Abstract
Почек обычно функционирует для поддержания гемодинамического гомеостаза и является основным местом повреждения, вызванного наркотиками токсичности. нефротоксичность Медикаментозная оценивается вклад в 19- 25% всех клинических случаев острого повреждения почек (AKI) больных в критическом состоянии. Обнаружение AKI исторически опиралась на такие показатели, как креатинин сыворотки (СКЛ) или азота мочевины крови (АМК), которые явно недостаточно в полной оценки нефротоксичности в ранней стадии почечной дисфункции. В настоящее время не существует надежный диагностический метод для точного обнаружения гемодинамические изменения в ранней фазе AKI в то время как такие изменения могли бы фактически предшествовать повышение сывороточных уровней биомаркеров. Такое раннее обнаружение может помочь врачам поставить точный диагноз и помочь в принятии решений на терапевтической стратегии. Крыс обрабатывали цисплатин, чтобы побудить AKI. Нефротоксины оценивали в течение шести дней с использованием высокочастотного сонография, измерение Scr и на гистопатологиипочек. Гемодинамические оценки с использованием 2D и Color-доплеровские изображения были использованы для изучения последовательно нефротоксичности у крыс, с помощью сонографии. Наши данные показали успешные медикаментозного травмы почек у взрослых крыс при гистологическом исследовании. Цвет-доплеровский на основе сонографическое оценка AKI показал, что резистивный индекс (RI) и пульсирующим-индекс (PI) были увеличены в группе лечения; и скорость пика систолического (мм / с), конечный диастолический скорость (мм / с) и скорость времени интеграл (ВТИ, мм) уменьшались в почечные артерии в той же самой группе. Важно отметить, что эти гемодинамические изменения оценивали сонографией предшествовал подъем уровней Scr. Индексы Сонография основе, такие как RI или PI таким образом, может быть полезным прогностические маркеры снижения функции почек у грызунов. Из наших сонография на основе наблюдений в почках крыс, перенесших AKI, мы показали, что эти неинвазивные гемодинамические измерения могут рассматривать как точный, чувствительный и надежный метод в выявлении ранней стадии дисфункции почек. Tего исследование также подчеркивает важность этических проблем, связанных с использованием животных в научных исследованиях.
Introduction
Креатинин сыворотки (СКЛ) было золотым стандартом метрики для оценки функции почек в течение более двух десятилетий. В последнее время многие исследования показали , что повреждение почек происходит гораздо раньше , чем изменения в Scr 1. Тем не менее, не существует надежных методов для выявления гемодинамических изменений, которые происходят на ранних стадиях почечной травмы, включая нефротоксичность медикаментозный.
Медикаментозная острая почечная гемодинамика дисфункция приводит к повреждению почечной ткани и дальнейшего прогрессирования почечной недостаточности 2,3. За последние пару десятилетий, исследования указывают на то, что инструменты визуализации , такие как компьютерная томография (CAT), функциональная магнитно - резонансная томография (МРТ) и эхографии играют определенную роль в оценке гемодинамической 4. В современных средств визуализации, серой шкалы сонография в сочетании с методами Color-доплеровских, наиболее часто используемые для установления и оценки анатомического состояния почек 3,5,6. Sullivan и др. и др. , и Bonniп и др. и др. недавно сообщили , что сонография является эффективным, мощным и неинвазивным инструментом изменения гемодинамических анализа в моделях животных вазоконстрикции и гипоксия напряжений 7,8. Этот метод также широко используется для выявления стеноза артерии 9,10.
Последние технические достижения в области ультразвукового изображения с высокой разрешающей способностью позволили исследователям решать сердечно - сосудистая токсичность с использованием высокой частоты (25-80 МГц) и высоким разрешением (<разрешением 0,03 мм) зонды, в естественных условиях 11. Мы предполагаем, что с помощью этого высокого разрешения сонография для изучения почек обеспечит беспрецедентные возможности для неинвазивной и чувствительный метод раннего выявления нефротоксичности.
Цисплатин используется для лечения яичек, яичников, мочевого пузыря, головы, легких и шеи рака в сочетании с другими препаратами 12-14. Цисплатин был хорошо документированы нефротоксичности вследствие клеточного некроза рroximal канальцы (PT) и собирательных трубочек привело к увеличению числа азота мочевины крови (АМК) и ИКВ 15. При этом мы обеспечиваем детальный шаг за шагом методологии с использованием неинвазивной почек сонография для характеристики дисфункции почек с использованием модели крыс препаратов (цисплатин) индуцированный нефротоксичность.
Protocol
Выполните все процедуры у самцов крыс Sprague Dawley, приобретенные у Charles River Laboratories в соответствии с американской ветеринарной медицинской ассоциации (АВМА) руководящих принципов и с использованием утвержденных институциональной уходу и использованию животных комитета (IACUC) протоколы.
1. Подготовка животных и хирургических процедур
- Акклиматизироваться всех животных, за одну неделю до любой экспериментальной процедуры.
- Обезболить животное с помощью изофлуран (2-3% для индукции, и 1,0% для поддержания) и применять глазную мазь для обоих глаз, чтобы предотвратить высыхание, раздражение или изъязвление.
- Удалить волосы с груди животного, используя # 40 лезвие и депиляции крем по мере необходимости. Это, возможно, придется удалить волосы форму спины животного, если мы не можем иметь хорошие данные изображения, полученные из брюшной стороне изображения.
2. Нефротоксины Крыса Модель
- Для цисплатин-индуцированной модели нефротоксичности, управлять цисплатин, используя протокол оы было описано ранее. 15
- Выполните сонография в исходном состоянии, 24 ч до введения цисплатина (день 0). (См шаг 3, обработки изображений Protocol)
- Перемешайте крыс (n = 6) на две группы. На 1-й день, введение цисплатин (10 мг / мл) (10 мг / кг массы тела, разовая доза нефротоксичность индукция), вводимый объем (1 мл / кг массы тела), который рассчитывается по массе тела животного), внутрибрюшинно в исследуемой группе вводили физиологический раствор ( NS), в контрольной группе.
- Обезболить животное как на стадии 1.2 в 24, 48, 72, 96, 120, 144 ч после введения цисплатина.
- Возьмите изображение, используя высокую ультразвуковую систему разрешения (см Материалы и оборудование Стол) под устойчивой стадии анестезии животных. Продолжайте следить за основной физиологической функции животного в процессе формирования изображения от анестезии индукции путем полного выздоровления.
- Монитор жизненно важных признаков животного во время процедуры формирования изображения: крысиный температура: 35.9-37.5, частота дыхания: 66-144 об / мин, частота сердечных сокращений: 250-600 об / мин.Оптимальная жизненно важных функций чтения в предлагаемой нами исследования: температура: 36.5-37.0, частота дыхания: 80-100 об / мин, частота сердечных сокращений: 450-550 об / мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте Внутривенное вливание жидкости и нагревательную лампу для поддержания нормального физиологического состояния животного, чтобы минимизировать последствия хирургического вмешательства и анестезии. Assist дыхание с механической вентиляции легких во время процедуры, если это необходимо. Тем не менее, механической вентиляции редко требуется в этом эксперименте.
3. Протокол обработки изображений
Примечание: поставщик ультразвуковой аппарат обеспечивает нагретую платформу для долгосрочной процедуры визуализации. Тем не менее, мы не используем нагретую платформу в нашем эксперименте продемонстрировали, поскольку она занимает всего от 5 до 15 мин. Его контролировали температуру тела, которая контролируется с помощью ректального термометра, подключенного к переключателю управления физиологией.
- Поперечная изображение почек (режим B):
- Использование MS 250 ультразвук с центральной частотой 21 МГц подключитье изд к активному-порту, установить предварительную настройку приложения для "General Imaging".
- С животного лежа на спине на платформе, установите 21 МГц ультразвуковой зонд, используя железнодорожную систему, среднюю линию на животных и изолировать аорту. В этом положении угол зонда составляет 90 градусов к левой парастернальной линии (поперечная ось) (рис 1A, B).
- С этой позиции передвиньте платформу с животным таким образом, что зонд находится в настоящее время на уровне почечной артерии (влево или вправо, может изображение по одному за раз).
- Используя микроманипуляторами, вид правой или левой почечной артерии.
- Регулировка угла датчика слегка наклонив вдоль оси у зонда, чтобы получить полное представление почки в центре экрана.
- Как только правильные ориентиры (почечную лоханку, почечной артерии) обозначаются , как показано на рисунке 1C и D, киношной сохранить изображение , используя самую высокую частоту кадров позволила с зондом используется.
- Поперечная изображение (зрения цветового доплеровского) Почки:
- С помощью клавиши Color-доплеровский на клавиатуре, включите цветного допплеровского акустического окна. Это помогает изолировать почечной артерии и почечной вены (рис 1D). (Синий цвет указывает артериального потока, а красный цвет указывает на венозный поток).
- Убедитесь в том, что глубина фокусировки (обозначено желтым и стрелолист на оси Y) лежит в центре почки. Запишите данные с киношной магазин.
- Убедитесь, что запись данных на максимально возможной частоте кадров возможно (> 200 кадров / сек).
- Поперечная изображение почек (импульсно-волна или вид PW):
- Нажмите на ключ PW, в то время как в режиме цветового допплеровского, чтобы вывести желтую линию индикатора (импульсно-волновой доплеровский объем образца) на экране (Рисунок 1F).
- Поместите желтую линию в почечной артерии, под углом, который параллелен Направленность потока через сосуд с использованием ключа угла PW.
- В этом режиме аккустика окно разбивается на верхнюю и нижнюю секции.
- Используйте Cine магазин, чтобы захватить изображение волновых форм, которые указывают скорость течения артериальной при пиковой систолы и диастолы.
4. Животное Обработка После обработки изображений
- С первого дня от 0 до 5-й день, поместить животное в чистую зону восстановления (с чистым бумажным полотенцем на постельных принадлежностей) в положении грудины лежачее после визуализации. Обратите внимание, что мы обрабатываем всех животных с особой осторожностью с помощью метода «Хвост Холдинг» для агрессивных животных, таких как животных оправиться от наркоза.
- Во время анестезиологического восстановления, поддержания температуры тела животного с внешним АЭМисточник т и жизненно важных функций Монитор животного с электрофизиологических зондов, пока животное полностью не оправится от анестезии.
- Возвращение выздоровел животных к объекту жилищного помещения, когда они являются аварийными и активными.
- Эвтаназии всех крыс в соответствии с ведомственным руководящим принципам на 6-й день и урожай почек (см шаг 4.7) для гистологической оценки, а также шага 4.5.
- Собрать мочу животного из тюбиков сбора прикрепленных в метаболической клетке для испытания креатинина для проверки функции почек.
- Выполните парафиновую часть животных почки, и проводят HE (гематоксилином и эозином) окрашивания для проверки нефротоксичность (см шаг 4.7 для деталей).
- Жертвоприношение животных и обескровить с 0,9% раствором NaCl, а затем 10% забуференном фиксации формалином через левый желудочек. После обескровливания с 0,9% раствором NaCl, удалить почки крысы для гистологической оценки 16.
- Парафин встраивать секции 6-мм для наблюдения morphol почеклогии и нефротоксичность. Высушить ткани почки в 30% сахарозы в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 48 ч при температуре 4 ° С. Затем закрепите секции в 10% забуференном формалине в течение 24-48 ч при 4 ° С.
- Далее, встраивать почечной ткани в парафин, а не хранить ткани парафиновые блоки при комнатной температуре до тех пор, секционирования. Далее раздел блоки ткани с использованием машинной секции парафина и поместить секции на предметное стекло с покрытием.
- Deparrafinize раздел и регидратации и окрашивали гематоксилином в течение 10 мин с последующим эозином в течение 3 мин. Установите секции на слайде и их оценивали грызуна патологоанатомом.
5. Расчет и анализ данных
- Подсчитайте почечные артерии пиковые скорости из изображений цветного допплеровского, полученного на стадии 3.2. Выбор скорости временного интеграла (VTI) инструмент для отслеживания пиков систолического и диастолического скорости.
- Вычислить резистивный индекс (RI) и индекс Ударные (PI) с использованием equatioнс ниже.
RI = (пиковая систолическая скорость конец диастолическое скорость) / пиковая систолическая скорость
PI = (пиковая систолическая скорость конец диастолическое скорость) / средняя скорость. - Провести статистический анализ результатов RI и PI со стандартными отклонениями от среднего значения трех измерений цикла. Для других стандартных параметров, пожалуйста, обратитесь к руководству производителя для выполнения анализа данных с использованием проприетарного программного обеспечения (см Материалы и оборудование Стол).
Representative Results
Изображения, представленные в данном исследовании, были взяты одним оператором. Все изображения были собраны с использованием высокой частоты ультразвуковой машины (см Материалы и оборудование Стол). Все данные изображения анализировали с помощью одного исследователя. Результаты показали , что цисплатин-обработанных животных имели Scr в пределах от 0,5 до 2,1 (нормальный диапазон <1.1) в день 6 (фиг.2А). Тем не менее, гистологические исследования показали закономерности развития острого канальцев интерстициальных травм по сравнению с нормальными, получавшими физиологический раствор животных.
С помощью ультразвукового изображения с высоким разрешением для измерения гемодинамических изменений почек, данные показали, что не было никакого изменения морфологии животных, обработанных NS между днем 0 и день 6, в то время как pulsus Парвус морфология была обнаружена у животных на шестой день после лечения Cisplain. Верхний предел нормального RI и PI являются 0,7 и 1,15, соответственно, у крыс 17. Используя приведенные выше показатели для оценки гемодинамических изменения почек, которые показали, что существует значительное увеличение RI и PI в цисплатин-обработанных животных на 6-й день.
Рисунок 1. Настройки Ультразвуковое устройство для определения изображения почек у крыс. Графические иллюстрации системы формирования изображения с настройкой животной стадии (A) и положение изображения зонда (B) во время работы почек крыс сонографического визуализации. Образцы эхографические изображения, полученные из почек крыс с помощью высокочастотных ультразвуковых систем с высокой разрешающей способностью (см Материал andand оборудование Стол). (CF). Данные показывают ясно почек анатомическую структуру и кровоток в почечных сосудов с достаточной информацией для дальнейшего измерения гемодинамических параметров и анализа.09fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Гистология и почки эхографические изображения крыс при лечении цисплатин. Креатинин сыворотки (СКЛ) и гистологическое исследование представляет нормальную ткань почек у крыс , обработанной носителем и тяжелой травмы проксимального трубчатая почки (желтая стрелка) в цисплатин обработанных крыс (А, В). Scr незначительно увеличилась после лечения цисплатин, но оставался в пределах нормального диапазона (<1,1). Сонографические изображения правой почки крыс в цвете-доплеровской режиме в день 0, 3 и 6 на транспортном средстве и цисплатин обработанных крыс (С); гемодинамические параметры, RI и PI, были значительными увеличены, оценивали по цветовой допплерографии (D, E). Верхний предел нормального RI составляет 0,7 и 1,15 для PI. Важно отметить, что тон выше данные показывают эти гемодинамические изменения предшествовало повышение Scr. Измерение скорости пульсовой волны показывают медленный и слабый пульс (pulsus Парвус знак, желтый круг) после лечения цисплатин, которые коррелируют с результатами гистологии исследования. Это явление указывает на стеноз почечной артерии, закупорку и дальнейшей почечной дисфункции. Гистологические данные показали успешное проксимальных канальцев повреждение почек медикаментозного и сонографическое оценка показала существенные изменения в RI, PI и скорости пульсовой волны с использованием технологии Color-Доплера. N = 3, *, р <0,05. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1. Почечная гемодинамические параметры для наркотиков индуцированных AKI
Discussion
В последнее десятилетие многие достижения произошли в ультразвуковом технологии, включая разработку высокочастотных механических зондов, которые предлагают Сонографические данные с высоким качеством, чувствительности и точности. Эти зонды могут обеспечить приблизительно 50 мкм осевое разрешение на глубине проникновения от 5 до 12 мм и высокой частоты кадров (более 200 кадров / сек), таким образом , он может служить в качестве надежного инструмента для изучения мелких животных , таких как крысы и мыши 18, 19. Кроме того, она также позволяет собирать Сонографические изображения на слегка седативных или сознательных животных с жизненно важных показателей при физиологических уровнях. Кроме того, эта неинвазивная модальность также предоставляет возможность осуществлять продольную оценку структурных и функциональных изменений в процессе прогрессирования заболевания без ущерба для животных 19.
В 1959 г. Д-ра. Rusell и кисть впервые описал три "R" правила (замена, восстановление, и уточнение), чтобы поднять Awareness этических проблем использования животных в научных исследованиях. Предлагаемый протокол показывает, в первый раз, что неинвазивный маленькое животное сонография может использует минимальное количество животных под наименьшей боли, страдания или бедствия в исследовании Nephorotoxicity. Таким образом, он является потенциальным эффективным средством для удовлетворения трех "R" правила для экспериментальных животных.
Многие эхографические исследования были сосредоточены в сердечных приложениях; Оценки функции почек часто получены из измерений сердечного состояния , а не непосредственного исследования почек 20-25. Мы создали методологию формирования изображения для визуализации анатомических и функциональных изменений в почках в режиме реального времени. Мы использовали предварительно выбранный набор дополнительных акустических окон, полутоновое Mode / B и цветовой допплерографии, специфические для вида почек. Мы использовали RI и индексы PI для оценки взаимосвязи между этими показателями и изменениями почечной функции в модели Цисплатин индуцированной токсичности.
Новизна в выявлении нефротоксичность медикаментозного использованием предложенной методики Сонографические и произведенную протокол является раннее обнаружение надежной гемодинамических изменений в случае травмы почек. Эти результаты указывают на то, что внутри почечных сосудов гемодинамические изменения фактически предшествуют восходящую Scr. Эти данные сравнивались с обычного золотого стандарта с использованием гистологического анализа и продемонстрировать, что маленькое животное сонография является неинвазивным, чувствительным и воспроизводимым модальность, которая имеет минимальное требование использования животных. Таким образом, является эффективным инструментом для раннего обнаружения наркотиков индуцированных нефротоксичность с использованием модели крысы.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Depilatory cream | Miltex, Inc. | Surgi-Prep | Apply 24 hours prior to imaging |
| cis-Diamineplatinum(II) dichloride | Sigma | 479306 | To induce acute kidney injury at small animals. |
| Isoflurane | Baxter International Inc. | NDC 10019-773-40 | 2-3% for induction, and 1-1.5 % for maintenance; heart beats will be maintained at above 500 beats per minute |
| High Frequency Ultrasound | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | Vevo 2100 | |
| High-frequency Mechanical Transducer | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | MS250, MS550D, MS400 |
References
- Bonventre, J. V. Diagnosis of acute kidney injury: from classic parameters to new biomarkers. Contrib Nephrol. 156, 213-219 (2007).
- Lerman, L. O., Textor, S. C., Grande, J. P. Mechanisms of tissue injury in renal artery stenosis: ischemia and beyond. Progress in cardiovascular diseases. 52 (3), 196-203 (2009).
- Karas, M. G., Kizer, J. R. Echocardiographic assessment of the right ventricle and associated hemodynamics. Progress in cardiovascular diseases. 55 (2), 144-160 (2012).
- Milman, Z., et al. Hemodynamic response magnetic resonance imaging: application for renal hemodynamic characterization. Nephrol Dial Transplant. 28, 1150-1156 (2013).
- Anavekar, N. S., et al. Usefulness of right ventricular fractional area change to predict death, heart failure, and stroke following myocardial infarction (from the VALIANT ECHO Study). Am J Cardiol. 101 (5), 607-612 (2008).
- Lindqvist, P., Calcutteea, A., Henein, M. Echocardiography in the assessment of right heart function. Eur J Echocardiogr. 9 (2), 225-234 (2008).
- Sullivan, J. C., et al. Novel use of ultrasound to examine regional blood flow in the mouse kidney. American journal of physiology. Renal physiology. 297, F228-F235 (2009).
- Bonnin, P., Sabaa, N., Flamant, M., Debbabi, H., Tharaux, P. L. Ultrasound imaging of renal vaso-occlusive events in transgenic sickle mice exposed to hypoxic stress. Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1076-1084 (2008).
- Desberg, A. L., et al. Renal artery stenosis: evaluation with color Doppler flow imaging. Radiology. 177 (3), 749-753 (1990).
- Ciccone, M. M., et al. The clinical role of contrast-enhanced ultrasound in the evaluation of renal artery stenosis and diagnostic superiority as compared to traditional echo-color-Doppler flow imaging. International angiology : a journal of the International Union of Angiology. 30 (2), 135-139 (2011).
- Bauer, M., et al. Echocardiographic speckle-tracking based strain imaging for rapid cardiovascular phenotyping in mice. Circ Res. 108 (8), 908-916 (2011).
- Boulikas, T., Vougiouka, M. Recent clinical trials using cisplatin, carboplatin and their combination chemotherapy drugs (review). Oncology reports. 11 (3), 559-595 (2004).
- Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. Biomarkers of acute kidney injury. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 48, 463-493 (2008).
- Hye Khan, M. A., Abdul Sattar, M., Abdullah, N. A., Johns, E. J. Cisplatin-induced nephrotoxicity causes altered renal hemodynamics in Wistar Kyoto and spontaneously hypertensive rats: role of augmented renal alpha-adrenergic responsiveness. Exp Toxicol Pathol. 59, 253-260 (2007).
- Vaidya, V. S., Bonventre, J. V. Mechanistic biomarkers for cytotoxic acute kidney injury. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2 (5), 697-713 (2006).
- Lu, T. S., Chen, H. W., Huang, M. H., Wang, S. J., Yang, R. C. Heat shock treatment protects osmotic stress-induced dysfunction of the blood-brain barrier through preservation of tight junction proteins. Cell stress, & chaperones. 9 (4), 369-377 (2004).
- Kaya, M. Hemodynamics - New Diagnostic and Therapeutic Approaches. , InTech. 1-30 (2012).
- Bjornerheim, R., Grogaard, H. K., Kjekshus, H., Attramadal, H., Smiseth, O. A. High frame rate Doppler echocardiography in the rat: an evaluation of the method. European journal of echocardiography : the journal of the Working Group on Echocardiography of the European Society of Cardiology. 2 (2), 78-87 (2001).
- Zhang, L., et al. A high-frequency, high frame rate duplex ultrasound linear array imaging system for small animal imaging. IEEE transactions on ultrasonics, ferroelectrics, and frequency. 57, 1548-1557 (2010).
- Frea, S., et al. Echocardiographic evaluation of right ventricular stroke work index in advanced heart failure: a new index? J Card Fail. 18 (12), 886-893 (2012).
- Marwick, T. H., Raman, S. V., Carrio, I., Bax, J. J. Recent developments in heart failure imaging. JACC Cardiovasc Imaging. 3 (4), 429-439 (2010).
- Pokreisz, P. Pressure overload-induced right ventricular dysfunction and remodelling in experimental pulmonary hypertension: the right heart revisited. Eur Heart J supplements. 9 (Supplement H), H75-H84 (2007).
- Senechal, M., et al. A simple Doppler echocardiography method to evaluate pulmonary capillary wedge pressure in patients with atrial fibrillation. Echocardiography. 25 (1), 57-63 (2008).
- Souders, C. A., Borg, T. K., Banerjee, I., Baudino, T. A. Pressure overload induces early morphological changes in the heart. Am J Pathol. 181 (4), 1226-1235 (2012).
- Tanaka, N., et al. Transthoracic echocardiography in models of cardiac disease in the mouse. Circulation. 94 (5), 1109-1117 (1996).
