Introduction
В последние годы, наше понимание нейрона и функции нейронов цепи были революцию на несколько optogenetic инструментов, которые контролируют возбудимость нейронов. Одним из таких инструментов является светло-активируется катионом канал, channelrhodopsin-2 (ChR2): нейроны, выражающие ChR2 потенциалы огонь меры в ответ на световой стимуляции 1-3. Потому что нейроны обычно не чувствительны к свету, это замечательная способность открывает новые возможности для точного временного и пространственного контроля за деятельностью генетически определенных популяций нейронов 4 и значительно ускоряется исследования функции мозга. ChR2 был применен к исследованиям стволовых клеток для различных целей, от мониторинга развития нейронов 5 к регулированию деятельности нейронных сетей 6.
Здесь мы использовали ChR2 увеличить полезность нейронов системы совместного культуры. Системы Co-культуры, что позволяет оценивать взаимодействия между различными типами клеток.Со-культуры нейронов и глии, основные типы клеток нервной системы, как правило, используется для исследования сигналов между этими различными типами клеток, а также оценить значимость этого Сигнализация для физиологических реакций, распространение повреждения и изучить молекулярные механизмы, которые потенциально участвующие в этом сигнализации 7. Предыдущее исследование показало, что человеческие иПСК отличить очень быстро в нейроны в присутствии коры головного мозга крыс первичной культуре, содержащей нейронов, астроциты, олигодендроциты и микроглии 8.
В этом протоколе, мы продемонстрировать способ, который использует ChR2 в системе сокультуры опрашивать синаптические связи между крысы корковых нейронов и нейронов, полученных из человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Мы описываем шаги расчленения и урожай тканях мозга 9, а также для поддержания и дифференцировать мыши нервные клетки-предшественники (НПС) в астроциты и человека НПС INTО нейроны, чтобы создать систему совместного культуры. Чтобы установить эту систему совместного культивирования, мы использовали интеграции без метод перепрограммирования, описанного Okita и др. 10 для получения человеческих ИПСК. Эти иПСК затем эффективно дифференцированы в НПС в химически определенных условиях с использованием ингибиторов низкомолекулярные, как описано Li и др. 11
В со-культур, различные популяции нейронов могут быть идентифицированы с помощью обнаружения выражения ChR2 в корковых нейронов и пометки IPSC, полученных из нейронов с помощью флуоресцентного белка, тандем димера Помидор (tdTomato). Сочетание электрофизиологических записи с Ipsc-производных нейронов с optogenetic фотостимуляцией корковых нейронов позволяет оценить способность этих двух типов нейронов с образованием цепей друг с другом. В частности, Фотостимуляция ChR2-выражения корковых нейронов вызывают синаптические реакции в IPSC, полученных из нейронов, которые сформировались синаптические цепис фотостимулированной корковой нейронной сети. Мы демонстрируем, что увеличение постсинаптические токи действительно обнаружены в IPSC, полученных из нейронов в таких условиях. Этот протокол позволяет оценить синаптической схемы при различных экспериментальных условиях, в том числе перепросмотре различных моделей неврологических заболеваний с использованием ИПСК, полученные из фибробластов из пациентов с болезнью.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты проводятся следующие протоколы, утвержденные уходу и использованию комитета Институциональная животных в SingHealth мимо.
1. Мозги Сбор раннем послеродовом мыши
- Перед вскрытия, подготовки ткани гиппокампа, пищеварение раствор: 10 мкл папаина за сбалансированный солевой раствор 1 мл 1x Эрла (EBSS) (+ 1% HEPES) дезоксирибонуклеазой I (ДНКазы I) (250 ед / мл) и диспаза II (1 U / мл). Составит примерно 2,5 мл тканевой пищеварения раствора и отфильтровать его с помощью блока с 0,20 мкм фильтр. Хранить в теплом растворе при 37 ° С до использования.
- Обезболить день после рождения 5 (P5) Мышь щенков, помещая их на льду в течение 5 мин. Удалить из льда и теста для боли рефлекса с помощью пальца или хвост щепотку. Спрей щенков с 70% этанола. Обезглавьте щенков и поместить голову в чашке Петри со льдом.
- Надрезать кожу вдоль средней линии, от основания черепа к носу, с парой небольшой scissoRS или мелкими Режущая щипцы. Пил открыть кожу и сделать подобный разрез через череп. Сделать два дополнительных горизонтальных разрезов на каждой стороне черепа, один ростральные (в темени) и один каудально (в лямбда).
- Пил открыть череп по надрезанные линии, чтобы разоблачить основной мозг. Используйте пару щипцов для удаления череп, покрывающий обонятельные луковицы, и любой средней линии кость между ними. Сделайте это, удерживая голову стабильный с парой щипцов в не рассекает стороны.
- Простота плоская часть шпателем между вентральной части мозга и основания черепа в каудальном конце. Поддержание шпатель параллельно основанию черепа при мозга, перемещать его в направлении ростральной конце черепа, чтобы разорвать любые спайки между мозгом и основание черепа.
- Совок мозг с помощью шпателя и поместить его в чашку Петри, содержащую ледяной 1x EBSS (+ 1% HEPES). Держите салфетки подводные во все времена.
- Навсегдашаги микро-рассечение, работа под микроскопом рассекает и использовать пару тонких рассекающих щипцов в каждой руке, один для резки ткани и другие для проведения ткани стабильным.
- Сделайте сокращение только позади коры головного мозга, чтобы отделить его от заднего мозга. Сокращение вдоль средней линии, чтобы отделить кору головного мозга в двух полушариях. Удалить мозговых оболочек из полушарий головного мозга.
- Поставьте полушария медиальной стороной вверх и вставьте щипцы в боковой желудочек под гиппокампа. Срежьте средний мозг.
- Сделать надрезы на верхней и нижней сторон гиппокампа, а рядом с зубчатой / энторинальной коры стыке изолировать гиппокамп от коры головного мозга. Сбор гиппокампа в чашку, содержащую ледяной 1x EBSS (+ 1% HEPES).
2. ткани гиппокампа диссоциации
- Трансфер гиппокампа в чашку, содержащую предварительно нагретой гиппокампа решение ткань пищеварения. Фарш тОн гиппокампа ткани как хорошо, как это возможно, и инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С.
- Аккуратно отделить ткани на отдельные клетки с помощью механических пипеток и передачи клеток в 15 мл центрифужную пробирку.
- Центрифуга при 200 мкг в течение 5 мин и удалить супернатант.
- Ресуспендируют осадок клеток в 20 мл 0.5x сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS), содержащий сахарозу (0,9 М) и центрифуге при 200 х г в течение 10 мин.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 2 мл NPC поддерживающую среду (таблица 1), размещены в верхней части 10 мл 4% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в растворе 1X EBSS и центрифуге при 200 х г в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и добавить NPC мыши поддерживающую среду (Таблица 1) к осадку клеток. Аккуратно пипетки вверх и вниз 5-10 раз, чтобы обеспечить клеточный осадок разбивается на отдельные клетки.
- Передача среде, содержащей клетки в предварительно покрытых пластин Матригель и добавить эпидермальный фактор роста (EGF) и fibroblaул фактора роста 2 (FGF2) (как 20 нг / мл) в гепарина (5 мг / мл). Планшеты инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2.
3. Техническое обслуживание Приверженец мыши гиппокампа NPC,
- Подготовка пластинок, покрытых / колбы, по крайней мере за час до пассажи мыши гиппокампа NPC. Добавьте достаточно Матригель, чтобы покрыть площадь поверхности каждой пластины или колбы и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Удалить материал из 90% сливной мыши NPC культур и мыть один раз 1x фосфатным буферным солевым раствором (PBS), а затем аспирации PBS с.
- Добавьте достаточно раствора открепления клеток, чтобы покрыть все лунки / колбы и инкубируют в течение 5 мин при 37 ° С.
- Убедитесь, что все клетки были отключены, глядя под инвертированным яркой поле микроскопа на 10-кратным увеличением. Если есть еще клетки, прикрепленные, инкубировать культуры судно для дальнейшего 1-2 мин и проверьте клетки снова. Добавить в двойном размере модифицированного F-12 питательной смеси Игла Дульбекко / Хэма (DMEM / F-12)как и открепления клеток раствора в лунках / колбы сразу все клетки были отделены.
- Передача DMEM / F-12, содержащей клетки в 15 мл центрифужную пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 5 мл обслуживания NPC мыши среды (таблица 1). Аккуратно пипетки вверх и вниз, чтобы разбить осадок клеток в одиночных камерах.
- Пластина треть от общего числа клеток в новую культуру скважин / колбы и пополнят достаточно культуральной среде, содержащей EGF и FGF2. Инкубируют сосуды для культивирования при 37 ° С и 5% СО 2. Пополнить среды каждый второй день и разбить ячейки 1: 3 раз 3 до 4 дней. Избегайте чрезмерного роста NPC мыши культур для предотвращения агрегации и отряд.
4. Дифференциация Мышь НПС в астроциты
- Подготовка поли-L-лизин (PLL) / ламинином покрытием 12 мм покровных стекол по крайней мере день заранее, до начала дифференциации НПС мыши в астроциты. Добавить Крытаяerslips в 24-луночный планшет и покрывают всю поверхность скважин с достаточно PLL (1 мг / мл в буфере бората).
- Инкубируют планшет в течение ночи при 4 ° С. На следующий день, удалить PLL и мыть один раз 1x PBS.
- Добавить ламинина (1 мг / мл в охлажденном льдом DMEM / F-12), снова охватывает всю поверхность каждой лунки, затем инкубируют в течение по меньшей мере 4 часа при 37 ° С.
- Удалить носитель из мыши NPC культур и мыть один раз 1x PBS затем аспирации PBS с.
- Добавьте достаточно раствора открепления клеток, чтобы покрыть все лунки / колбы и инкубируют в течение 5 мин при 37 ° С.
- Убедитесь, что все клетки отдельные затем добавить в два раза больше DMEM / F-12, что и открепления клеток раствора в лунки / колбах.
- Передача DMEM / F-12, содержащей клетки в 15 мл центрифужную пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и ресуспендируют клетки в 5 мл астроцитов дифференцировки среды (таблица 1). Аккуратно пипетки клеток suspensioп вверх и вниз, чтобы разбить осадок клеток на отдельные клетки. Подсчитайте количество одиночных клеток с помощью гемоцитометра.
- Пластина клеток в 5 х 10 4 клеток / см 2 в 500 мкл среды для каждую лунку 24-луночного планшета. Планшеты инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2. Заменить половину среды свежей средой каждый второй день. Мышь НПС быстро дифференцируются в астроциты в течение 2 дней, и дифференцированы за неделю до начала дальнейших экспериментов.
5. Сбор эмбриональных крыс Мозги и корковой ткани Диссоциация
- Удалить астроцитов дифференциации среды (таблица 1) из астроцитов культур и заменить с первичной нейронов среды (таблица 1), по меньшей мере 4 ч до начала урожай эмбриональных мозга крысы.
- Перед вскрытием подготовить корковой ткани пищеварения решение: 10 мкл папаина на 1 мл 1x EBSS (+ 1% HEPES) с 12,1 мг / мл L-цистеина. Сделайте примерно 20,5 мл тканевой пищеварения решения и фильтровать с помощью блока 0,20 мкм фильтр. Хранить в теплом растворе при 37 ° С до использования.
- Эвтаназии беременную плотине углерода асфиксией диоксидом с использованием сжатого газа. Тест на боли рефлекса через пят или хвост щепотку.
- Положите животных вентральной стороной вверх на абсорбирующей прокладки и выдержите его брюшной области с 70% этанола. Ущипнуть кожу с парой щипцов и сделать боковую разрез с парой хирургическими ножницами, достаточно широкий, чтобы выставить живот. Возьмитесь за брюшину с пинцетом и разрезать брюшную полость.
- Поднимите рог матки с помощью пинцета и разрезать его бесплатно по mesometrium. Поместите расчлененный матки в чашку Петри со льдом. Отделите каждый эмбрион путем разрезания ткани матки между ними.
- Сделайте надрез в зародышевого мешка. Осторожно оболочки плода через отверстие. Обезглавьте плода, поместив голову в чашке Петри со льдом.
- Для уборки эмбрионакрысы мозг IC, следуйте инструкциям из шагов 1,3 до 1,5.
- Препарировать корковых ткани, положите полушарие мозга боковой стороной вверх. Отрежьте полушарие в двух боков от середины. Отменить половины ближе к основанию мозга. Обрезать вырезали ткань, чтобы удалить средний мозг.
- Передача коры ткани, чтобы блюдо с предварительно нагретой корковой решение ткань пищеварения. Фарш кортикальные ткани как хорошо, как это возможно, и инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С.
- Передача корковых ткани из ткани пищеварения раствора в 50 мл центрифужную пробирку, содержащую 10 мл предварительно нагретой первичной нейронов среднего (Таблица 1). Отделить корковых тканей путем многократного пипетки вверх и вниз в серологической пипетки, пока гомогенный раствор без каких-либо частей ткани не получают.
- Пропустите решение ткани через сито 70 мкм клетки, чтобы отфильтровать оставшиеся ткани скопления. Алиготе ткани раствор в 15 млцентрифужные пробирки, при добавлении приблизительно 3 мл в каждую пробирку.
- Добавить 800 мкл 7,5% БСА в PBS 1x на дно каждой пробирки, образуя два слоя ткани с раствором сверху и БСА в нижней части.
- Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант, аспирационных от поверхности раздела двух слоев. Во избежание нарушения клеточного осадка на дне пробирки.
- Ресуспендируют каждый осадок клеток в 1 мл первичной нейронов среды (таблица 1) и объединить их в 15 мл центрифужную пробирку. Определить плотность клеток с помощью гемоцитометра.
6. Электропорация и покрытия из Первичные зоны коры Нейроны
Примечание: Перенос гена может быть достигнуто несколькими способами, в том числе электропорации, фосфат кальция трансфекции и вирусной трансдукции. В этом протоколе мы опишем электропорации для доставки ChR2 построить в первичных корковых нейронов.
- Центрифуга 6 х 10 6 крыс нейроны коры черезT 200 х г в течение 5 мин и удалить супернатант. По крайней мере, 6 × 10 6 корковые нейроны, необходимые для электропорации, чтобы обеспечить формирование нейронной сети путем выживания нейронов.
- Добавить 100 мкл электропорации раствора осадок клеток и ресуспендируют мягко. Комбинат 100 мкл клеточной суспензии с 6 мкг Plenti-Синапсины-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE 4 плазмиды и передавать в сертифицированной кюветы. Во избежание получения пузырьков воздуха во время передачи.
- Выбирать и применять соответствующую программу для электропорации в соответствии с инструкциями изготовителя.
- После электропорации, добавить 500 мкл MEM, чтобы клеточной суспензии / ДНК в кювете. Передача образца в 11,5 мл первичной нейронов среду (таблица 1) и ресуспендируют мягко. Общее количество средств массовой информации достаточно для всей пластине 24-а. Аликвоты 500 мкл среды для каждого лунку 24-луночного планшета. Выдержите пластину на 37 ° С и 5% СО 2. 7. Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки
- Культура фибробластов человека в среде DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в 6-луночных планшетах.
- Перед началом перепрограммирования фибробластов, пальто 6-луночных матригелем и инкубировать в течение по крайней мере час при комнатной температуре. В 80% слияния, удалить носитель из фибробластов культур и мыть один раз 1x PBS.
- Добавьте достаточное количество 0,25% трипсин-ЭДТА, чтобы покрыть всю пластину и инкубировать при 37 ° С в течение 10 мин.
- После того, как клетки были смещены из скважин, добавить в два раза больше DMEM с 10% FBS, что и трипсином для гашения трипсин-переваривание. Аккуратно пипетки клеточной суспензии вверх и вниз, чтобы разбить ячейки. Подсчитайте количество одиночных клеток с помощью гемоцитометра.
- Передача 7 х 10 5 клеток в 15 мл центрифужную пробирку и центрифуги клеточной суспензии в 200 мкг в течение 5минимум
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в электропорации решения. Электропорации в фибробласты в соответствии с инструкциями изготовителя. Ресуспендируют клеток в 100 мкл буфера электропорации и добавить 1 мкг каждого вектора эписомального. Электропорации клетки с настройками 1650 V, 10 мс и 3 временных импульсов.
- Передача клеточной суспензии в DMEM с добавлением 10% FBS и пластины 5 х 10 4 клеток на лунку 6-луночного планшета. Планшеты инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2.
- После 48 часов, удалите СМИ из трансфицированных культур фибробластов и заменить mTeSR среды. Заменить питательных сред ежедневно до индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) колонии не готовы быть изолированы. IPSC колонии могут наблюдаться после 28-35 дней.
- Когда все будет готово для изоляции, механически вырезать колонию IPSC и повторное заполнение в mTeSR среде с 10 мкМ Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK) ингибитора (Y-27632) на покрытой 6-луночного планшета Matrigel 12, Ежедневно заменить культуральной среды.
- Когда IPSC культуры являются около 20% слияния, удалить mTeSR среду и заменить нервной индукционной среде (таблица 1). Пополнить среднего каждый второй день.
- После 7 дней, удалить нейронной индукционной среде и заменить человека NPC поддерживающей среде (таблица 1). Пополнить среды каждый второй день до 7 дней до пересева культур.
- До пассажей культуры, пальто Тарелки / колбы с Matrigel при комнатной температуре в течение, по крайней мере в час.
- Удалить носитель из сливающихся человеческих культур NPC и мыть один раз 1x PBS затем аспирации PBS с.
- Добавьте достаточно открепления клеток решение, чтобы охватить все скважины, то инкубировать в течение 5 мин при 37 ° С.
- Убедитесь, что все клетки были отключены. Добавить в два раза больше DMEM /F-12, как и открепления клеток раствора в лунки / колбах.
- Передача DMEM / F-12, содержащей клетки в 15 мл центрифужную пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и ресуспендируют клеток в 5 мл человеческого NPC поддерживающую среду (Таблица 1). Аккуратно пипетки клеточной суспензии вверх и вниз, чтобы разбить ячейки.
- Plate треть общего числа клеток в Matrigel покрытием культуры колодец / колбы и пополнят достаточно среде с добавлением 10 мкМ Y-27632. Инкубируют сосуды для культивирования при 37 ° С и 5% СО 2.
- Сплит культуры 1: 3 раз 3 до 4 дней и пополнения среднего каждый день. Поддержание человека культуры NPC при высокой плотности, чтобы предотвратить дифференциацию.
- Добавить лентивирусный вектор Synapsin1-tdTomato человеческой культуры NPC до начала дифференциации в нейроны. Подготовка астроцитов / корковых нейронов сопутствующих культурдень заранее, до дифференциации человека NPC.
- Промыть человека культуры NPC один раз 1x PBS и добавить достаточно раствора открепления клеток, чтобы охватить все лунки / колбы затем инкубировали в течение 5 мин при 37 ° С.
- Убедитесь, что все клетки были отключены. Добавить в два раза больше DMEM / F-12, как и открепления клеток раствора в лунки / колбах. Передача в 15 мл центрифужную пробирку. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и ресуспендируют клеток в 5 мл дифференцировка нейронов среднего (таблица 1). Аккуратно пипетки клеточной суспензии вверх и вниз, чтобы разбить осадок клеток в одиночных камерах. Подсчитайте количество одиночных клеток с помощью гемоцитометра.
- Тщательно аспирата среды от астроцитов / корковых культур нейронов. Пластинчатые человека НПС на 5 х 10 3 клеток / см 2 в 500 мкл среды нейрональной дифференцировки (Таблица 1) с добавлением 10 мкМ Y-27632 для каждого 24-а. Аккуратно добавить носитель, содержащий человека НПС в каждую лункучтобы не потревожить астроцитов и нейронов коры.
- Планшеты инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2. Заменить половину среды свежей средой каждые два-три дня, по крайней мере, 28 дней.
- Подтвердите, что человека иПСК вести себя как зрелые нейроны.
- Найти клетки, дифференцированные из человеческих ИПСК по визуализации tdTomato, используя вертикальную конфокальной микроскопии, оснащенный 60X (0,9 NA) погружения в воду линзы.
- Вынуть записи пипетки к сопротивлению от 4 до 6 М. заливать клеток при комнатной температуре во внешнем растворе (таблица 1) барботируют непрерывно с 95% O 2/5% CO 2. Заполните записи микропипетки с внутренней раствора (Таблица 1).
- Патч tdTomato + клеток в режиме целых клеток и записи действий потенциального стрельбы в ответ на инъекции тока (1 сек при 10 с шагом Па) в дворняжкаАренда зажим.
- Подтвердите, если потенциал действия корковых клеток, экспрессирующих ChR2 надежно, вызванный световой стимуляции.
- Найти корковых клеток, экспрессирующих ChR2 визуализацией GFP под конфокальной микроскопии. Выполните целой клетки записи патч зажим на корковых клеток, выполнив действия 10.1.2 для 10.1.3.
- Потенциал Проверить действие надежно, вызванный светового облучения с дуговой ртутной лампы (100 Вт). Длина волны возбуждения фильтра 480/40 нм.
- Выполните optogenetic стимуляции.
- Патч tdTomato + клеток в режиме целых клеток и установите зажим напряжение на -70mV. Фильтр текущие сигналы на 2 кГц и оцифровывать на 10 кГц. Монитор сопротивления серии, начиная от 10 до 20 м для соответствия во время записи.
- Стимулировать все поле 100 Вт фильтра ртутная лампа с 480/40 нм возбуждения в течение 30 сек.
- Запись постсинаптические токи (ЧОК) по исправленной клетки, вызванного фотостимуляцией ChR2-выражения пресинаптического Корческим нейронами. Обнаружение и измерение УИК. Установите порог амплитуды и токов области на 5 Па и 20 ПК, соответственно. Вручную проверить эти события, чтобы отменить любые нестандартные PSC следов.
ПРИМЕЧАНИЕ:. Этот метод был адаптирован из Okita и др 10
8. Neural индукции и поддержания человека НПС
ПРИМЕЧАНИЕ:. Этот метод был описан Li и др 11
9. Разграничение человека НПС в нейроны в кооперативном культур
10. Электрофизиологические Записи IPSC, полученных из нейронов
Representative Results
Здесь протокол описания несколько шагов, участвующих в генерации СО-культуру, состоящую астроциты, нейроны коры и человека нейронов показано на рисунке. Человеческие иПСК были получены путем перепрограммирования фибробластов с использованием эписомные векторы 10 и указано в нейронального происхождения с коктейлем ингибиторов низкомолекулярных, что делает НПС 11, которые были сохранены при высокой плотности (фиг.1А). Несколько шагов, которые необходимо для создания совместного культивирования: дифференциацию НПС мыши в астроциты, покрытие крысы корковых нейронов, выражающих ChR2 и посев человека НПС с тегами tdTomato (рис 1б). В день 2 дифференциации, глиальных фибриллярного кислого белка (GFAP) + астроциты легко можно наблюдать в наших культурах (фиг 1C). Мышь НПС было разрешено дифференцировать по крайней мере за неделю до посева корковых нейронов, выражающих ChR2 на астроцитов монослоя (рис 1D). После 34 недель человеческой дифференциации NPC, tdTomato + нейроны были обнаружены в культурах (фиг 1E).
Эта система совместного культивирования позволяет последовательно выявляют постсинаптических токов от отдельных IPSC, полученных из нейронов в ответ на световую стимуляцию (рис 2А). Когда стимулируется светом, потенциалы действия были произведены в корковых нейронов, выражающих ChR2 (рис 2б). IPSC, полученных нейроны также возбудимый (рис 2С), проявляют повышенный потенциал действия стрельбы, так как амплитуда деполяризующих импульсов тока была увеличена (рис 2d). Таким образом, эти клетки обладают зрелые нейрональные свойства. В отсутствие света, IPSC-производные нейроны поступили спонтанные синаптические входы (рис 2E). Эти внутрь постсинаптические токи преимущественно опосредованный АМРА рецепторов, потому что токи через ГАМК-рецепторов бы наружу и рецепторы NMDA не несут ток Ат холдинг потенциал -70 мВ. По крайней мере, некоторые из этих входов были из пресинаптических корковых нейронов, экспрессирующих ChR2, потому что свет стимуляции значительно возрастает частота постсинаптических токов (рис 2E). Временной ход этого увеличения в синаптической входа показано на рисунке 2F: фотостимуляция корковых нейронов был поддержан в течение 30 сек длинный световой вспышки. В то время как частота ЧОК был возведен при ChR2-выражения корковых нейронов фотостимулированная (рис 2G), их амплитуда не был затронут (рис 2H). Таким образом, эти результаты показывают, что Ipsc-производные нейроны выставлен зрелые нейрональные свойствами и может образовывать синаптические связи с пресинаптических нейронов коры.
Рисунок 1: Принципиальная схема для генерации сокультуреСистема. () Срок перепрограммирования фибробластов человека в ИПСК и нервной индукции РНУ. (B) Срок терминальной дифференцировки человека НПС в зрелые нейроны на корковых нейронных и астроцитов культур. (C) Мышь НПС быстро дифференцируются в GFAP + астроциты после 2 дней в пробирке. (D) После одной недели, корковые нейроны, экспрессирующие ChR2 высевали на GFAP + астроцитов. (Е) В 4 до 5 недель после дифференцировки человеческих НПС, электрофизиологические записи были выполнены на tdTomato + нейронов. Шкала бары представляют 100 мкм.
Рисунок 2: Optogenetic анализ функционального синаптической связи. (А) Ipsc полученные клетки с меткой tdTomato (красный) культивировали совместно с корковые нейроны, экспрессирующие свет активированныйканал, ChR2 (зеленый). Запись с IPSC, полученных из нейронов показало постсинаптические тока (PSC) ответов, которые могли бы исходить от любой корковых нейронов или других IPSC, полученных из нейронов. (B) Освещение (синяя полоса) вызвали серию потенциалов действия в корковых нейронов, выражающих ChR2. ( C) IPSC-клеток, полученных вызываются действующим инъекции. (D) Стрельба против нынешней кривой IPSC, полученных из клеток. (E) Фотостимуляция из ChR2 экспрессирующих нейронов коры (синяя полоса) увеличилась частота ЧОК в IPSC, полученных из нейронов . (F) Временной ход увеличением частоты PSC производимого фотостимуляцией. Синяя полоса показывает время фотостимуляцией. (G, H) В то время как частота PSC был увеличен на фотостимуляцией (G), ОАО амплитуда не был затронут (H). * Указывает р <0,05 по сравнению с контролем с т-теста Стьюдента.
Discussion
Оптогенетика обеспечивает временную и пространственную точность для активации определенных популяций нейронов 13. В наших экспериментах, все поле объектива микроскопа была освещена в течение 30 сек на фото для стимулирования только корковых нейронов, выражающих ChR2. Это позволило нам определить, были ли сформированы синаптических связей между различными популяциями нейронов в пределах совместного культивирования. Наши результаты показали, что фотостимуляция увеличивает частоту PSC в IPSC, полученных из нейронов, который демонстрирует, что эти нейроны получают синаптические вход от пресинаптических нейронов коры, выражающих ChR2. Это, в свою очередь, установлено, что Ipsc-производные нейроны успешно включены в схемах с корковых нейронов.
Есть несколько важных шагов для поколение этой системы совместного культуры. Важно, чтобы гарантировать, что мыши, полученные NPC-астроцитов культуры здоровы, с минимальным гибели клеток, прежде чем приступить к обшивкедругих типов клеток. Корковых нейронов и человека НПС также приложить на здоровых астроцитов и электрофизиологические записи в значительной степени зависят от условий культивирования. Другие ключевые шаги в настоящем Протоколе электропорации и покрытие корковых нейронов на астроцитов культур. Как большое количество клеток умирает после электропорации, важно обеспечить, чтобы, по меньшей мере 6000000 корковые нейроны электропорации для посева на астроцитов культур в 24-луночных планшетах. Мы обнаружили, что, когда меньше, чем 6000000 клетки подвергали электропорации, количество нейронов, которые выживают не образуют плотную нейронную сеть, что сказалось Электрофизиологические записи. Количество электропорации корковых нейронов также должна соответствовать для каждого эксперимента со-культуры, чтобы провести сравнение между различными исследованиями. Для всех этапов, включающих ферментативного расщепления, важно, чтобы не оставить клеток в желудочно-кишечном раствора слишком долго, как это может привести к гибели клеток.
Этоподход может быть использован для скрининга на способность нейронов, полученных от пациента специфических фибробластов с образованием синаптические контакты с другими нейронами. Нейроны, полученные из фибробластов от пациентов, страдающих от расстройства нервной Ретта синдром (RTT) обладают синаптические дефекты передачи: RTT нейроны обладают значительное снижение PSC частоты и амплитуды по сравнению с здоровых нейронов, предположительно, из-за меньшего синаптической связи 14. Наша система совместного культивирования позволяет исследовать эффекты наркотиков на нейроны отображения дефекты развития. Это может быть осуществлено с помощью добавления соединений, представляющих интерес при посеве пораженных человека НПС, а также в ходе непрерывного воздействия соединений на протяжении всего времени нейрональной дифференцировки.
Хотя эта система со-культуры также могут быть использованы в качестве модели для тестирования на наркотики, ограничение этого подхода заключается в том, что процесс изучения влияния каждого соединения-кандидата может быть долгим и утомительным, какэто не метод скрининга с высокой пропускной. После обработки соединений-кандидатов, IPSC-производные нейроны должны быть по отдельности исправлена, чтобы определить влияние каждого соединения на УИК. Кроме того, в настоящее время не так много доступных фибробласты и иПСК из пациентов. Таким образом, будет представлять интерес в ближайшем будущем иметь клетки более пациентов, а также адаптировать этот протокол для высокопроизводительного скрининга. Например, путем маркировки Ipsc-производные нейроны с индикатором активности, такие как генетически-кодируемых датчиков ионов или мембранного потенциала, можно было бы увеличить пропускную способность, по существу бок-шагового трудоемкий электрофизиологическое процедуру. Как весь процесс создания этой системы совместно культуры, от перепрограммирования фибробластов к выполнению электрофизиологические записи, требуется более 90 дней, то рекомендуется, что либо человека иПСК или НПС быть расширена, после перепрограммирования и нейронных шагов индукции соответственно,и криоконсервированных сократить время, необходимое для будущих экспериментов.
В наших экспериментах мы выразили ChR2 в корковых нейронов под synapsin1 промотора. Потому что этот промотор пан-нейронов, мы, вероятно, были photostimulating как ингибирующие и возбуждающие нейроны коры. Если цель будущих экспериментов является специально допросить либо тормозящее или возбуждающее схем, более конкретные промоутеры могут быть использованы. Кроме того, корковые нейроны могут быть получены из трансгенных (или вируса-вводили мышам), где выражение ChR2 специально целевой генетически определенных субпопуляций нейронов. Например, сбор урожая коры ткани из мыши, которая имеет Cre рекомбиназу выражается в парвальбумин содержащих интернейронов (PV интернейроны), которые пересекают мыши с floxed ChR2 даст ситуация, когда только нейроны коры, выражающие ChR2 будет PV интернейроны 15. Использование такого ChR2 экспрессирующих интернейронов в наших CO-CuСистема lture позволит определить, является ли пропатчена IPSC, полученных нейрон в состоянии включить в цепь с PV интернейронов.
Основываясь на предыдущем исследовании 9, нейроны коры созревают с перекрытием дендритов после 14 дней в пробирке. Таким образом, если фотостимуляция не вызвать реакцию с обновленного IPSC-производных нейрона, то следует указать, что нейрон не имеют возможность сделать синаптические связи с корковых нейронов. IPSC, полученных нейрон способен принимать синаптическую вход, либо с других IPSC, полученных из нейронов или нейронов коры. Если были использованы традиционные патч зажим записи, это не было бы возможно определить, где синаптической вход и откуда. Преимущество нашей системы в том, что постсинаптические ответы корковой пресинаптического входа можно выборочно вызвала и идентифицированы. Процедуры, описанные здесь обеспечить простой подход к оценке возможностей IPSC, полученных из нейронов интеграциив определенной нейронной сети.
Acknowledgments
Мы благодарим К. Дейссерот и С. Je для лентивирусных конструкций ChR2 и Synapsin1-tdTomato соответственно, С. Чай для обмена знаниями и протокол об образовании IPSC, Вайоминг Леонг технической поддержки, члены лаборатории Го для обмена реагентов и опыта. Эта работа была поддержана Abbott Nutrition и Академического центра передового опыта (ACE) Исследования награду от компании GlaxoSmithKline (GSK) в ELG, Национальным Research Foundation Сингапур под его Конкурсная программа исследований (NRF 2008 NRF-CRP 002-082), чтобы ELG и GJA и Всемирным институтом класса (ИЗВ) Программы Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемой Министерством образования, науки и технологий Кореи (МЭПВ) (NRF Грант Количество: WCI 2009-003), чтобы GJA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurocult Proliferation Kit (Mouse) | STEMCELL Technologies | 5702 | Contains NSC Basal Medium and NSC Proliferation Supplement |
| Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | |
| DMEM/F12 | Lonza | 12719F | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| MEM without glutamine | Invitrogen | 11090081 | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| GlutaMAX supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140122 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Human LIF | Invitrogen | PHC9484 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotech | 130103926 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | |
| Compound E | Merck Millipore | 565790 | |
| EGF | Merck Millipore | 324856 | |
| FGF2 | R&D Systems | 233FB025 | |
| Research Grade FBS | Thermo Scientific | SV30160.03 | For astrocyte differentiation medium |
| Defined FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | For primary neuron medium |
| PBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | For primary neuron medium |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Heparin | EMD Millipore | 375095 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175095 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dispase II | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | For harvesting brains |
| EBSS | Invitrogen | 14155063 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 70 µm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 20 µm filter unit | Sartorius Stedim | 16534K | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4 | Fluka | 71505 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| D(+)-Glucose | Sigma | G7520 | For electrophysiological studies |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| KOH | KANTO Chemical | 3234400 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | For electrophysiological studies |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma | A7699 | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| Borosilicate glass capillaries | World precision instruments, Inc | 1604323 | |
| 15 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352070 | |
| 24-well plates | Corning | 9761146 | |
| 6-well plates | Corning | 720083 | |
| T25 flasks | Corning | 430641 | |
| 12 mm cover glasses | Marienfeld-Superior | 111520 | |
| AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit | Lonza | VPG1003 | For electroporation of primary cortical neurons |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | For electroporation of human fibroblasts |
| Mini Analysis | Synaptosoft | Mini Analysis v.6 | For measurement of PSCs |
| Normal Dermal Human Fibroblasts | PromoCell | C12300 | |
| pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE | Addgene | 20945 | |
| Mercury short-arc lamp | OSRAM | HBO 103 W/2 |
References
- Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Stroh, A., et al. Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation. Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).
- Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -C. Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).
- Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).
- Braun, H., Günther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).
- Shivaraj, M. C., et al. Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain. PLoS ONE. 7, e42935 (2012).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).
- Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
- Marchetto, M. C. N., et al. A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, 160 (2013).
