Abstract
Nyrerne fungerer normalt at opretholde hæmodynamisk homeostase og er en stor stedet for skader forårsaget af lægemiddeltoksicitet. Drug-induceret nefrotoksicitet skønnes at bidrage til 19- 25% af alle kliniske tilfælde af akut nyreskade (AKI) i kritisk syge patienter. AKI afsløring har historisk påberåbt parametre såsom serumkreatinin (SCR) eller blod urea nitrogen (BUN), som er påviseligt utilstrækkelige i fuldstændig vurdering af nefrotoksicitet i den tidlige fase af renal dysfunktion. I øjeblikket er der ingen robust diagnostisk metode til nøjagtigt at detektere hæmodynamisk ændring i den tidlige fase af AKI mens sådanne ændringer faktisk kunne gå forud stigningen i serum biomarkør niveauer. En sådan tidlig påvisning kan hjælpe klinikere stille en præcis diagnose og hjælp i i beslutningsprocessen til terapeutisk strategi. Rotter blev behandlet med cisplatin at inducere AKI. Nefrotoksicitet blev vurderet i seks dage ved hjælp af høj-frekvens sonografi, scr måling og ved histopatologi afnyre. Hæmodynamisk evaluering ved hjælp af 2D og Farve-Doppler billeder blev anvendt til serielt studere nefrotoksicitet hos rotter, under anvendelse af sonografi. Vores data viste vellykket narkotika-induceret nyreskade hos voksne rotter ved histologisk undersøgelse. Farve-Doppler baseret sonografisk vurdering af AKI indikerede, at resistive-indeks (RI) og pulsatile-indeks (PI) blev forhøjet i behandlingsgruppen; og peak-systolisk hastighed (mm / s), ultimo diastoliske hastighed (mm / s) og hastighed-(VTI, mm) blev nedsat i renale arterier i samme gruppe. Vigtigt er det, disse hæmodynamiske ændringer vurderet af sonografi forud for fremkomsten af SCR-niveauer. Sonography-baserede indeks såsom RI eller PI kan således være nyttige prædiktive markører for faldende nyrefunktion hos gnavere. Fra vores Sonography-baserede observationer i nyrerne af rotter, der undergik AKI, viste vi, at disse invasive hæmodynamiske målinger kan overveje som en præcis, følsom og robust metode til at opdage tidlige fase nyre dysfunktion. Thans undersøgelse understreger også betydningen af etiske spørgsmål i forbindelse med brug af dyr i forskning.
Introduction
Serumkreatinin (SCR) har været den gyldne standard parameter for at bedømme nyrefunktionen i mere end to årtier. For nylig har mange undersøgelser rapporteret, at nyreskade opstår meget tidligere end ændringerne i Scr 1. Der er imidlertid ingen robuste metoder til påvisning af hæmodynamiske forandringer, der sker tidligt i forløbet af nyreskade herunder lægemiddelinduceret nephrotoksicitet.
Drug-induceret akut renal hæmodynamisk dysfunktion fører til nedsat vævsskade og yderligere progression til nyresvigt 2,3. I de seneste par årtier, undersøgelser viser, at billeddiagnostiske værktøjer såsom computertomografi (CAT), Funktionel magnetisk resonans (fMRI) og sonografi spille en rolle i hæmodynamisk vurdering 4. I den nuværende imaging værktøjer, grå skala sonografi kombineret med Color-Doppler teknikker, er de mest almindeligt anvendte til at etablere og vurdere anatomiske status nyre 3,5,6. Sullivan et. al. og Bonnin et. al. nylig rapporteret, at sonografi er en effektiv, kraftfuld og ikke-invasiv værktøj i analyse hæmodynamiske ændringer i vasokonstriktion og hypoxi stress dyremodeller 7,8. Denne teknik er også almindeligt anvendt til at detektere arteriel stenose 9,10.
Seneste tekniske fremskridt inden for høj opløsning ultralydsscanning har tilladt efterforskere til at løse kardiovaskulær toksicitet ved hjælp af høj-frekvens (25-80 MHz) og høj opløsning (<0,03 mm opløsning) sonder, in vivo 11. Vi hypotesen, at ved hjælp af denne høj opløsning sonografi at studere nyre vil give en enestående mulighed for en ikke-invasiv og følsom metode til tidlig opdagelse af nefrotoksicitet.
Cisplatin anvendes til behandling af testikel, ovarie, blære, hoved, lunger, og halscancer i kombination med andre lægemidler 12-14. Cisplatin har havde veldokumenteret nefrotoksicitet grundet celle nekrose af proximal tubuli (PT) og indsamling kanaler resulterede i stigende blod urea nitrogen (BUN) og SCR 15. Heri giver vi en detaljeret trin-for-trin metode for at bruge ikke-invasiv renal sonografi at karakterisere nyre dysfunktion hjælp rotte model af Drug (Cisplatin) -induceret nefrotoksicitet.
Protocol
Udfør alle procedurer i Sprague Dawley købt fra Charles River Laboratories i overensstemmelse med American Veterinary Medical Association (AVMA) retningslinjer og anvendelse af godkendte Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) protokoller.
1. Animalske Forberedelse og kirurgiske procedurer
- Akklimatisere alle dyr til en uge før nogen eksperimentel procedure.
- Bedøver dyr under anvendelse isofluran (2-3% til at fremkalde, og 1,0% for at bevare) og anvende øjensalve til begge øjne til at forhindre udtørring, irritation eller ulceration.
- Fjerne hår fra dyrets bryst ved hjælp # 40 klinge og hårfjerningsmiddel som nødvendigt. Det kan have til at fjerne hår formularen dyrets tilbage, hvis vi ikke kan have gode billeddata data fra ventrale side billeddannelse.
2. Nefrotoksicitet Rat Model
- For Cisplatin-induceret nefrotoksicitet model, administrere cisplatin, ved anvendelse af protokol As beskrevet tidligere. 15
- Udfør sonografi ved baseline, 24 timer før cisplatin administration (dag 0). (Se trin 3, Imaging Protocol)
- Randomisere rotter (n = 6) i to grupper. Ved dag 1, administrere cisplatin (10 mg / ml) (10 mg / kg legemsvægt, enkeltdosis nefrotoksicitet induktion), injektionsvolumen (1 ml / kg legemsvægt) beregnet ved dyrets legemsvægt), intraperitonealt i studiegruppe og normalt saltvand ( NS) i kontrolgruppen.
- Bedøve dyr som trin 1.2 ved 24, 48, 72, 96, 120, 144 timer efter cisplatin administration.
- Tag billedet ved hjælp af høj opløsning ultralyd-system (se Materialer og udstyr Table) under stabil anæstesi etape af dyr. Fortsæt med at overvåge dyrets basale fysiologiske funktion under billeddannelse fra anæstesi induktion gennem fuld helbredelse.
- Overvåg dyrets vitale tegn under billeddiagnostiske procedurer: rotte-temperatur: 35,9-37,5, respirationsfrekvens: 66-144 / min, puls: 250-600 / min.Den optimale vitale tegn læsning i vores foreslåede undersøgelse er: temperatur: 36,5-37,0, respirationsfrekvens: 80-100 / min, puls: 450-550 / min.
BEMÆRK: infusion Brug intravenøs væske, og varmelampe til at opretholde dyrets normale fysiologiske tilstand for at minimere virkningerne af kirurgi og anæstesi. Assist respiration med mekanisk ventilator under proceduren om nødvendigt. Imidlertid er mekanisk ventilation sjældent nødvendigt i dette forsøg.
3. Imaging Protocol
Bemærk: ultralyd maskine udbyder giver den opvarmede platform for lang billeddannelse procedure. Men vi ikke bruge den opvarmede platform i vores demonstrerede eksperiment, fordi det tager kun 5 til 15 min. Dens kontrolleret for kropstemperatur, der overvåges med en rektal termometer forbundet til fysiologi kontrol skifte.
- Tværgående billede af Nyre (B-tilstand):
- Brug MS 250 ultralyd med center frekvens på 21 MHz forbindeed til den aktive-porten, skal du indstille den forudindstillede ansøgning til "General Imaging".
- Med dyret liggende på platformen, placere 21 MHz ultralyd sonde hjælp jernbanesystemet, midterlinjen på dyrs og isolere aorta. I denne stilling er sonden vinkel er 90 grader til venstre parasternal linie (tværgående akse) (figur 1A, B).
- Fra denne position skubbes platform med dyret således, at sonden er nu på niveau med den renale arterie (enten venstre eller højre, kan billede én ad gangen).
- Ved at bruge mikromanipulatorer, se enten højre eller venstre renale arterie.
- Juster sonden vinkel ved at vippe lidt langs y-aksen af sonden for at opnå en fuld nyre visning i midten af skærmen.
- Når de rigtige vartegn (nyrebækken, renal arterie) er identificeret som illustreret i figur 1C og D, Cine butik billedet ved hjælp af højeste frame-rate tilladt med den anvendte probe.
- Tværgående billede af Nyre (Farve-Doppler visning):
- Brug af Farve-Doppler-tasten på tastaturet, tænde Color Doppler akustisk vindue. Dette medvirker til at isolere nyrearterie og renal vene (figur 1D). (Blå farve indikerer arteriel flow og rød farve indikerer venøs strømning).
- Sikre, at fokus dybde (angivet med og gul pilespids på Y-aksen) ligger i centrum af nyren. Optag data med cine butik.
- Sørg rekord dataene på det højest mulige billedhastighed muligt (> 200 billeder / sek).
- Tværgående billede af Nyre (Pulserende-bølge eller PW visning):
- Klik på PW-tasten, mens i Farve-Doppler-tilstand, for at få en gul indikator linje (Pulserende-bølge Doppler prøvevolumen) på skærmen (figur 1F).
- Den gule linje i den renale arterie, i en vinkel, der paralleller retningen af strømningen gennem beholderen ved hjælp af PW vinkel tasten.
- I denne tilstand, den akustisk vindue deler op i øvre og nedre afsnit.
- Brug Cine butik for at optage billedet af de bølgeformer, der angiver hastigheden af arterielle flow på top systole og diastole.
4. Animal Håndtering Efter Imaging
- Fra dag 0 til dag 5, placere dyret i en ren opsving område (med rent papir håndklæde på strøelse) i brystleje position efter billeddannelse. Bemærk, at vi håndterer alle dyr med ekstrem omhu med "Tail Holding" metode til aggressive dyr såsom dyr komme fra anæstesi.
- Under bedøvelse opsving, holde dyrets kropstemperatur med en ekstern heat kilde og skærm dyrets vitale tegn med elektrofysiologiske sonder indtil dyr er kommet sig fuldstændigt fra anæstesi.
- Retur inddrives dyr til anlægget boliger værelse, når de er vågne og aktive.
- Afliv alle rotter ifølge institutionelle retningslinier på dag 6 og høst nyrer (se trin 4.7) til histologisk vurdering samt trin 4.5.
- Indsamle dyrets urin fra opsamlingsrør fastgjort i metaboliske bur til creatinin test for at kontrollere nyrefunktionen.
- Udfør paraffin sektion af animalsk nyre, og udføre HE (Hematoxylin og eosin) farvning at tjekke nefrotoksicitet (se trin 4.7 for detaljer).
- Sacrifice dyr og exsanguinate med 0,9% NaCl-opløsning, efterfulgt af 10% pufret formalin fiksering gennem venstre ventrikel. Efter afblødning med 0,9% NaCl-opløsning, fjerne rotte nyrerne til histologisk vurdering 16.
- Paraffin indlejre 6 mm sektioner for at observere nyre Morphollogi og nefrotoksicitet. Dehydrer nyrevæv i 30% saccharose i phosphatpufret saltvand (PBS) i 48 timer ved 4 * C. Så fix afsnittene i 10% bufferet formalin i 24-48 timer ved 4 ºC.
- Dernæst integrere nyrevævet i paraffin, og gemme væv paraffinblokke ved RT indtil sektionering. Yderligere sektion Vævsblokkene ved hjælp af en paraffin sektion maskine og placere afsnittene om en coated glasplade.
- Deparrafinize sektionen og rehydreret og farvet med Hematoxylin i 10 minutter efterfulgt af eosin i 3 minutter. Monter afsnittene på en rutsjebane og har dem vurderet af en gnaver patolog.
5. Data Beregning og analyse
- Beregn renal arteriel peak hastigheder fra Color Doppler billeder opnået fra trin 3.2. Vælg Velocity (VTI) værktøj til at spore toppene af systolisk og diastolisk hastighed.
- Beregn Modstandsindeks (RI) og Pulsatile Index (PI) ved hjælp af equations nedenfor.
RI = (peak systolisk hastighed-end diastolisk hastighed) / maksimal systolisk hastighed
PI = (maksimal systolisk hastighed-end diastolisk hastighed) / betyder hastighed. - Statistisk analyse af RI og PI resultater med standardafvigelser fra gennemsnittet af tre cyklus målinger. For andre standard parametre, henvises til manualerne fra producenten til at udføre dataanalyse ved hjælp proprietær software (se Materialer og udstyr tabel).
Representative Results
Billederne præsenteres i denne undersøgelse blev taget af en enkelt operatør. Alle billeder blev indsamlet under anvendelse af en højfrekvent ultralyd maskine (se materialer og udstyr tabel). Alle billeddata blev analyseret ved en enkelt investigator. Resultaterne viste, at cisplatin-behandlede dyr havde SCR området fra 0,5 til 2,1 (normalområde <1,1) på dag 6 (figur 2A). Men de histologiske undersøgelser viste, konsistente mønstre af akut tubulus interstitielle skader, når sammenlignet med normale saltvandsbehandlede dyr.
Brug høj opløsning ultralydsscanning til at måle hæmodynamiske ændringer af nyre, viste data, at der ikke var nogen ændring i morfologi i dyr behandlet med NS mellem dag 0 og dag 6, mens pulsus Parvus morfologi blev påvist i dyr på dag seks efter Cisplain behandling. Den øvre grænse for normal RI og PI er 0,7 og 1,15, henholdsvis i rotter 17. Ved hjælp af ovenstående indeks til vurdering hæmodynamisk ændringer i nyren, som påviste, at der er betydelig stigning i RI og PI i cisplatin-behandlede dyr på dag 6.
Figur 1. Ultralyd apparater indstillinger til påvisning nyre billeder i rotter. Grafiske illustrationer af imaging system med indstillingen af animalsk etape (A) og billedbehandling sonde position (B) under driften af rotte nyre sonografisk billeddannelse. Eksempelbillederne sonografiske billeder fremstillet af rotte nyre ved hjælp af de højfrekvente, høj opløsning ultralyd systemer (se Materiale andand Equipment tabel). (CF). Dataene viser klart nyre anatomisk struktur og blodgennemstrømningen i de renale fartøjer med tilstrækkelige oplysninger til yderligere hæmodynamisk parameter måling og analyse.09fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Histologi og Nyre sonografiske billeder af rotter under Cisplatin behandling. Serum kreatinin (SCR) og histologi studie præsenterer normale nyrevæv i vehikelbehandlede rotter og svær proksimal tubulær nyreskade (gul pil) i Cisplatin behandlet rotte (A, B). SCR steget marginalt efter cisplatin behandling, men forblev inden for normalområdet (<1,1). Sonografisk billeder af højre nyre af rotter i Color-Doppler-tilstand på dag 0, 3 og 6 om køretøj og Cisplatin behandlede rotter (C); hæmodynamiske parametre, RI og PI, var signifikant forøget, vurderes efter farve-Doppler ultralyd (D, E). Den øvre grænse for normal RI er 0,7 og 1,15 for PI. Vigtigere, than Ovenstående data viser de hæmodynamiske ændringer forud for stigende SCR. Pulse bølge hastighed måling viser en langsom og svag puls (pulsus Parvus tegn, gul cirkel) efter cisplatin behandling, som korrelerer med histologi undersøgelsens resultater. Dette fænomen indikerer nyrearteriestenose, obstruktion og yderligere nyre dysfunktion. Histologiske data viste vellykket lægemiddelinduceret proksimal tubulær nyreskade og sonografisk vurdering viste væsentlige ændringer i RI, PI og Pulsbølgehastigheden hjælp Farve-Doppler-teknologi. N = 3, *, p <0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Nyrer hæmodynamiske parametre for Drug-induceret AKI
Discussion
I det seneste årti er mange fremskridt sket i sonografisk teknologi herunder udvikling af højfrekvente mekaniske prober, som tilbyder sonografiske data med høj kvalitet, følsomhed og nøjagtighed. Disse prober kan tilvejebringe ca. 50 um aksial opløsning ved en indtrængningsdybde på 5 til 12 mm og høj frame rates (større end 200 ramme / sek), hvorfor det kan anvendes som et solidt værktøj til at studere små dyr såsom rotter og mus 18, 19. Desuden giver det også at indsamle sonografiske billeder på let sederede eller bevidste dyr med vitale tegn på fysiologiske niveauer. Desuden er denne ikke-invasiv modalitet giver også mulighed for at udføre langsgående vurdering af strukturelle og funktionelle ændringer under sygdomsprogression uden at ofre dyr 19.
I 1959, Drs. Rusell og Brush først beskrev de tre "R" regler (Replacement, Reduction, og forfinelse) for at hæve awaeness af etiske spørgsmål i dyr brug i forskning. Den foreslåede protokol viser for første gang, at ikke-invasiv lille dyr sonografi kan benytter minimalt antal dyr under mindst smerte, lidelse eller angst i Nephorotoxicity undersøgelse. Derfor er det en potentiel effektiv modalitet til at opfylde de tre "R" regler for forsøgsdyr.
Mange sonografiske undersøgelser har fokuseret på hjerte-applikationer; nyrefunktionen vurderinger blev ofte stammer fra undersøgelser af hjertefunktionen status snarere end en direkte undersøgelse af nyre 20-25. Vi har etableret en billeddannende metode til at visualisere anatomiske og funktionelle ændringer i nyrerne i realtid. Vi brugte en forudvalgt sæt af komplementære akustiske vinduer, grå-skala / B-tilstand og Farve-Doppler, der er specifikke for nyre visning. Vi brugte RI og PI indeks til at vurdere forholdet mellem disse indeks og de ændringer af nyrefunktionen i Cisplatin induceret toksicitet model.
Det nye i forbindelse med afsløring lægemiddel-induceret nefrotoksicitet ved hjælp af den foreslåede sonografisk metode og afledte protokol er dens tidlige robust påvisning af hæmodynamiske ændringer i tilfælde af nyreskade. Resultaterne indikerer, at intra-vaskulære hæmodynamiske ændringer i virkeligheden forud for stigende Scr. Disse data er benchmarkes mod den konventionelle guldstandarden hjælp histologiske analyse og viser, at små dyr sonography er en noninvasiv, følsom og reproducerbar modalitet, som har minimal krav om anvendelsen af dyr. Det er således et effektivt værktøj til tidlig påvisning af narkotika nefrotoksicitet hjælp rottemodel.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Depilatory cream | Miltex, Inc. | Surgi-Prep | Apply 24 hours prior to imaging |
| cis-Diamineplatinum(II) dichloride | Sigma | 479306 | To induce acute kidney injury at small animals. |
| Isoflurane | Baxter International Inc. | NDC 10019-773-40 | 2-3% for induction, and 1-1.5 % for maintenance; heart beats will be maintained at above 500 beats per minute |
| High Frequency Ultrasound | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | Vevo 2100 | |
| High-frequency Mechanical Transducer | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | MS250, MS550D, MS400 |
References
- Bonventre, J. V. Diagnosis of acute kidney injury: from classic parameters to new biomarkers. Contrib Nephrol. 156, 213-219 (2007).
- Lerman, L. O., Textor, S. C., Grande, J. P. Mechanisms of tissue injury in renal artery stenosis: ischemia and beyond. Progress in cardiovascular diseases. 52 (3), 196-203 (2009).
- Karas, M. G., Kizer, J. R. Echocardiographic assessment of the right ventricle and associated hemodynamics. Progress in cardiovascular diseases. 55 (2), 144-160 (2012).
- Milman, Z., et al. Hemodynamic response magnetic resonance imaging: application for renal hemodynamic characterization. Nephrol Dial Transplant. 28, 1150-1156 (2013).
- Anavekar, N. S., et al. Usefulness of right ventricular fractional area change to predict death, heart failure, and stroke following myocardial infarction (from the VALIANT ECHO Study). Am J Cardiol. 101 (5), 607-612 (2008).
- Lindqvist, P., Calcutteea, A., Henein, M. Echocardiography in the assessment of right heart function. Eur J Echocardiogr. 9 (2), 225-234 (2008).
- Sullivan, J. C., et al. Novel use of ultrasound to examine regional blood flow in the mouse kidney. American journal of physiology. Renal physiology. 297, F228-F235 (2009).
- Bonnin, P., Sabaa, N., Flamant, M., Debbabi, H., Tharaux, P. L. Ultrasound imaging of renal vaso-occlusive events in transgenic sickle mice exposed to hypoxic stress. Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1076-1084 (2008).
- Desberg, A. L., et al. Renal artery stenosis: evaluation with color Doppler flow imaging. Radiology. 177 (3), 749-753 (1990).
- Ciccone, M. M., et al. The clinical role of contrast-enhanced ultrasound in the evaluation of renal artery stenosis and diagnostic superiority as compared to traditional echo-color-Doppler flow imaging. International angiology : a journal of the International Union of Angiology. 30 (2), 135-139 (2011).
- Bauer, M., et al. Echocardiographic speckle-tracking based strain imaging for rapid cardiovascular phenotyping in mice. Circ Res. 108 (8), 908-916 (2011).
- Boulikas, T., Vougiouka, M. Recent clinical trials using cisplatin, carboplatin and their combination chemotherapy drugs (review). Oncology reports. 11 (3), 559-595 (2004).
- Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. Biomarkers of acute kidney injury. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 48, 463-493 (2008).
- Hye Khan, M. A., Abdul Sattar, M., Abdullah, N. A., Johns, E. J. Cisplatin-induced nephrotoxicity causes altered renal hemodynamics in Wistar Kyoto and spontaneously hypertensive rats: role of augmented renal alpha-adrenergic responsiveness. Exp Toxicol Pathol. 59, 253-260 (2007).
- Vaidya, V. S., Bonventre, J. V. Mechanistic biomarkers for cytotoxic acute kidney injury. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2 (5), 697-713 (2006).
- Lu, T. S., Chen, H. W., Huang, M. H., Wang, S. J., Yang, R. C. Heat shock treatment protects osmotic stress-induced dysfunction of the blood-brain barrier through preservation of tight junction proteins. Cell stress, & chaperones. 9 (4), 369-377 (2004).
- Kaya, M. Hemodynamics - New Diagnostic and Therapeutic Approaches. , InTech. 1-30 (2012).
- Bjornerheim, R., Grogaard, H. K., Kjekshus, H., Attramadal, H., Smiseth, O. A. High frame rate Doppler echocardiography in the rat: an evaluation of the method. European journal of echocardiography : the journal of the Working Group on Echocardiography of the European Society of Cardiology. 2 (2), 78-87 (2001).
- Zhang, L., et al. A high-frequency, high frame rate duplex ultrasound linear array imaging system for small animal imaging. IEEE transactions on ultrasonics, ferroelectrics, and frequency. 57, 1548-1557 (2010).
- Frea, S., et al. Echocardiographic evaluation of right ventricular stroke work index in advanced heart failure: a new index? J Card Fail. 18 (12), 886-893 (2012).
- Marwick, T. H., Raman, S. V., Carrio, I., Bax, J. J. Recent developments in heart failure imaging. JACC Cardiovasc Imaging. 3 (4), 429-439 (2010).
- Pokreisz, P. Pressure overload-induced right ventricular dysfunction and remodelling in experimental pulmonary hypertension: the right heart revisited. Eur Heart J supplements. 9 (Supplement H), H75-H84 (2007).
- Senechal, M., et al. A simple Doppler echocardiography method to evaluate pulmonary capillary wedge pressure in patients with atrial fibrillation. Echocardiography. 25 (1), 57-63 (2008).
- Souders, C. A., Borg, T. K., Banerjee, I., Baudino, T. A. Pressure overload induces early morphological changes in the heart. Am J Pathol. 181 (4), 1226-1235 (2012).
- Tanaka, N., et al. Transthoracic echocardiography in models of cardiac disease in the mouse. Circulation. 94 (5), 1109-1117 (1996).
