Abstract
Nyrene fungerer normalt å opprettholde hemodynamisk homeostase og er en viktig side av skade forårsaket av narkotika toksisitet. Medikament-indusert nefrotoksisitet er beregnet til å bidra til 19- 25% av alle kliniske tilfeller av akutt nyreskade (AKI) hos kritisk syke pasienter. AKI deteksjon har historisk støttet seg på beregninger som serumkreatinin (SCR) eller blod urea nitrogen (BUN) som er beviselig mangelfull i full vurdering av nefrotoksisitet i den tidlige fasen av nedsatt nyrefunksjon. Foreløpig er det ingen robust diagnostisk metode for nøyaktig bestemmelse av hemodynamiske endringer i den tidlige fasen av AKI mens slike endringer kan faktisk gå forut for økningen i serum biomarkør nivåer. En slik tidlig diagnose kan hjelpe klinikere gjøre en nøyaktig diagnose og hjelp til i beslutningsprosesser for terapeutisk strategi. Rotter ble behandlet med cisplatin for å indusere AKI. Nefrotoksisitet ble vurdert i seks dager ved hjelp av høyfrekvent sonography, Scr måling og ved histopatologi avnyre. Hemodynamisk evaluering ved hjelp av 2D og farge-Doppler bilder ble brukt til å serielt studere nefrotoksisitet hos rotter, ved hjelp av sonography. Våre data viste vellykket legemiddelindusert nyreskade hos voksne rotter ved histologisk undersøkelse. Color-Doppler basert sonografiske vurdering av AKI indikerte at resistive-indeks (RI) og puls-indeks (PI) ble økt i behandlingsgruppen; og topp-systolisk hastighet (mm / s), ende-diastolisk hastighet (mm / s) og hastighets tid integral (VTI, mm) ble redusert i nyrearteriene i samme gruppe. Viktigere, disse hemodynamiske forandringer evaluert av sonography forut for økningen av SCR nivåer. Sonography baserte indekser som RI eller PI kan derfor være nyttige prediktive markører for fallende nyrefunksjon hos gnagere. Fra våre sonography baserte observasjoner i nyrene hos rotter som gjennomgikk AKI, viste vi at disse ikke-invasiv hemodynamiske målinger kan vurdere som en nøyaktig, følsom og robust metode i å oppdage tidlig stadium nyre dysfunksjon. Tsin studie understreker også viktigheten av etiske problemstillinger knyttet til bruk av dyr i forskning.
Introduction
Serum kreatinin (SCR) har vært gullstandarden tallene for å vurdere nyrefunksjonen i mer enn to tiår. Nylig har mange studier har rapportert at nyreskade oppstår mye tidligere enn endringene i SCR en. Det finnes imidlertid ingen robuste metoder for påvisning av hemodynamiske forandringer som forekommer tidlig i løpet av nyreskade, inkludert medikament-indusert nefrotoksisitet.
Legemiddelindusert akutt nyre hemodynamic dysfunksjon fører til nedsatt vevsskade og videre utvikling til nyresvikt 2,3. I de siste par tiårene, studier tyder på at tenkelig verktøy som computertomografi (CAT), Funksjonell magnetisk resonans imaging (fMRI) og sonography spille en rolle i hemodynamisk vurdering 4. I dagens tenkelig verktøy, gråskala sonography kombinert med Color-Doppler teknikker, er den mest brukte til å etablere og vurdere anatomiske status for nyre 3,5,6. Sullivan et. al. og Bonnin et. al. rapporterte nylig at sonografi er en effektiv, kraftig og ikke-invasiv verktøy i analyse hemodynamiske forandringer i vasokonstriksjon og hypoksi spenningsdyremodeller 7,8. Denne teknikken er også ofte brukt for å påvise arteriell stenose 9,10.
Nyeste tekniske fremskritt innen høyoppløselige ultralydavbildning har tillatt forskere å adressere kardiovaskulær toksisitet ved hjelp av høy frekvens (25-80 MHz) og høy oppløsning (<0,03 mm oppløsning) sonder, in vivo 11. Vi hypotese at du bruker denne høy oppløsning sonography å studere nyre vil gi en enestående mulighet for en ikke-invasiv og følsom metode for tidlig påvisning av nefrotoksisitet.
Cisplatin brukes til å behandle testiklene, eggstokkene, blære, hode, lunge og nakke kreft i kombinasjon med andre rusmidler 12-14. Cisplatin har hadde veldokumentert nefrotoksisitet på grunn av cellenekrose av proximal tubuli (PT) og samle kanaler resultert i økende blod urea nitrogen (BUN) og SCR 15. Heri gir vi en detaljert steg-for-steg metodikk for bruk av ikke-invasiv nedsatt sonography å karakter nyre dysfunksjon ved bruk av rottemodellen av narkotika (Cisplatin) indusert nefrotoksisitet.
Protocol
Utfør alle prosedyrer i Sprague Dawley rotter kjøpt fra Charles River Laboratories i henhold til American Veterinary Medical Association (AVMA) retningslinjer og bruk av godkjente Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) protokoller.
1. Animal Forberedelse og kirurgiske prosedyrer
- Akklimatisere alle dyr i en uke før eksperimentell prosedyre.
- Bedøve dyret ved hjelp av isofluran (2-3% for å indusere, og 1,0% for å opprettholde) og gjelder øyesalve i begge øyne for å hindre uttørking, irritasjon eller sårdannelse.
- Fjern hår fra dyrets bryst ved hjelp av # 40 blad og Hårfjerningskrem som nødvendig. Det kan ha å fjerne hår skjema dyrets tilbake hvis vi ikke kan ha gode bildedata innhentet fra ventral side bildebehandling.
2. Nefrotoksisitet Rat Model
- For Cisplatin-indusert nefrotoksisitet modell, administrere Cisplatin, ved hjelp av protokollen ens tidligere beskrevet. 15
- Utfør sonography ved baseline, 24 timer før administrering av cisplatin (dag 0). (Se trinn 3, Imaging Protocol)
- Randomize rotter (n = 6) i to grupper. På dag 1, administreres Cisplatin (10 mg / ml) (10 mg / kg kroppsvekt, enkeltdose nefrotoksisitet induksjon), injeksjonsvolum (1 ml / kg kroppsvekt) beregnet av dyrets kroppsvekt) intraperitonealt i studiegruppen og normal saltløsning ( NS) i kontrollgruppen.
- Bedøve dyr som trinn 1.2 ved 24, 48, 72, 96, 120, 144 timer etter administrering av cisplatin.
- Ta bilde med høy oppløsning ultralyd system (se Materialer og utstyr tabell) under stabil anestesi stadium av dyr. Fortsett å overvåke dyrenes grunnleggende fysiologiske funksjon under bildebehandling fra anestesi induksjon gjennom full gjenoppretting.
- Overvåk dyr vitale tegn under bildebehandling prosedyrer: rotte-temperatur: 35,9 til 37,5, lufthastighet: 66-144 / min, hjertefrekvens: 250-600 / min.Den optimale vitale tegn lesing i vår foreslåtte studien er: temperatur: 36,5 til 37,0, lufthastighet: 80-100 / min, hjertefrekvens: 450-550 / min.
MERK: Bruk Intravenøs væske infusjon, og varmelampe for å opprettholde dyrets normale fysiologiske tilstand for å minimere effekten av kirurgi og anestesi. Bistå åndedrett med mekanisk ventilator under prosedyren om nødvendig. Imidlertid er mekanisk ventilasjon sjelden nødvendig i dette eksperimentet.
3. Imaging Protocol
Merk: ultralyd maskin leverandør gir oppvarmet plattform for lang avbildning prosedyre. Men vi bruker ikke den oppvarmede plattformen i vår viste forsøket fordi det tar bare 5 til 15 min. Dens kontrollert for kroppstemperatur som overvåkes med en rektal termometer forbundet med den fysiologi kontrollbryteren.
- Tverrgående bilde av Kidney (B-modus):
- Ved hjelp av MS 250 ultralyd med senterfrekvens på 21 MHz kobleed til den aktive-port, sette programmet forhåndsinnstilt til "General Imaging".
- Med dyret liggende på plattformen ved å plassere 21 MHz ultralydsonden ved hjelp av skinnesystemet midtlinjen på dyr og isolere den aorta. I denne stillingen sonden vinkelen er 90 grader til venstre parasternal linjen (tverrakse) (Figur 1A, B).
- Fra denne stilling skyver plattformen med dyret slik at sonden er nå ved nivået for nyrearterien (enten til venstre eller til høyre, kan bildet en om gangen).
- Ved å bruke micromanipulators, se enten høyre eller venstre nyrearterien.
- Juster sonden vinkel ved å vippe litt langs y-aksen til sonden for å oppnå en fullstendig nyre vis i midten av skjermen.
- Når de riktige landemerker (nyrebekken, renal blod) er identifisert som vist i figur 1C og D, cine store bildet med den høyeste bildefrekvens tillatt med sonden brukes.
- Tverrgående bilde av Kidney (Color-Doppler visning):
- Bruke Color-Doppler-tasten på tastaturet, slår du på Color Doppler akustisk vindu. Dette bidrar til å isolere nyrearterien og nyrevenen (figur 1D). (Blå farge indikerer arteriell flyt, og rød farge indikerer venøs flyt).
- Sørg for at fokus dybde (indikert av og gul pilspiss på Y-aksen) ligger i sentrum av nyre. Registrere data med filmbutikken.
- Sørg for at posten dataene på høyest mulig bildefrekvens mulig (> 200 bilder / sek).
- Tverrgående bilde av Kidney (Pulsed-bølge eller PW visning):
- Klikk på PW-tasten, mens i Color-Doppler modus, for å få opp en gul indikatorlinjen (Pulsed-bølge Doppler prøvevolum) på skjermen (figur 1F).
- Plasser den gule linje i nyrearterien, i en vinkel som er en parallell til retningen av strømningen gjennom beholderen ved hjelp av PW vinkel nøkkel.
- I denne modusen, deler akustisk vindu opp i øvre og nedre seksjoner.
- Bruk Cine butikken for å ta bildet av bølgeformer som indikerer hastigheten av den arterielle flyt på topp systolen og diastolen.
4. Animal Håndtering Etter Imaging
- Fra dag 0 til dag 5, plasserer dyret inn i en ren recovery (med rent papir håndkle på sengetøy) i sternum recumbency posisjon etter bildebehandling. Merk at vi håndterer alle dyr med ekstrem forsiktighet ved "Tail Holding" metode for aggressive dyr som dyr gjenopprette fra anestesi.
- Under bedøvelse utvinning, holde dyrets kroppstemperatur med en ekstern heat kilde og skjerm dyrets vitale tegn med elektro sonder til dyr fullt gjenoppretter fra anestesi.
- Return utvinnes dyr til anlegget bolig rommet når de er våkne og aktive.
- Avlive alle rottene i henhold til institusjonelle retningslinjer på dag 6 og høste nyrene (se trinn 4.7) for histologisk vurdering samt trinn 4.5.
- Samle dyrets urin fra samling rør festet i den metabolske bur for kreatinin test for å sjekke nyrefunksjonen.
- Utfør parafin delen av dyr nyre, og utføre HE (Hematoxylin og eosin) flekker å sjekke nefrotoksisitet (se trinn 4.7 for detaljer).
- Offer dyr og exsanguinate med 0,9% NaCl-løsning, etterfulgt av 10% bufret formalin fiksering gjennom venstre ventrikkel. Etter blodtapping med 0,9% NaCl-løsning, fjerne rotte nyrene for histologisk vurdering 16.
- Parafin legge 6 mm seksjoner for å observere nyrene morphollogi og nefrotoksisitet. Dehydrere nyrevevet i 30% sukrose i fosfat-bufret saltvann (PBS) i 48 timer ved 4 ° C. Deretter fikse delene i 10% bufret formalin for 24-48 timer ved 4 ºC.
- Deretter legge nyrevevet i parafin, og lagre vev parafinblokker på RT til seksjonering. Videre delen vevet blokker med en parafin seksjon maskin og plassere deler på en belagt glass lysbilde.
- Deparrafinize seksjonen og rehydrert og farget med hematoksylin i 10 minutter, etterfulgt av eosin i 3 min. Monter delene på et lysbilde og få dem vurdert av en gnager patolog.
5. data Beregning og analyse
- Beregn nyre arteriell topphastigheter fra Color Doppler bilder hentet fra trinn 3.2. Velg tidsintegral for hastighet (VTI) verktøy for å spore toppene av systolisk og diastolisk hastighet.
- Beregn Resistivitetsindeks (RI) og Pulsatile Index (PI) ved hjelp av equations nedenfor.
RI = (peak systolisk hastighet-end diastolisk hastighet) / peak systolisk hastighet
PI = (peak systolisk hastighet-end diastolisk hastighet) / gjennomsnittshastighet. - Utføre statistisk analyse av RI og PI resultater med standardavvik fra gjennomsnittet av tre målinger syklus. For andre standard parametere, se håndbøkene fra produsenten til å utføre dataanalyse ved hjelp av proprietær programvare (se materialer og utstyr tabell).
Representative Results
Bildene som presenteres i denne studien ble tatt av en enkelt operatør. Alle bildene ble tatt ved hjelp av en høyfrekvent ultralyd maskin (se Materialer og utstyr tabell). Alle bildedataene ble analysert ved et enkelt etterforsker. Resultatene viste at Cisplatin-behandlede dyr hadde SCR området fra 0,5 til 2,1 (normalområdet <1,1) på dag 6 (Figur 2A). Men den histologiske studier vist konsistent mønster av akutt tubulære interstitielle skader når sammenlignet med normale saltvannsbehandlede dyr.
Ved hjelp av høy-oppløsning ultralydavbildning for å måle hemodynamiske forandringer i nyre, data viste at det var ingen endring av morfologien hos dyr behandlet med NS mellom dag 0 og dag seks, mens pulsus Parvus morfologi ble detektert i dyr ved dag seks etter Cisplain behandling. Den øvre grense for normal RI og PI er 0,7 og 1,15, henholdsvis i rotter 17. Ved hjelp av de ovennevnte indeksene til å vurdere hemodynamisk endringer i nyre, som viste at det er betydelig økning av RI og PI i Cisplatin-behandlede dyr på dag 6.
Figur 1. Ultralyd apparatinnstillinger for påvisning av nyre bilder i rotter. Grafiske illustrasjoner av bildedannende system med innstillingen av animalsk trinn (A) og avbildning probe posisjon (B) ved bruk av rottenyre sonografiske avbildning. Prøve sonografiske bilder hentet fra rotte nyre ved hjelp av høyfrekvente, høyoppløselige ultralydsystemer (se Materiale andand utstyr tabell). (CF). Dataene viser klart nyre anatomiske struktur og blodstrøm i nyrearterier med tilstrekkelig informasjon for videre hemodynamisk parameter måling og analyse.09fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Histologi og nyre sonografiske bilder av rottene under Cisplatin behandling. Serum kreatinin (SCR) og histologi studie presenterer normalt nyrevev i bilen behandlet rotte og alvorlig proksimale tubulære nyreskade (gul pil) i Cisplatin behandlet rotte (A, B). SCR økte marginalt etter Cisplatin behandling, men forble innenfor normalområdet (<1,1). Sonografiske bilder av høyre nyre av rotter i Color-Doppler modus på dag 0, 3 og 6 på kjøretøy og cisplatin behandlede rotter (C); hemodynamiske parametre, RI og PI, var betydelig økt, vurdert etter farge-Doppler ultralyd (D, E). Den øvre grensen for normal RI er 0,7 og 1,15 for PI. Viktigere, than over data viser de hemodynamiske endringer foran den økende SCR. Pulse bølgehastighet måling viser en langsom og svak puls (pulsus Parvus tegn, gul sirkel) etter Cisplatin behandling som korrelerer med histologi studere resultatene. Dette fenomenet indikerer nyrearteriestenose, obstruksjon og videre nyre dysfunksjon. Histologiske data viste vellykket legemiddelindusert proksimale tubulære nyreskader og sonografiske vurdering viste signifikante endringer i RI, PI og puls bølgehastighet ved hjelp av Color-Doppler teknologi. N = 3, *, p <0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Nedsatt hemodynamiske parametre for Legemiddelutløst AKI
Discussion
I det siste tiåret, har mange fremskritt skjedd i sonografiske teknologi, inkludert utvikling av høyfrekvente mekaniske prober, som tilbyr sonografiske data med høy kvalitet, følsomhet og nøyaktighet. Disse sonder kan gi tilnærmet 50 um aksial oppløsning ved en inntrengningsdybde på 5 til 12 mm og høy bildefrekvens (større enn 200 ramme / sek), og dermed kan det tjene som et robust verktøy for å studere små dyr som rotter og mus 18, 19. Videre gir det også å samle sonografiske bilder på lett bedøvet eller bevisste dyr med vitale tegn på fysiologiske nivåer. I tillegg er ikke-invasiv modalitet gir også mulighet til å utføre langsgående vurdering av strukturelle og funksjonelle forandringer under sykdomsutviklingen uten å ofre dyr 19.
I 1959, Drs. Rusell og børste først beskrevet de tre "R" regler (Replacement, Reduction, og Refinement) for å heve awareness av etiske problemstillinger i dyr bruk i forskning. Den foreslåtte protokoll viser for første gang at ikke-invasiv lite dyr sonography kan bruker minimalt antall dyr i henhold til minst smerte, lidelse eller ubehag i Nephorotoxicity studien. Derfor er det en potensiell effektiv modalitet for å møte de tre "R 'regler for forsøksdyr.
Mange sonografiske studier har fokusert på hjerte programmer; nyrefunksjonen vurderingene ble ofte hentet fra målinger av hjertestatus snarere enn en direkte studie av nyre 20-25. Vi har etablert en avbildning metodikk for å visualisere anatomiske og funksjonelle endringer i nyrene i sanntid. Vi brukte en forhåndsvalgt sett utfyllende akustiske vinduer, grå-skala / B-modus og Color-Doppler, spesifikke for nyre utsikt. Vi brukte RI og PI indekser for å vurdere forholdet mellom disse indeksene og endringer av nyrefunksjonen i Cisplatin toksisitet modell.
Nyheten i å oppdage narkotika-indusert nefrotoksisitet ved hjelp av den foreslåtte sonografiske metodikk og avledet protokollen er dens tidlig robust deteksjon av hemodynamiske endringer i tilfelle nyreskade. Resultatene indikerer at de intra-renale vaskulære hemodynamiske endringer i faktisk gå forut for eren SCR. Disse dataene er vurdert opp mot den konvensjonelle gullstandard ved hjelp av histologisk analyse og vise at små dyr sonography er en ikke-invasiv, følsom, og reproduserbar modalitet, som har minimalt krav om bruk av dyr. Det er dermed et effektivt verktøy for tidlig deteksjon av legemiddelindusert nefrotoksisitet ved hjelp av rottemodellen.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Depilatory cream | Miltex, Inc. | Surgi-Prep | Apply 24 hours prior to imaging |
| cis-Diamineplatinum(II) dichloride | Sigma | 479306 | To induce acute kidney injury at small animals. |
| Isoflurane | Baxter International Inc. | NDC 10019-773-40 | 2-3% for induction, and 1-1.5 % for maintenance; heart beats will be maintained at above 500 beats per minute |
| High Frequency Ultrasound | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | Vevo 2100 | |
| High-frequency Mechanical Transducer | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | MS250, MS550D, MS400 |
References
- Bonventre, J. V. Diagnosis of acute kidney injury: from classic parameters to new biomarkers. Contrib Nephrol. 156, 213-219 (2007).
- Lerman, L. O., Textor, S. C., Grande, J. P. Mechanisms of tissue injury in renal artery stenosis: ischemia and beyond. Progress in cardiovascular diseases. 52 (3), 196-203 (2009).
- Karas, M. G., Kizer, J. R. Echocardiographic assessment of the right ventricle and associated hemodynamics. Progress in cardiovascular diseases. 55 (2), 144-160 (2012).
- Milman, Z., et al. Hemodynamic response magnetic resonance imaging: application for renal hemodynamic characterization. Nephrol Dial Transplant. 28, 1150-1156 (2013).
- Anavekar, N. S., et al. Usefulness of right ventricular fractional area change to predict death, heart failure, and stroke following myocardial infarction (from the VALIANT ECHO Study). Am J Cardiol. 101 (5), 607-612 (2008).
- Lindqvist, P., Calcutteea, A., Henein, M. Echocardiography in the assessment of right heart function. Eur J Echocardiogr. 9 (2), 225-234 (2008).
- Sullivan, J. C., et al. Novel use of ultrasound to examine regional blood flow in the mouse kidney. American journal of physiology. Renal physiology. 297, F228-F235 (2009).
- Bonnin, P., Sabaa, N., Flamant, M., Debbabi, H., Tharaux, P. L. Ultrasound imaging of renal vaso-occlusive events in transgenic sickle mice exposed to hypoxic stress. Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1076-1084 (2008).
- Desberg, A. L., et al. Renal artery stenosis: evaluation with color Doppler flow imaging. Radiology. 177 (3), 749-753 (1990).
- Ciccone, M. M., et al. The clinical role of contrast-enhanced ultrasound in the evaluation of renal artery stenosis and diagnostic superiority as compared to traditional echo-color-Doppler flow imaging. International angiology : a journal of the International Union of Angiology. 30 (2), 135-139 (2011).
- Bauer, M., et al. Echocardiographic speckle-tracking based strain imaging for rapid cardiovascular phenotyping in mice. Circ Res. 108 (8), 908-916 (2011).
- Boulikas, T., Vougiouka, M. Recent clinical trials using cisplatin, carboplatin and their combination chemotherapy drugs (review). Oncology reports. 11 (3), 559-595 (2004).
- Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. Biomarkers of acute kidney injury. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 48, 463-493 (2008).
- Hye Khan, M. A., Abdul Sattar, M., Abdullah, N. A., Johns, E. J. Cisplatin-induced nephrotoxicity causes altered renal hemodynamics in Wistar Kyoto and spontaneously hypertensive rats: role of augmented renal alpha-adrenergic responsiveness. Exp Toxicol Pathol. 59, 253-260 (2007).
- Vaidya, V. S., Bonventre, J. V. Mechanistic biomarkers for cytotoxic acute kidney injury. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2 (5), 697-713 (2006).
- Lu, T. S., Chen, H. W., Huang, M. H., Wang, S. J., Yang, R. C. Heat shock treatment protects osmotic stress-induced dysfunction of the blood-brain barrier through preservation of tight junction proteins. Cell stress, & chaperones. 9 (4), 369-377 (2004).
- Kaya, M. Hemodynamics - New Diagnostic and Therapeutic Approaches. , InTech. 1-30 (2012).
- Bjornerheim, R., Grogaard, H. K., Kjekshus, H., Attramadal, H., Smiseth, O. A. High frame rate Doppler echocardiography in the rat: an evaluation of the method. European journal of echocardiography : the journal of the Working Group on Echocardiography of the European Society of Cardiology. 2 (2), 78-87 (2001).
- Zhang, L., et al. A high-frequency, high frame rate duplex ultrasound linear array imaging system for small animal imaging. IEEE transactions on ultrasonics, ferroelectrics, and frequency. 57, 1548-1557 (2010).
- Frea, S., et al. Echocardiographic evaluation of right ventricular stroke work index in advanced heart failure: a new index? J Card Fail. 18 (12), 886-893 (2012).
- Marwick, T. H., Raman, S. V., Carrio, I., Bax, J. J. Recent developments in heart failure imaging. JACC Cardiovasc Imaging. 3 (4), 429-439 (2010).
- Pokreisz, P. Pressure overload-induced right ventricular dysfunction and remodelling in experimental pulmonary hypertension: the right heart revisited. Eur Heart J supplements. 9 (Supplement H), H75-H84 (2007).
- Senechal, M., et al. A simple Doppler echocardiography method to evaluate pulmonary capillary wedge pressure in patients with atrial fibrillation. Echocardiography. 25 (1), 57-63 (2008).
- Souders, C. A., Borg, T. K., Banerjee, I., Baudino, T. A. Pressure overload induces early morphological changes in the heart. Am J Pathol. 181 (4), 1226-1235 (2012).
- Tanaka, N., et al. Transthoracic echocardiography in models of cardiac disease in the mouse. Circulation. 94 (5), 1109-1117 (1996).
