Abstract
腎臓は通常、血行動態の恒常性を維持するために機能し、薬物毒性による損傷の主要な部位です。薬剤誘発性腎毒性は、重篤患者における急性腎障害（AKI）のすべての臨床例19〜25％に寄与すると推定されます。 AKIの検出は、歴史的に腎機能障害の初期段階における腎毒性の完全な評価で明らかに不十分であるような血清クレアチニン（SCR）または血中尿素窒素（BUN）などの指標に依存してきました。現在、そのような変更は、実際に血清バイオマーカーレベルの上昇に先行するかもしれないが、正確にAKIの初期段階で血行動態の変化を検出するための何の堅牢な診断方法はありません。このような早期発見は、臨床医が正確な診断を行い、治療戦略のための意思決定にで助けることができます。ラットは、AKIを誘導するためにシスプラチンで処理しました。腎毒性は、高周波超音波検査、SCRの測定を使用して、6日間との病理組織学的検査時に評価しました腎臓。 2Dとカラードップラー画像を使用して血行動態評価は超音波検査を用いて、連続したラットにおける腎毒性を研究するために使用しました。我々のデータは、組織学的検査によって成体ラットで成功した薬剤誘発性腎障害を示しました。 AKIのカラードップラー超音波検査ベースの評価は、抵抗性指数（RI）と拍動指数（PI）は治療群で増加したことが示されました。そして、ピーク収縮期速度（ミリメートル/秒）、拡張末期速度（ミリメートル/秒）と速度・時間積分（VTI、mm）を同じグループに腎動脈に減少しました。重要なことには、超音波検査により評価し、これらの血行動態の変化は、SCRレベルの上昇に先行しました。このようなRIやPIなどソノグラフィベースのインデックスは、このようにげっ歯類の減少、腎機能の有用な予測マーカーであることができます。 AKIを受けたラットの腎臓における当社の超音波検査ベースの観測から、我々はこれらの非侵襲的血行動態測定は早期の腎機能障害を検出する際に、正確な高感度かつ堅牢な方法として考えることができることを示しました。 T彼の研究は、研究における動物使用に関連する倫理的問題の重要性を強調しています。
Introduction
血清クレアチニン（SCR）は二十年以上のために腎機能を評価するためのゴールドスタンダードメトリックとなっています。最近、多くの研究は、腎傷害がはるかに早くSCR 1の変化よりも起こることを報告しています。しかし、初期の薬剤誘発性腎毒性を含む腎障害の過程で発生する血行動態変化の検出のための堅牢な方法はありません。
薬剤誘発性急性腎血行動態不全は腎組織の損傷および腎不全の2,3へのさらなる進行につながります。過去数十年では、研究では、コンピュータ断層撮影（CAT）、機能的磁気共鳴画像法（fMRI）や超音波検査などのイメージングツールは、血行動態の評価4における役割を果たしていることを示しています。現在のイメージングツール、カラードップラー技術と結合されたグレースケールの超音波検査では、最も一般的に腎臓3,5,6の解剖学的状態を確立し、評価するために使用されています。サリバンら。らとBonnin個ら。アル。最近、超音波検査は、血管収縮および低酸素ストレス動物モデル7,8における分析血行動態の変化で、効果的で強力かつ非侵襲的なツールであることを報告しました。この技術は、一般に動脈狭窄9,10を検出するために使用されます。
高解像度超音波イメージングの分野における最新の技術的進歩は、 インビボ 11 において 、研究者らは、高周波（25~80メガヘルツ）と高解像度（<0.03ミリメートルの分解能）プローブを使用して、心血管毒性に対処するために許可されています。私たちは、腎臓を研究するために、この高解像度の超音波検査を使用すると、腎毒性の早期発見のための非侵襲的かつ高感度な方法のための前例のない機会を提供すると仮定しました。
シスプラチンは、他の薬剤と組み合わせ12-14に精巣、卵巣、膀胱、頭部、肺、頸部癌を治療するために使用されます。シスプラチン起因Pの細胞の壊死によく文書腎毒性を持っていましたroximal細管（PT）および集合管は、血中尿素窒素（BUN）およびSCR 15の上昇をもたらしました。ここで、我々は腎毒性を誘発薬剤（シスプラチン）のラットモデルを使用して、腎機能障害を特徴づけるために、非侵襲性腎超音波検査を使用しての詳細なステップバイステップの方法論を提供します。
Protocol
アメリカ獣医師会（AVMA）のガイドラインおよび承認された施設内動物管理使用委員会（IACUC）プロトコルを使用してに従い、チャールズ・リバー・ラボラトリーズから購入した雄のSprague Dawleyラットのすべての手順を実行します。
1.動物の準備および外科的処置
- 任意の実験手順の前に1週間のすべての動物を順応させます。
- イソフルランを用いて動物を麻酔（2-3％が誘導する、および1.0％を維持するために）と乾燥、刺激や潰瘍を防ぐために、両眼に眼軟膏を適用します。
- ＃40ブレードと、必要に応じて脱毛クリームを使用して、動物の胸から髪を削除します。我々は腹側の撮影を行い、得られた良好な画像データを持つことができない場合は、動物の背中の形の髪を削除する必要があります。
2.腎毒性ラットモデル
- シスプラチン誘発腎毒性モデルでは、プロトコルAを使用して、シスプラチンを投与Sは、前述の図15に
- ベースライン、24時間シスプラチンの投与前（0日目）で超音波検査を行います。 （ステップ3を参照してください、イメージングプロトコル）
- ラットをランダム（n = 6）が2グループに。 1日目に、（腹腔内に試験群と生理食塩水で、シスプラチン、動物の体重により計算（10 mg / mlで）（10mg / kgの体重、単一用量の腎毒性誘導）、注入量（1ミリリットル/ Kg体重））を投与します対照群ではNS）。
- 24でステップ1.2、48、72、96、120、シスプラチン投与後144時間などの動物を麻酔。
- 動物の安定した麻酔段下（材料および装置表を参照してください）、高解像度の超音波システムを使用して画像を取ります。完全な回復を介して麻酔導入から撮像中に動物の基本的な生理機能を監視し続けます。
- ラット-温度：35.9から37.5、呼吸数：66から144 /分、心拍数：250から600 /分イメージング手順の間に動物のバイタルサインを監視します。提案研究で読んで最適なバイタルサインは、次のとおりです。温度：36.5から37.0、呼吸速度：80-100 /分、心拍数：450〜550 /分。
注：使用する静脈内輸液、加熱ランプは、手術や麻酔の影響を最小限に抑えるために、動物の正常な生理学的状態を維持します。必要に応じて、手順の間に人工呼吸器で呼吸を補助します。しかし、機械換気はほとんどこの実験では必要ありません。
3.イメージングプロトコル
注：超音波マシンプロバイダが長い撮像手順のために加熱されたプラットフォームを提供します。それだけで5〜15分かかりますのでしかし、我々は我々の実証実験で加熱されたプラットフォームを使用しないでください。その生理学制御スイッチに接続された直腸温度計で監視され、体温のために制御されます。
- 腎臓の横断画像（Bモード）：
- 21メガヘルツの中心周波数とMS 250超音波を使用して接続しますアクティブ・ポートへのedは、「一般的なイメージング」へのアプリケーションのプリセットを設定します。
- プラットフォーム上の動物仰臥位と、レールシステムを使用して、21 MHzの超音波プローブを配置し、動物上の正中線と大動脈を隔離します。この位置では、プローブの角度は、左胸骨傍線（横軸）に対して90度（ 図1A、B）です。
- この位置からプローブは、腎動脈のレベルに今あるように、動物とのプラットフォームをスライド（左または右のいずれかの時の画像1缶）。
- マイクロマニピュレーターを使用して、右または左腎動脈のいずれかを表示します。
- 画面中央の完全な腎臓ビューを取得するために、プローブのy軸に沿ってわずかに傾けることによって、プローブの角度を調整します。
- 図1CおよびD、シネストア用いたプローブで許可される最高フレームレートを使用して画像に示すように、適切なランドマーク（腎盂、腎動脈）が識別されると。
- 腎臓の横断画像（カラードップラービュー）：
- キーボード上のカラードップラーキーを使用して、カラードップラー音響窓をオンにします。これは、腎動脈と腎静脈（ 図1D）を単離するのに役立ちます。 （ブルー色は、動脈の流れを示し、赤色は、静脈の流れを示しています）。
- （Y軸上と黄色の矢印で示される）、焦点深度が腎臓の中心にあることを確認してください。シネストアとデータを記録します。
- 可能な限り最高の可能なフレームレートでの記録がデータ（> 200フレーム/秒）を確認してください。
- 腎臓の横断画像（パルス波またはPWビュー）：
- カラードップラーモードでは、画面（ 図1F）上の黄色のインジケータライン（パルス波ドプラサンプルボリューム）を起動する一方で、PW]キーをクリックします。
- PW角キーを使用して血管を通る流れの方向に平行な角度で、腎動脈内の黄色の線を配置します。
- このモードでは、アコースティックウィンドウは上部および下部のセクションに分割されます。
- ピーク収縮期および拡張期における動脈流の速度を示す波形の画像をキャプチャするためにシネ・ストアを使用します。
イメージングの後4.動物の取り扱い
- 0日目から5日目に、イメージング後に胸骨横臥位の位置に（寝具に清潔なペーパータオルで）きれいなリカバリ領域に動物を配置します。私たちは動物等の積極的な動物のための「テール・ホールディング」方法で細心の注意を払ってすべての動物を扱うことに注意してください麻酔から回復します。
- 麻酔リカバリ時に、外部ょんで動物の体温を保ちますトン源と動物が麻酔から完全に回復するまでの電気生理学的プローブを用いて、動物のバイタルサインを監視します。
- 彼らは、アラートとアクティブであるときに戻り、施設の収容室に動物を回復しました。
- 6日目、収穫腎臓に制度ガイドラインに従ってすべてのラットを安楽死させるステップ4.5と同様、組織学的評価のため（ステップ4.7を参照してください）。
- 腎機能をチェックするためにクレアチニン検査のために代謝ケージに取り付けられた採取管から動物の尿を収集します。
- 動物の腎臓のパラフィン切片を行い、かつ腎毒性を（詳細はステップ4.7を参照）をチェックする染色HE（ヘマトキシリンおよびエオシン）を行います。
- 動物を犠牲にし、左心室を介して10％緩衝ホルマリン固定、続いて0.9％NaCl溶液で放血。 0.9％NaCl溶液で放血した後、組織学的評価の16のために、ラットの腎臓を削除します。
- パラフィンは、腎臓のモルフォリンを観察するために6 mmのセクションを埋め込みます術や腎毒性。 4ºCで48時間、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の30％スクロース中の腎組織を脱水。そして、4ºCで24〜48時間、10％緩衝ホルマリン中でセクションを修正します。
- 次に、パラフィンに腎臓組織を埋め込み、切片化するまで室温で組織パラフィンブロックを格納します。さらに、セクション組織ブロックパラフィン切片機を使用し、コーティングされたガラススライド上にセクションを配置。
- セクションをDeparrafinizeし、再水和し、3分間エオシン続いて10分間ヘマトキシリンで染色しました。スライド上のセクションをマウントし、それらは、げっ歯類病理学者によって評価しました。
5.データの計算と分析
- ステップ3.2から得られたカラードプラ画像から腎動脈ピーク速度を計算します。収縮期および拡張期速度のピークを追跡する速度の時間積分（VTI）ツールを選択します。
- equatioを使用して計算抵抗指数（RI）と脈動指数（PI）以下のナノ秒。
RI =（ピーク収縮期速度、拡張末期速度）/ピーク収縮期速度
PI =（ピーク収縮期速度エンド拡張期速度）/速度を意味します。 - 3サイクルの測定値の平均からの標準偏差とRIとPI結果の統計解析を実行します。他の標準的なパラメータについては、（材料および装置表を参照してください）独自のソフトウェアを使用してデータ分析を実行するには、メーカーからのマニュアルを参照してください。
Representative Results
この研究で提示される画像は、単一のオペレータによって採取しました。すべての画像は（材料および装置表を参照してください）高周波超音波機器を用いて収集しました。全てのイメージングデータを単一の研究者によって分析されました。結果は、シスプラチンで処置した動物は、0.5から6日目（ 図2A）で2.1（正常範囲<1.1）の範囲のSCRを有することを示しました。生理食塩水処置した動物と比較した場合しかし、組織学的研究は、急性尿細管間質性損傷の一貫したパターンを示しました。
脈のPARVUS形態はCisplain処理後6日目に動物で検出された腎臓の血行動態の変化を測定するために、高解像度超音波イメージングを使用して、データが、0日目と6日目の間のNSで処置した動物における形態の変化がなかったことを示しました。通常のRIとPIの上限値は、ラット17において、それぞれ、0.7及び1.15です。血行動態を評価するために上記の指標を用いて、 6日目にシスプラチン処置動物におけるRIとPIの有意な増加があることを実証した腎臓の変化。
ラットにおける腎臓の画像を検出するための図1の超音波装置の設定をラット腎臓超音波検査画像の操作時動物段階（A）及びイメージングプローブ位置（B）の設定を有する撮像システムのグラフィカルなイラスト。高周波、高解像度の超音波システムを使用して、ラット腎臓から得られたサンプル超音波診断画像（素材andand機器の表を参照のこと）。 （CF）。データはさらに、血行動態パラメータの測定および分析のための十分な情報と腎血管に明らか腎臓の解剖学的構造と血流を示します。09fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. 組織学およびシスプラチンの治療中のラットの腎臓超音波検査画像。血清クレアチニン（SCR）と組織学の研究では、シスプラチン処理したラット（A、B）でビヒクル処置ラットと重度の近位尿細管腎障害（黄色の矢印）での正常な腎臓組織を提示します。 SCRは、シスプラチン処理後にわずかに増加したが、正常範囲（<1.1）内に留まりました。車両及びシスプラチン処置したラット（C）上の超音波検査0日目、3でカラードップラーモードにおけるラットの右腎の画像、および6;血行動態パラメータ、RI及びPIは、カラードップラー超音波（D、E）により評価し、増加に有意でした。通常のRIの上限は0.7とPIのために1.15です。重要なのは、トンデータ上記の彼はそれらの血行動態の変化はSCRの立ち上がりに先行示します。脈波速度の測定は、組織学の研究結果と相関シスプラチン処理後遅く、弱いパルス（脈のPARVUS記号、黄色い丸）を示します。この現象は、腎動脈狭窄、閉塞、さらに腎機能障害を示します。組織学的データは、成功した薬剤誘発近位尿細管腎臓損傷を示し、超音波検査の評価は、カラードップラー技術を使用して、RI、PIおよび脈波伝播速度の有意な変化を示しました。 N = 3、*はp <0.05。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
薬剤誘発AKI 表 1. 腎血行動態パラメータ
Discussion
過去10年間で、多くの進歩は、高品質、感度、および精度で超音波検査データを提供し、高周波数機械的プローブの開発を含む超音波検査技術で発生しています。これらのプローブは、したがって、それは、このようなラットやマウス18などの小動物を研究するための強力なツールとして機能することができ、5〜12ミリメートル、高フレームレート（より大きい200フレーム/秒）の侵入深さで約50μmの距離分解能を提供することができます19。さらに、それはまた、生理的レベルでのバイタルサインで軽く鎮静さや意識のある動物に超音波診断画像を収集することができます。また、この非侵襲的な様式は、動物19を犠牲にすることなく、疾患の進行の間の構造的および機能的変化の長手方向の評価を実行するための機会を提供します。
1959年、博士。ラッセルとブラシは、最初awarを上げるために3つの「R」ルール（交換、削減、および洗練を）説明しました研究における動物の使用における倫理的問題のeness。提案されたプロトコルはNephorotoxicityの研究では、少なくとも痛み、苦しみや苦痛の下で動物の最小数を利用することができ、非侵襲的な小動物超音波検査ことを初めて示しています。従って、実験動物のための3つの「R」のルールを満たすために潜在的に有効な様式です。
多くの超音波検査の研究では、心臓用途に焦点を当ててきました。腎機能の評価は、多くの場合、心臓の状態ではなく、腎臓20-25の直接の研究の測定から導出されました。私たちは、リアルタイムでの腎臓における解剖学的および機能的変化を可視化するイメージングの方法論を確立しています。私たちは、腎臓ビューのための特異的な相補音響窓、グレースケール/ Bモードとカラードップラー、事前選択セットを使用しました。私たちは、これらの指標とシスプラチン誘発毒性モデルにおける腎機能の変化との関係を評価するために、RIとPI指数を使用しました。
提案された超音波検査方法論と派生プロトコルを使用して、薬物誘発性腎毒性の検出における新規性は、腎障害が発生した場合の血行動態変化のその早期のロバストな検出です。結果は、実際には腎内血管の血行動態の変化が上昇SCRに先行していることを示しています。これらのデータは、組織学的分析を用いた従来のゴールドスタンダードをベンチマークと小動物の超音波検査は、動物使用の最小要件があり、非侵襲的に敏感、かつ再現性のモダリティ、であることを実証されています。従って、ラットモデルを使用して、薬物誘発性腎毒性の早期発見のための有効なツールです。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Depilatory cream | Miltex, Inc. | Surgi-Prep | Apply 24 hours prior to imaging |
| cis-Diamineplatinum(II) dichloride | Sigma | 479306 | To induce acute kidney injury at small animals. |
| Isoflurane | Baxter International Inc. | NDC 10019-773-40 | 2-3% for induction, and 1-1.5 % for maintenance; heart beats will be maintained at above 500 beats per minute |
| High Frequency Ultrasound | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | Vevo 2100 | |
| High-frequency Mechanical Transducer | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | MS250, MS550D, MS400 |
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