NPC אדם פעם אחת עם PBS 1x ולהוסיף פתרון ניתוק תא מספיק כדי לכסות את כל הבארות / צלוחיות אז דגירה של 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- ודא שכל התאים יש מנותקים. להוסיף כמות כפולה של DMEM / F-12 כמו זה של פתרון ניתוק תא לבארות / צלוחיות. להעביר לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות.
- הסרת תאי supernatant ו resuspend ב 5 מיליליטר בינוני בידול עצבי (טבלה 1). בעדינות השעיה את תא פיפטה ולמטה כדי לשבור את התא גלולה לתוך תאים בודדים. לספור את מספר התאים בודדים עם hemocytometer.
- זהירות לשאוב בינוני מתרבויות נוירון קורטיקלי astrocyte /. NPCs האנושי הצלחת ב 5 x 10 3 תאים / 2 סנטימטר ב500 μl של מדיום בידול עצבי (טבלה 1) בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 עבור כל 24 גם. בעדינות להוסיף בינוני המכיל NPCs האנושי לכל טובכדי להימנע מלהפריע להאסטרוציטים ותאי העצב בקליפת המוח.
- דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. להחליף מחצית הבינונית עם בינוני טרי כל יומיים-שלושה לפחות 28 ימים.
- לאשר אם iPSCs אדם מתנהג כמו תאים בוגרים.
- מצא את התאים מובחנים מiPSCs אדם על ידי הדמיה של tdTomato באמצעות מיקרוסקופ confocal זקוף מצוידים בעדשת טבילה במי 60x (0.9 NA).
- משוך הקלטת פיפטה להתנגדות של 4 עד 6 תאים מ 'תנקב בטמפרטורת חדר בפתרון חיצוני (טבלה 1) מבעבע כל הזמן עם 95% O 2/5% CO 2. מלא את micropipette ההקלטה עם פתרון פנימי (טבלה 1).
- תא תיקון tdTomato + במצב כל התא וירי פוטנציאל פעולת שיא בתגובה להזרקה נוכחית (משך 1 שניות, מרווחים של 10 הרשות הפלסטינית) בנוכלשכור מהדק.
- לאשר אם פוטנציאל פעולה של תאים בקליפת המוח להביע ChR2 הוא עורר באופן מהימן על ידי גירוי אור.
- מצא את התאים בקליפת המוח להביע ChR2 על ידי הדמיה של ה- GFP תחת מיקרוסקופ confocal. לבצע הקלטת מהדק תיקון כל התא בתאים בקליפת המוח על ידי ביצוע שלבים 10.1.2 ל10.1.3.
- פוטנציאל פעולת סימון עורר באופן מהימן על ידי תאורת אור עם מנורת קשת כספית (100 W). אורך הגל של מסנן עירור הוא nm 480/40.
- לבצע גירוי optogenetic.
- tdTomato תיקון + תא במצב כל התא ומהדק מתח נקבע על -70mV. לסנן אותות הנוכחיים ב -2 קילוהרץ ועבר דיגיטציה ב -10 kHz. צג התנגדויות סדרה הנעות 10-20 M לעקביות במהלך הקלטות.
- לעורר כל שדה על ידי מסנן מנורת כספית עם 480/40 ננומטר עירור 100 W למשך 30 שניות.
- זרמי postsynaptic שיא (PSCs) של תא טלאים הנגרם על ידי photostimulation של ChR2 להביע cor presynapticנוירונים tical. לזהות ולמדוד PSCs. סף שנקבע למשרעת ואזור זרמים בשעה 5 ו -20 PA מחשב, בהתאמה. באופן ידני לבדוק את האירועים הללו כדי לבטל את כל עקבות שאינן PSC.
הערה:. שיטה זו הותאמה מאל Okita et 10
8. עצבי אינדוקציה ותחזוקה של NPCs אדם
הערה:. שיטה זו תוארה על ידי et al לי 11
9. בידול של NPCs אדם לנוירונים בשיתוף תרבויות
10. הקלטות אלקטרו של נוירונים נגזרים iPSC
Representative Results
כאן, פרוטוקול המתאר את השלבים המרובים מעורבים ביצירת התרבות משותפת מורכבות האסטרוציטים, נוירונים בקליפת המוח ותאי עצב אנושיים באו לידי ביטוי. iPSCs אדם התקבלו על ידי תכנות מחדש fibroblasts באמצעות episomal וקטורי 10 וצוין לשושלת עצבית עם קוקטייל של מעכבי מולקולה קטנה, מה שהופך את NPCs 11 שנשמרו בצפיפות גבוהה (איור 1 א). כמה צעדים נדרשים כדי ליצור התרבות המשותפת: בידול של NPCs עכבר להאסטרוציטים, ציפוי של תאי עצב בקליפת המוח חולדה להביע ChR2, וזריעה של NPCs אדם מתויג עם tdTomato (איור 1). ביום 2 של בידול, חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP) + האסטרוציטים יכול בקלות להיות שנצפו בתרבויות שלנו (איור 1 ג). עכבר NPCs הורשו להבחין במשך שבוע לפחות לפני ציפוי נוירונים בקליפת המוח להביע ChR2 על monolayer astrocyte (1D איור). לאחר 3עד 4 שבועות של בידול NPC האנושי, תאי עצב tdTomato + התגלו בתרבויות (איור 1E).
מערכת שיתוף התרבות זו מאפשרת זיהוי עקבי של זרמי postsynaptic מהנוירונים נגזרים iPSC בודדים בתגובה לגירוי אור (איור 2 א). כאשר מגורה על ידי אור, פוטנציאל פעולה נוצרו בתאי עצב בקליפת המוח להביע ChR2 (איור 2). הנגזר iPSC נוירונים גם להתרגש (איור 2 ג), מראה ירי פוטנציאל פעולה מוגבר כהמשרעת של depolarizing פולסים נוכחי הוגדל (איור 2 ד). כך, תאים אלה תערוכת תכונות עצביות בוגרות. בהעדר האור, תאי עצב נגזר iPSC קיבלו תשומות ספונטניות הסינפטי (איור 2E). זרמים פנימה postsynaptic אלה בתיווך בעיקר על ידי קולטני AMPA, כי זרמים דרך קולטני GABA יהיו כלפי חוץ וקולטני NMDA לא לשאת נוכחיt פוטנציאל החזקת -70 mV. לפחות חלק מהתשומות אלה היו מנוירונים בקליפת המוח presynaptic להביע ChR2, כי גירוי אור הגביר את התדירות של זרמי postsynaptic (איור 2E) באופן משמעותי. כמובן של גידול זה בקלט סינפטי הזמן מוצג באיור 2F: photostimulation של נוירונים בקליפת המוח שספג לאורך כל הבזק אור ארוך 30 שניות. בעוד התדירות של PSCs הייתה גבוהה כאשר תאי עצב בקליפת המוח להביע ChR2 היה photostimulated (איור 2G), משרעת שלהם לא נפגע (איור 2H). לסיכום, תוצאות אלו מצביעות על כך שתאי העצב נגזר iPSC הציגו תכונות עצביות בוגרות ויכולים ליצור קשרים סינפטיים עם תאי עצב בקליפת המוח presynaptic.
איור 1: תרשים סכמטי עבור הדור של תרבות המשותפתציר זמן מערכת. (א) לתכנות מחדש fibroblasts האנושי לiPSCs ואינדוקציה עצבית לNPCs. ציר זמן (B) לבידול מסוף של NPCs האנושי לתאים בוגרים בתרבויות נוירון וastrocyte קליפת המוח. (C) העכבר NPCs להבחין במהירות לתוך GFAP + האסטרוציטים אחרי 2 ימים במבחנה. (ד ') לאחר שבוע אחד, נוירונים בקליפת המוח להביע ChR2 היו מצופים על האסטרוציטים GFAP +. (E) בשעת 4 עד 5 שבועות לאחר ההתמיינות של NPCs האנושי, קלטות אלקטרו בוצעו על tdTomato + נוירונים. ברים סולם מייצגים 100 מיקרומטר.
איור 2: ניתוח optogenetic של קישוריות הסינפטי פונקציונלית. נגזר iPSC () תאים מתויגים עם tdTomato (אדום) היו שיתוף תרבותיים עם נוירונים בקליפת המוח המבטאים את האור מופעל-ערוץ, ChR2 (ירוק). הקלטות מתא העצב נגזר iPSC חשפו תגובות postsynaptic הנוכחיות (PSC), שיכול לבוא משני נוירונים בקליפת המוח או נוירונים נגזרים iPSC אחרים. (ב) תאורה (פס כחול) עוררה שורה של פוטנציאל פעולה בתאי עצב בקליפת המוח להביע ChR2. ( נגזרים תאי iPSC C) הם עוררו על ידי הזרקה נוכחית. (ירי D) לעומת עקומה הנוכחית של נגזרים תאי iPSC. (E) photostimulation של נוירונים בקליפת המוח ChR2 להביע (פס כחול) הגבירו את התדירות של PSCs בנוירונים נגזרים iPSC . כמובן (F) זמן של העלייה בתדירות PSC המיוצרת על ידי photostimulation. בר כחול מציין זמן של photostimulation. (G, H) בעוד תדירות PSC הוגדלה על ידי photostimulation (G), משרעת PSC לא נפגע (H). * מציין p <0.05 לעומת שליטה במבחן t.
Discussion
Optogenetics מספק דיוק של זמן ומרחב להפעלה של אוכלוסיות מוגדרות של נוירונים 13. בניסויים שלנו, את כל השדה של המטרה מיקרוסקופ היה מואר למשך 30 שניות לנוירונים בקליפת המוח רק צילום לעורר להביע ChR2. זה אפשר לנו לקבוע אם קשרים סינפטיים נוצרו בין אוכלוסיות השונות של תאי עצב בשיתוף התרבות. התוצאות שלנו גילו כי photostimulation מגביר תדירות PSC בנוירונים נגזרים iPSC, שמוכיח כי תאי העצב האלה לקבל קלט סינפטי מנוירונים בקליפת המוח presynaptic להביע ChR2. זה, בתורו, קבע כי נוירונים נגזרים iPSC שולבו בהצלחה במעגלים עם נוירונים בקליפת המוח.
ישנם מספר צעדים קריטיים עבור הדור של מערכת שיתוף תרבות זו. חשוב לוודא שתרבויות astrocyte נגזרים NPC העכבר בריאים, עם מותם של תאים מינימאליים, לפני שתמשיך עם ציפוישל סוגי תאים אחרים. נוירונים בקליפת המוח וNPCs האנושי לצרף גם על האסטרוציטים בריאים וקלטות אלקטרו תלויות במידה רבה בתנאי תרבות. הצעדים המרכזיים האחרים בפרוטוקול זה הם electroporation וציפוי של תאי עצב בקליפת המוח על תרבויות astrocyte. כמספר גדול של תאים מתים לאחר electroporation, חשוב להבטיח כי לפחות 6 מיליון תאי עצב בקליפת המוח הם electroporated לציפוי על תרבויות astrocyte בצלחות 24 גם. ראינו כי כאשר פחות מ -6 מיליון תאים electroporated, מספר הנוירונים ששרדו לא יוצר רשת עצבית צפופה, שהשפיעה על קלטות אלקטרו. מספר תאי העצב בקליפת המוח electroporated צריך גם להיות עקבי עבור כל ניסוי שיתוף תרבות כדי לאפשר השוואה בין מחקרים שונים. לכל השלבים כרוכים בעיכול אנזימטי, זה חיוני שלא לעזוב את התאים בתמיסת עיכול במשך זמן רב מדי מכיוון שהוא עלול להוביל למוות של תאים.
זהגישה יכולה לשמש מסך היכולת של תאי עצב שמקורם fibroblasts מטופל ספציפי ליצירת קשרים סינפטיים עם תאי עצב אחרים. נוירונים נגזרים מfibroblasts מחולים הסובלים מהפרעת נוירו-התפתחות תסמונת רט (RTT) תערוכת פגמי שידור סינפטי: תאי עצב RTT להציג ירידה משמעותית בתדירות ומשרעת PSC בהשוואה לנוירונים בריאים, ככל הנראה בשל פחות קישוריות הסינפטי 14. מערכת שיתוף התרבות שלנו מאפשרת בדיקה של שפעות תרופה על תאי עצב בו מוצגות פגמים התפתחותיים. זה יכול להתבצע באמצעות תוספת של תרכובות של ריבית במהלך הזריעה של NPCs אדם החולה, כמו גם במהלך חשיפה ממושכת לתרכובות בכל עת ההבחנה עצבית.
בעוד מערכת שיתוף תרבות זו יכולה לשמש גם כמודל לבדיקות סמים, הגבלה בגישה זו היא שהתהליך של לחקור את ההשפעות של כל מתחם מועמד יכול להיות ארוך ומייגע כזה לא שיטת הקרנת תפוקה גבוהה. בעקבות טיפול עם תרכובות מועמד, הנוירונים נגזרים iPSC צריכים להיות תוקנו בנפרד כדי לקבוע את ההשפעות של כל מתחם על PSCs. יתר על כן, יש כיום לא רב fibroblasts זמין וiPSCs מחולים. לכן, זה יהיה העניין בעתיד הקרוב לתאים חולים יותר וגם כדי להתאים פרוטוקול זה להקרנת תפוקה גבוהה. לדוגמא, על ידי תיוג נוירונים נגזרים iPSC עם מחוון פעילות, כגון חיישנים גנטי מקודדים של יונים או פוטנציאל הממברנה, אפשר יהיה להגביר את קצב התפוקה באופן משמעותי על ידי הליך אלקטרו זמן רב דריכה בצד. ככל התהליך של יצירת מערכת שיתוף תרבות זו, מתכנות מחדש fibroblasts לביצוע הקלטות אלקטרו, דורש יותר מ -90 ימים, מומלץ שיורחב גם iPSCs או NPCs האדם, לאחר תכנות מחדש וצעדי אינדוקציה עצביים בהתאמה,וcryopreserved כדי לצמצם את הזמן דרוש לניסויים עתידיים.
בניסויים שלנו, אנו הביעו ChR2 בנוירונים בקליפת המוח תחת אמרגן synapsin1. בגלל אמרגן זה פאן-עצבי, אנחנו כנראה היו photostimulating שני תאי עצב בקליפת המוח מעכבים ומעוררים. אם המטרה של ניסויים עתידיים היא לחקור את אופן ספציפי מעגלים או מעכבים או מעוררים, יכולים לשמש יזמים ספציפיים יותר. לחלופין, ניתן היו להשיג נוירונים בקליפת המוח ממהונדס (או מוזרק וירוס עכברים) שבו ביטוי ChR2 הוא ממוקד במיוחד לאוכלוסיות גנטית מוגדרות של תאי עצב. לדוגמא, רקמות קליפת המוח קציר מעכבר שיש recombinase Cre באו לידי ביטוי בinterneurons המכיל parvalbumin (interneurons PV) שהוא חצה עם עכבר עם ChR2 floxed יניב מצב שבו נוירונים בקליפת המוח רק להביע ChR2 יהיו interneurons PV 15. השימוש בChR2 להביע interneurons בנו שיתוף מ"ק כזהמערכת lture תאפשר הקביעה אם נוירון נגזר iPSC שתוקנה הוא מסוגל לשלב במעגל עם interneurons PV.
בהתבסס על מחקר קודם 9, נוירונים בקליפת המוח הם בוגרים עם חופף דנדריטים לאחר 14 ימים במבחנה. לכן, אם photostimulation לא לעורר תגובה מתא עצב נגזר iPSC טלאים, זה צריך להצביע על כך שתא העצב אין לו את היכולת ליצור קשרים סינפטיים עם תאי עצב בקליפת המוח. נוירון נגזר iPSC יכול לקבל קלט סינפטי או מתא עצב או נוירונים בקליפת המוח נגזר iPSC אחרים. אם הקלטות מהדק תיקון מסורתי שמשו, זה יהיה לא ניתן להבחין בו קלט סינפטי הוא בא. היתרון של המערכת שלנו הוא שתגובות postsynaptic מקלט סינפטי קליפת המוח יכולות להיות עורר באופן סלקטיבי וזיהו. הנהלים המתוארים כאן מספקים גישה פשוטה כדי להעריך את היכולת של הנוירונים נגזרים iPSC לשלבלרשת עצבית מוגדרת.
Acknowledgments
אנו מודים ק דייזרות 'וס' Je למבני lentiviral ChR2 וSynapsin1-tdTomato בהתאמה, ג חי לשיתוף מומחיות ופרוטוקול על דור iPSC, WY Leong לקבלת תמיכה טכנית, אנשי המעבדה Goh לחומרים כימיים שיתוף ומומחיות. עבודה זו נתמכה על ידי אבוט תזונה והמרכז האקדמי של אקסלנס (ACE) הפרס מחקר מGlaxoSmithKline (GSK) לElg, על ידי קרן המחקר הלאומית סינגפור במסגרת תכנית המחקר התחרותית שלה (NRF 2,008 NRF-CRP 002-082) לElg ו GJA, ועל ידי World Class המכון (WCI) התכנית של קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) ממומנת על ידי משרד חינוך, מדע והטכנולוגיה של קוריאה (MEST) (NRF גרנט מספר: WCI 2,009-003) לGJA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurocult Proliferation Kit (Mouse) | STEMCELL Technologies | 5702 | Contains NSC Basal Medium and NSC Proliferation Supplement |
| Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | |
| DMEM/F12 | Lonza | 12719F | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| MEM without glutamine | Invitrogen | 11090081 | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| GlutaMAX supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140122 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Human LIF | Invitrogen | PHC9484 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotech | 130103926 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | |
| Compound E | Merck Millipore | 565790 | |
| EGF | Merck Millipore | 324856 | |
| FGF2 | R&D Systems | 233FB025 | |
| Research Grade FBS | Thermo Scientific | SV30160.03 | For astrocyte differentiation medium |
| Defined FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | For primary neuron medium |
| PBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | For primary neuron medium |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Heparin | EMD Millipore | 375095 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175095 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dispase II | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | For harvesting brains |
| EBSS | Invitrogen | 14155063 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 70 µm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 20 µm filter unit | Sartorius Stedim | 16534K | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4 | Fluka | 71505 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| D(+)-Glucose | Sigma | G7520 | For electrophysiological studies |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| KOH | KANTO Chemical | 3234400 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | For electrophysiological studies |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma | A7699 | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| Borosilicate glass capillaries | World precision instruments, Inc | 1604323 | |
| 15 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352070 | |
| 24-well plates | Corning | 9761146 | |
| 6-well plates | Corning | 720083 | |
| T25 flasks | Corning | 430641 | |
| 12 mm cover glasses | Marienfeld-Superior | 111520 | |
| AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit | Lonza | VPG1003 | For electroporation of primary cortical neurons |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | For electroporation of human fibroblasts |
| Mini Analysis | Synaptosoft | Mini Analysis v.6 | For measurement of PSCs |
| Normal Dermal Human Fibroblasts | PromoCell | C12300 | |
| pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE | Addgene | 20945 | |
| Mercury short-arc lamp | OSRAM | HBO 103 W/2 |
References
- Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Stroh, A., et al. Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation. Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).
- Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -C. Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).
- Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).
- Braun, H., Günther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).
- Shivaraj, M. C., et al. Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain. PLoS ONE. 7, e42935 (2012).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).
- Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
- Marchetto, M. C. N., et al. A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, 160 (2013).
