Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

التمايز من العصبية البشرية خط الخلايا الجذعية على الثقافات الثلاث الأبعاد، تحليل الجينات الرنا الميكروي، واعتبارا الهدف

Published: April 12, 2015 doi: 10.3791/52410
Automatic Translation
1, 1, 1
1ReNeuron

Abstract

الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) قادرة على تجديد الذات والتمايز في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية و oligodendrocytes تحت microenvironments محلية محددة. هنا، نقدم مجموعة من الأساليب المستخدمة لثلاثي الأبعاد (3D) التمايز وتحليل ميرنا من الخلايا الجذعية العصبية البشرية (hNSC) خط نسيلي، حاليا في التجارب السريرية للسكتة الدماغية العجز (NCT01151124 وNCT02117635، Clinicaltrials.gov). وقد استمدت HNSCs من وافق الأشهر الثلاثة الأولى القشرة الجنين الإنسان الأخلاقية وخلد مشروط باستخدام التكامل فيروسات من نسخة واحدة من ج-mycER TAM بناء. نحن تصف كيفية قياس عملية محور عصبي ثمرة hNSCs متباينة على السقالات 3D وكيفية قياس التغيرات المرتبطة بها في التعبير ميرنا باستخدام PCR مجموعة. وعلاوة على ذلك نحن مثالا التحليل الحسابي بهدف اختيار ميرنا الأهداف المفترضة. وقد تم تحديد SOX5 وNR4A3 كهدف المفترضة ميرنا مناسبة المحدد بشكل كبير أسفل تنظيمmiRNAs التطوير في hNSC متباينة. تم إجراء ميرنا التحقق من صحة الهدف على SOX5 وNR4A3 3'UTRs التي كتبها المزدوج ترنسفكأيشن مراسل البلازميد والمزدوجة luciferase المراسل الفحص.

Introduction

أبحاث الخلايا الجذعية يلعب دورا مركزيا في الطب التجديدي، الذي يمتد أيضا تخصصات هندسة الأنسجة، بيولوجيا الخلايا في النمو، والعلاجات الخلوية، والعلاج الجيني، والمواد الحيوية (السقالات والمصفوفات). والخلايا الجذعية هي مهمة في كل من هيئة إصلاح الأنسجة للتنمية المشتركة. فهم كيفية عمل الخلايا الجذعية هي محوريا لتطوير العلاج بالخلايا الجذعية الجديدة القائمة 1. CTX0E03 هو نسيلي، الخلايا الجذعية العصبية البشرية خلد مشروط (hNSC) خط 2 معزولة عن الأشهر الثلاثة الأولى القشرة الجنين الإنسان. وقد حددت CTX0E03 خصائص الجودة التي لا غنى عنها للأعمال المصرفية خلية السريري تحت الممارسات التصنيعية الجيدة (GMP) 3. يمكن HNSCs التفريق بصورة عفوية إلى الخلايا العصبية، الدبقية، و oligodendrocytes ولقد ثبت لتحسين العجز العصبية عند زرعها في نموذج القوارض من البؤري نقص التروية 2،4،5. وCTX0E03 hNSCs حاليا في التجارب السريرية للسكتة الدماغية disabilإيتي (NCT01151124 6 و NCT02117635، Clinicaltrials.gov).

MiRNAs لديها متوسط ​​22 النيوكليوتيدات في الطول وثبت الجزيئات التنظيمية 7، فإنها لا ترميز البروتينات، وإنما ربط 3 المنطقة غير مترجمة الأولى (3'UTR) من من mRNAs، وتنظيم استقرارها وترجمتها إلى بروتينات. وتفيد التقارير MiRNAs للمشاركة في تنظيم عدد من العمليات الخلوية، بما في ذلك تطوير وانتشار الأسلحة، والتمايز 8. قد تورطت عدة miRNAs في تنظيم مصير ومواصفات من الخلايا الجذعية العصبية 9.

في اثنين من الأبعاد (2D) بيئة ثقافة القياسية لم يتم تطابق تعقيد البيئة في الجسم الحي، وبالتالي تحريض وتنظيم hNSC التمايز ليس الأمثل. في الجسم الحي، وتحاط الخلايا من الأبعاد (3D) المكروية ثلاثة ألحان الآخر الخلايا ويغاندس خارج الخلية، بما في ذلك العديدأنواع الكولاجين، laminin، والبروتينات المصفوفة الأخرى (المصفوفة خارج الخلية، ECM). وأفادت دراسات سابقة أن تضاريس المعماري من المواد محاكاة موبينيل والنفوذ الهندسة خلية النمط الظاهري ومصير 10-15. يتوفر عدد من السقالات 3D المتاحة تجاريا. كنا سقالة البوليسترين المسامية العالية هندسيا مع بنية محددة جيدا وموحدة في غشاء سميك 200 ميكرون والتي توفر مساحة 3D في الخلايا التي يمكن أن تغزو وتفرق 16-18.

وتستخدم هذه الوثيقة 2D و 3D المقايسات التمايز لتقييم axonprocess ثمرة. وعلاوة على ذلك، نحن تصف طريقة لمحة عن التعبير ميرنا من خط الصف hNSC السريري لمواصلة التحقيق آثار ميرنا على التمييز بينه و. وتستند هذه الأساليب في هنا يتضح على تلك المذكورة أصلا في 19.

Protocol

1. HNSC التمايز على ثلاثي الأبعاد (3D) الثقافة

ملاحظة: عزل واستخلاص hNSCs، من الأنسجة وافق الأخلاقية، وصفت في منشور السابق 2. يرجى اتباع المبادئ التوجيهية الأخلاقية والمؤسسية في حين تتبع هذا الإجراء.

1.1) الثقافة 3D عن طريق 12 لوحة جيدا

  1. استخدام تقنية العقيم في جميع أنحاء الداخلي. في خزانة السلامة البيولوجية، السقالات إعادة هيدرات بإضافة 2 مل / جيد من 70٪ من الإيثانول أعدت استخدام المياه لأغراض الري (WFIr). تجنب لمس السقالات التي كتبها الاستغناء عن الايثانول 70٪ لأسفل جدار كل بئر.
  2. نضح بعناية الايثانول 70٪، ويغسل فورا السقالات مع 2 مل / جيد DMEM: F12 لمدة 1 دقيقة. كرر الإجراء الغسيل مرتين. نضح بعناية DMEM: F12 بعد غسل النهائي.
  3. السقالات معطف بإضافة 2 مل / جيد من laminin (10 ميكروغرام / مل) في DMEM: F12. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 همهمةحاضنة idified مدة لا تقل عن 2 ساعة. غسل لوحة مع DMEM الدافئ: F12.
  4. البذور كل سقالة مع ما يقرب من 500،000 hNSCs في حجم 150 ميكرولتر من RMM + إحصاءات مالية الحكومة.
  5. احتضان لوحة لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب للسماح للخلايا ليستقر في السقالات.
  6. إضافة 3.5 مل من RMM لكل اتخاذ رعاية جيدة وليس لإزاحة الخلايا من السقالات.
  7. احتضان لوحة لمدة 7 أيام؛ استبدال RMM متوسطة (3.5 مل / جيد) بعد 1 يوم (التغذية الأولى) ومرة ​​أخرى بعد 2-3 أيام من تغذية الأولى.
  8. بعد 7 أيام، وإزالة المتوسطة والخلايا مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) للمناعية (ICC) إصلاح أو إضافة 500 ميكرولتر / بئر كاشف تحلل لمجموع استخراج الحمض النووي الريبي (مخزن وحة في ≤ -80 ° C أو المضي إلى إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي) .

1.2) قياس أكسون ثمرة عملية

  1. وصمة عار 4٪ PFA ثابتة hNSCs متباينة وفقا لبروتوكول المحكمة الجنائية الدولية القياسية 20 باستخدام β3-تويولين (TUBB3) الكشف عن الأجسام المضادة الأولية مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق تألقي. نوى الخلايا مباين مع هويشت (1 ميكرومتر).
  2. التقاط صور تمثيلية من خلايا β3 تويولين الملون باستخدام المجهر الفلورسنت. حفظ الصور كما شجار أو JPEG. مقياس لعملية محور عصبي ثمرة باستخدام أداة قياس البرمجيات (على سبيل المثال، صورة برو بلس).
  3. فتح الصورة، والخيار القياسات مختارة في شريط الأدوات، وحدد ميزة التتبع.
  4. لبدء التتبع، تحديد نقطة البدء على ثمرة محور عصبي من خلال النقر على زر الماوس. تتبع على طول من ثمرة محور عصبي. انقر بزر الماوس الأيمن لإنهاء كل أثر. كرر لقياس كل outgrowthswith محور عصبي في مجال الرؤية.
  5. التعبير عن القياسات كما بكسل أو ميكرون (في انتظار معايرة اقامة). قياسات طول التصدير إلى برنامج جدول بيانات للتحليل المقارن والإحصائي عينة.

2. ميرنا التعبير باستخدام الخلايا الجذعية ومسارات التنموية المركزة ميرنا PCR صفيف

2.1) ميرنا الكلي استخراج الحمض النووي الريبي

  1. أداء استخراج ميرنا على السقالات وعينات 2D نمت (متباينة وغير متمايزة، والسيطرة hNSC).
  2. السقالات ذوبان الجليد، وإدراجها في 12 لوحة جيدا، إذا لزم الأمر. الجمع بين محتويات كاشف تحلل (500 ميكرولتر) من 2 آبار في نفس 1.5 مل إيبندورف أنبوب، الحجم النهائي 1 مل من تحلل كاشف. احرص على ترك السقالة في البئر.
  3. لجمعها سابقا خلية مكعبات 2D نمت العينات الجافة مثل (متباينة الثقافات hNSC 2D والسيطرة غير متمايزة) إضافة 1 مل من تحلل كاشف ونقل المحتويات إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
  4. التجانس كل عينة الاختبار باستخدام 1 مل حقنة وقصيرة 20 إلى 25 إبرة قياس. تمرير المحللة من خلال إبرة باستخدام حقنة 1 مل تصل إلى 5 مرات حتى يتم التوصل إلى المحللة متجانسة.
  5. إضافة 200 ميكرولتر من كلوروفورم لكل أنبوب إيبندورف وسقف آمن. عكس ودوامة الأنابيب لخلط المحتويات.
  6. الطرد المركزي كل 1.5 مل أنبوب microcentrifuge تحتوي جناسة لمدة 15 دقيقة في ≥12،000 ز س.
  7. نقل المرحلة المائية العليا من كل عينة (تجنب نقل أي البيني، والوردي اللون السائل) إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل الطازجة التي تحتوي على 750 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. مزيج دقيق من قبل انقلاب.
  8. ماصة ما يصل الى 700 ميكرولتر من كل عينة اختبار، بما في ذلك أي راسب، في عمود صغير في أنبوب جمع 2 مل. إغلاق الغطاء والطرد المركزي في ≥8،000 x ج لمدة حوالي 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تجاهل التدفق من خلال. كرر هذه الخطوة باستخدام ما تبقى من العينة.
  9. إجراء هضم الحمض النووي لمدة 15 دقيقة.
  10. إضافة 700 ميكرولتر عازلة RWT إلى العمود مصغرة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في ≥8،000 ز س. تجاهل التدفق من خلال.
  11. غسل عمود صغير من خلال إضافة 500 ميكرولتر العازلة RPE والطرد المركزي لمدة حوالي 30 ثانية في ≥8،000 ز س. تجاهل التدفق من خلال. كرر wash.Centrifuge في ≥12،000 x ج لمدة 1 دقيقة حتى يجف الغشاء أبعد من ذلك.
  12. أزل الحمض النووي الريبي مجموع في 1.5 مل إيبندورف أنبوب عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه إلى العمود صغير والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في ≥8،000 ز س. قياس التركيز الكلي RNA مع المعونة من مقياس الطيف الضوئي المناسب.

2.2) ميرنا [كدنا إعداد

  1. تحضير مزيج الرئيسي العكسية النسخ. يتطلب كل عينة 4 ميكرولتر من العازلة 5X miScript HiSpec، 2 ميكرولتر من 10X nucleics المزيج، miScript 2 ميكرولتر عكس مزيج الناسخ.
  2. قسامة 8 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في أنبوب PCR، إضافة حجم المطلوب من الحمض النووي الريبي مجموع (250 نانوغرام)، وإضافة الماء الخالي من ريبونوكلياز إلى الحجم النهائي من 20 ميكرولتر.
  3. احتضان لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة C.Incubate لمدة 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية إلى تعطيل miScript الناسخ العكسي ميكس.
  4. إضافة 200 ميكرولتر المياه خالية من ريبونوكلياز لكل رد فعل 20 ميكرولتر عكس النسخ، وتخزينها في -20 ° C، أو المضي في الوقت الحقيقي، منظمة الشفافية الدوليةلي PCR على الفور.

2.3) الخلايا الجذعية والتنموية مسارات تركز ميرنا PCR صفيف

  1. إعداد PCR مكونات المزيج في أنبوب 15 مل بإضافة 1375 ميكرولتر من 2X SYBR مزيج سيد الأخضر، و 100 ميكرولتر إعداد ميرنا كدنا]، 275 ميكرولتر من 10X miScript العالمي التمهيدي، و 1000 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه (إجمالي حجم 2،750 ميكرولتر).
  2. نقل PCR مكونات المزيج على خزان تحميل PCR. إزالة بعناية 96-جيدا لوحة PCR مجموعة من حقيبتها مختومة.
  3. إضافة 25 ميكرولتر مكونات PCR مزيج من كل بئر من صفيف PCR باستخدام pipettor 8 قنوات، أو pipettor 12 قناة باستخدام سوى 8 نصائح. تغيير نصائح الماصة بعد كل خطوة pipetting للتجنب التلوث المتبادل بين الآبار.
  4. ختم لوحة مع فيلم لاصقة البصرية، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 1،000 x ج في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) لإزالة الفقاعات. تفقد البصر لوحة من تحت لضمان عدم وجود فقاعات موجودة في الآبار.
  5. وضع 96 لوحة جيدا PCR مجموعة في cycler على الوقت الحقيقي.
  6. برنامج في الوقت الحقيقي cycler على وفقا لذلك: 1 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، و 45 دورات لمدة 15 ثانية في 95 درجة مئوية، و 1 دقيقة في 60 ° C رقما (جمع البيانات مضان) واحد.
  7. تصدير القيم ط لجميع الآبار إلى جدول بيانات Excel فارغة للاستخدام مع PCR صفيف تحليل البيانات قالب Excel والبرمجيات على شبكة الإنترنت.
    ملاحظة: البرنامج هو متاح في www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php .

3. تحليل الحاسوبية لميرنا الهدف التنبؤ والتحقق من صحة الهدف من mRNAs التي كتبها مراسل البلازميد ترنسفكأيشن وDdual luciferase المراسل الفحص.

3.1) تحليل الحاسوبية للتنبؤات ميرنا الهدف

  1. تصفح PicTar ( http://pictar.mdc-berlin.de/ ) 21، خوارزمية المتاحة على الانترنت لتحديد ميرNA استهداف من mRNAs التنبؤ.
  2. انقر على "انقر هنا للتنبؤ PicTar على الفقاريات". سيتم فتح صفحة جديدة.
  3. في صفحة جديدة، PicTar اجهة ويب، واختيار الأنواع في القائمة المنسدلة وإدراج ميرنا من الفائدة في مربع ميرنا ID. انقر فوق البحث عن أهداف ميرنا.
  4. نلاحظ قائمة من mRNAs الهدف عن طريق aPicTar درجة في المرتبة.
    ملاحظة: PicTar يحسب على درجة مما يعكس احتمال أن UTR نظرا سيتم مستهدفة من قبل ميرنا محددة، وعلى أساس التكامل البذور، والديناميكا الحرارية والتنبؤ اندماجي للأهداف المشتركة في مجموعات من-أعرب المشارك miRNAs 22.
  5. وبالمثل استرداد قائمة من mRNAs الهدف باستخدام DIANA-LAB ( http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/ ) 23، وTargetScan ( http://www.targetscan.org/ ) 24، بديل على الانترنت متاح الخوارزميات.
  6. تجميع الجدول المقارن للمiRNAs على أساس الترتيب الحصول عليها باستخدام أدوات برمجية مختلفة. PicTar تحتل المرتبة قبل النتيجة، DianaLab التي كتبها الدقة (بناء على إشارة إلى نسبة الضوضاء وعلى درجة من الدقة لتقييم أهمية النتائج المتوقع)، وTargetScan من قبل معاهدة التعاون بشأن البراءات الكلي (على أساس التكامل البذور، الطاقة الحرة الحرارية ملزمة، والحفاظ على أنواع مختلفة)، انظر الجدول 1.

3.2) التحقق من صحة الهدف من mRNAs التي كتبها مراسل البلازميد ترنسفكأيشن والفحص المزدوج luciferase المراسل.

ملاحظة: 3 'UTR للصحفيين luciferase المراسل للتحقق من صحة الهدف كان مرنا وصفها سابقا 25.

  1. ترنسفكأيشن
    1. البذور خلايا هيلا في مناطق ذات كثافة من 10 5 خلية / جيدا في لوحة 24-جيدا.
    2. بعد 24 ساعة، وشارك في بالنقل خلايا هيلا مع 1.5 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن وإما 100 نانوغرام من NR4A3 3 "UTRor SOX5 3 'UTR البلازميد، فضلا عن 20 نانومتر يحاكي ميرنا (هائل سعيد أنعم-مير 96-5p لSOX5 3217؛ UTR، وهائل سعيد أنعم-مير 7-5p، وهائل سعيد أنعم-مير 17-5p لNR4A3 3 'UTR على التوالي) لكل بئر.
    3. آبار المراقبة المشارك بالنقل مع NR4A3 3 "UTRor SOX5 3" UTRplasmid وتألقي المسمى الرناوات siRNAs السيطرة السلبية. ترنسفكأيشن من آبار المراقبة مع تألقي المسمى الرناوات siRNAs السيطرة السلبية يسمح تقييم كفاءة ترنسفكأيشن وحسابات لتقليد ميرنا 3'UTR ربط خصوصية.
  2. قياس المزدوج luciferase المراسل الأنشطة
    1. قياس اليراع وRenilla الأنشطة luciferase المراسل 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. إزالة نمو الخلايا المتوسطة.
    2. يعد حل العاملة I بإضافة 50 ميكرولتر من الركيزة I إلى 10 مل من الحل الأول؛ تخلط جيدا. إضافة 300 ميكرولتر من محلول العامل الأول في كل 24 أيضا.
    3. نقل محتويات كل 24 بشكل جيد في 3 آبار من 96 لوحة بيضاء، و 100 ميكرولتر لكل منهما. انتظر 10 دقيقة وقياس اليراع luciferase المراسل في مجموعة luminometer لاقتناء التلألؤ.
    4. إعداد solut العملأيون II بإضافة 50 ميكرولتر من الركيزة II إلى 10 مل من محلول الثاني؛ تخلط جيدا. إضافة 100 ميكرولتر من محلول العامل الأول في كل 96 جيدا تحتوي بالفعل 100 ميكرولتر من محلول العامل الأول.
    5. انتظر 10 دقيقة وقياس Renilla luciferase المراسل في مجموعة luminometer لاقتناء التلألؤ. حساب نسبة من التألق من يراعة luciferase إلى luciferase المراسل Renilla.

Representative Results

في الشكل رقم 1 هو تصور التحقيق النوعي والكمي لhNSC التمايز على السقالات 3D مقارنة مع الثقافات سطح مسطح التقليدية (2D) وexpressedas محور عصبي القياسات العملية ثمرة. في الشكل 2 هو representedthe سير العمل والنتائج لتقدير ميرنا باستخدام الخلايا الجذعية ومسارات تنموية تركز ميرنا PCR مجموعة للتحقيق في التعبير التفاضلية من miRNAs في 2D و 3D hNSCs متباينة مقارنة مع السيطرة غير متمايزة. وقد تم تحديد التالية ميرنا تحليل مقارن بين hNSCs المتباينة وغير متمايزة، والتحليل الحسابي للتنبؤ الهدف، SOX5 وNR4A3 (NOR1) كما من mRNAs الهدف المفترضة. لدراسة التفاعل المباشر بين miRNAs والموقع المفترض بهم على 3'UTR مرنا استخدمنا 2 متوفر تجاريا البلازميدات تحتوي إما SOX5 أو تسلسل NR4A3 3'UTR إدراج المصب من يراعة luciferase مراسل الجينات، وهو الثانية تحتوي في نفس بلازميد renilla luciferase المراسل الجيني للتطبيع. يتم تقديم نتائج ممثلة من 3 'UTR luciferase النشاط أسفل تنظيم في الشكل (3).

الشكل (1)
الشكل 1: تمايز hNSCs على السقالات 3D، وقياس ثمرة عملية محور عصبي وفاق (A) وبعد تلطيخ ICC القياسي لβ3 تويولين (الخضراء) ونوى counterstained مع هويشت (الأزرق) microphotographs تمثيلي تم الحصول عليها وكان قياس العمليات محور عصبي يقوم بمساعدة برمجيات تحليل الصور. (ب) رسم تخطيطي الإبلاغ عن قياس عملية محور عصبي ثمرة أجريت في 2D و 3D hNSCs متباينة ل1 (1W) أو 3 أسابيع (3W).كوم / الملفات / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
تم استخراج سير العمل التخطيطي التنميط ميرنا في hNSCs متباينة مجموع RNA، بما في ذلك miRNAs، إما من hNSCs متباينة على السقالات 3D والثقافات 2D القياسية، أو السيطرة غير متمايزة: الرقم 2. وكان 250 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع الرجعية كتب مع طريقة تسهل تحويل الانتقائي للmiRNAs ناضجة في [كدنا مناسبة لميرنا الكمي مع تمايز الخلايا البشرية والتنمية miScript ميرنا PCR مجموعة. تم استخدام متوسط-جغرافية للSNORD61، SNORD68، SNORD72، SNORD95، SNORD96A، وRNU6-2 لتحليل البيانات استنادا إلى طريقة 2 -ΔΔct. وقد تم تحديد تغييرات كبيرة كما +/- 1.5 طيها والتنظيم وصولا الى ستاحد كبير tistically. وقد تم تحليل البيانات باستخدام البرمجيات على شبكة الإنترنت متاحة في نتائج يتم التعبير باعتبارها clustergram. تعديل من الشكل (3) (19). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3: التحقق من صحة الهدف ميرنا وتوقع مرنا باستخدام مزدوج luciferase المراسل تقرير الفحص. (A) رسم تخطيطي ممثل المزدوج luciferase المراسل البلازميد مراسل استخدامها كأداة للتحقق من صحة تسلسل 3'UTR كهدف مباشر لميرنا. (ب) صورة مجهرية الممثل تظهر كفاءة ترنسفكأيشن. (C)   الإشارات، يعبر عنها luciferase النشاط النسبي، من الإنسان 3 & #وقد طرقت صحفيين UTR ofSOX5 وNR4A3 الجينات بشكل كبير بانخفاض في وجود هائل سعيد أنعم-مير-96، وهائل سعيد أنعم-مير 7 و 17 يحاكي ميرنا على التوالي؛ 39. تعديل من الشكل 5 19. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

<td> 0.94
DIANALAB PicTar TargetScan
ميرنا الجين المستهدف المواقع المستهدفة / الجينات وجدت دقة أحرز هدفا إجمالي P CT
هائل سعيد أنعم-مير-96 SOX5 1214/763 1 6.74
هائل سعيد أنعم-مير-183 DUSP10 302/190 0.72 4.75 0.85
هائل سعيد أنعم-مير 302a NR4A3 863/473 0.84 3.05 NF
هائل سعيد أنعم-مير 182 FOXN3 1358/794 0.94 NF 0.96
هائل سعيد أنعم-مير-7 NR4A3 NF NF 1.61 0.17
هائل سعيد أنعم-مير-7 FOXN3 399/136 0.17 NF 0.88
هائل سعيد أنعم-مير-20A NR4A3 1650/841 0.85 5.87 0.63
NR4A3 1955/973 0.9 5.87 0.63
هائل سعيد أنعم-مير-17 NR4A3 1928/961 0.9 5.38 0.63 + 0.37
هائل سعيد أنعم-مير-20A EIF4G3 1650/841 0.97 NF NF
هائل سعيد أنعم-مير 20B EIF4G3 1955/973 0.94 NF NF
هائل سعيد أنعم-مير-17 EIF4G3 1928/961 0.94 NF NF

الجدول 1: قائمة ميرنا من mRNAs التنبؤ الهدف. الجدول تمثيلي من miRNAs، تستهدف جينات التنبؤية، وتحليل الخوارزميات (التنبؤأيون / درجة / مجموع المباراتين المقدمة باستخدام مختبر ديانا، PicTar، وTargetScan على التوالي). تعديل من الجدول 3 19.

Discussion

وقد قدمت تطوير جديد في فحوصات المختبر لتقييم وتحسين تمايز الخلايا الجذعية دائما تحديا للتحقيق في وظائف وقدراتها العلاجية. على المدى الطويل ومرفق مستقر للhNSCs، اللازمة لتطوير 3D قوية التمايز في المختبر فحص، وقد وجهت عن طريق اختبار عدة ركائز 3D مع خصائص مختلفة من حيث المواد والهياكل. كجزء من تطوير فحص نحن أيضا تقييم الأمثل تركيز البذر الخلية وتحديد متطلبات السقالات أن laminin المغلفة. على الرغم من أن لدينا hNSCs يمكن التفريق بشكل عفوي على 4 OHT أظهرت وإزالة عامل النمو، وتنفيذ نظام الثقافة 3D تحسن كبير في القدرة على التمايز التي تقاس محور عصبي عملية ثمرة بالمقارنة مع 2D متباينة hNSCs القياسية.

للتحقيق في تأثير اح 3D يسببهاntiation على hNSC ميرنا التعبير كنا مجموعة PCR. مقارنة مع رقاقة ميكروأري معيار PCR مجموعة تقدم مزايا الكمي المباشر والتحقق من ميرنا من الفائدة. على الرغم من أن مجموعة PCR محدودة في المدى من إجمالي عدد ميرنا لكل صفيف، على سبيل المثال هنا في أقل من 96، فإنه يمكن أن تكون مصممة خصيصا لتشمل miRNAs من الفائدة، في حالتنا ذكرت سابقا في تطوير الخلايا الجذعية. وعرضت لمحة التعبير عن المسار تركز miRNAs في 3D و 2D hNSCs متباينة مقارنة مع hNSCs غير متمايزة. تم تحديد أهمها تنظيم أسفل miRNAs وتحليلها لتقييم من mRNAs الهدف المفترضة مع القصد من تحديد وظائفها والتفسير البيولوجي باستخدام خوارزميات المتاحة على الانترنت (معمل DIANA، PicTar، وTargetScans).

وهناك واحد ميرنا يمكن التعرف على مئات الأهداف، ولهذا السبب نحن التحقق من صحة التفاعلات ميرنا مع 3 'UTR mRNAsthat قد يكون المرشحين المناسبين فيتنظيم xonal. NR4A3، هدفا للهائل سعيد أنعم-مير-7، ومير 17 عائلة، وهو عضو من المستقبلات النووية الأسرة NR4A التي، اعتمادا على مستوى التعبير، وتشارك في التمايز، والبقاء على قيد الحياة، موت الخلايا المبرمج وتنظيم محور عصبي الحصين توجيه 26. وبالمثل SOX5، هدفا لهائل سعيد أنعم-مير-96، ويقال للسيطرة على تقدم دورة الخلية في الأسلاف العصبية 27 طول محور عصبي 28، والهجرة، والتمايز ما بعد الهجرة، والتوقعات من الخلايا العصبية (29). وقد تم تحديد كل من SOX5 وNR4A3 باعتباره مرنا هدفا مباشرا للهائل سعيد أنعم-مير-96، وهائل سعيد أنعم-مير 7 و 17 على التوالي من قبل المزدوجة المقايسات مراسل luciferase المراسل. luciferase المراسل المزدوج (اليراع وRenilla) يعتمد على اثنين من الجينات مراسل مختلفة في نفس بلازميد ويوفر نظام محسن السماح تطبيع للآثار الناجمة عن ترنسفكأيشن دون المستوى الأمثل والآثار السامة للخلايا مقارنة مع نظام بلازميد luciferase المراسل واحد. كجزء من التنمية فحص لدينا نحن أيضا لدينا الأمثل conditi ترنسفكأيشنإضافات من أجل الحصول على كفاءة عالية.

وprotocolsdescribed هنا يمكن استغلالها لزيادة تحسين وتميز في المختبر hNSC التمايز التي قد beimplemented بروتوكولات intransplantation للدراسات ما قبل السريرية والتطبيقات السريرية في المستقبل.

Disclosures

جميع الكتاب والعاملين، والأوراق المالية و / أو حاملي الأسهم في الخيار ReNeuron المحدودة أو الشركة الأم. وأيد هذه الدراسة من قبل ReNeuron (RENE.L).

Acknowledgments

ونحن نعترف جولي Heward لمساعدة في إعداد hNSCs، وLavaniya Thanabalasundaram لدعمها التقني مع هيلا زراعة وترنسفكأيشن.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM:F12 Invitrogen 21331-020 For RMM medium preparation
Human Albumin Solution  Baxter health care limited  1501052 For RMM medium used at a final concentration of  0.03%
Transferrin, Human recombinant Sigma T8158 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Putrescine DiHCl  Sigma P5780 For RMM medium used at a final concentration of  16.2 µg/ml
Insulin, Human recombinant   Sigma I9278 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Progesterone  Sigma P6149 For RMM medium used at a final concentration of  60 ng/ml
L-Glutamine  Invitrogen 25030-24 For RMM medium used at a final concentration of  2 mM
Sodium Selenite   Sigma S9133 For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml
bFGF      Peprotech AF-100-15 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml
EGF        Peprotech AF-100-188 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml
4-OHT Sigma H7904 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM
Laminin AMS Biotech 3400-010-10
TrypZean/EDTA Lonza  BE02-034E
Water for irrigation Baxter Healthcare UKF7114
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20°C) Invitrogen R007-100
Alvetex 12 well plate  Reinnervate Ltd AVP002
Ethanol  Merck  1.00986.1000
βIII tubulin antibody Sigma T8660
Hoechst Sigma B2261
miRNeasy mini kit Qiagen  217004
RNase free DNase  Qiagen  79254
Chloroform Sigma C7559-5VL
miScript II RT Kit  Qiagen  218160
SYBR green PCR kit Qiagen  218073
Cell Development & Differentiation miScript miRNA PCR Array Qiagen/ SABiosciences MIHS-103Z
Lightcycler 480 white 96 plate Roche  4729692001
Lightcycler 480  sealing foil Roche  4729757001
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
Vector NR4A3 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT019538-MT0
Vector SOX5 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT017632-MT01
Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen). Qiagen  1027284 MiRNA transfection control
Luc-Pair miR Luciferase Assay GeneCopeia LPFR-M010
Lightcycler 480  Roche
GloMax 96 microplate luminometer  Promega

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Falanga, V. Stem cells in tissue repair and regeneration. J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).
  2. Pollock, K., et al. A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke. Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).
  3. Hodges, H., et al. Making stem cell lines suitable for transplantation. Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).
  4. Smith, E. J., et al. Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke. Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).
  5. Stroemer, P., et al. The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion. Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).
  6. Kalladka, D., Muir, K. W. Brain repair: cell therapy in stroke. Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  8. Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
  9. Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 329-338 (2010).
  10. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Semin Cell Dev Biol. 13 (5), 377-383 (2002).
  11. Buxboim, A., Discher, D. E. Stem cells feel the difference. Nat Methods. 7 (9), 695-697 (2010).
  12. Li, W. J., et al. A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 26 (6), 599-609 (2005).
  13. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  14. Ortinau, S., et al. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed Eng Online. 9 (1), 70 (2010).
  15. Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. Designing synthetic materials to control stem cell phenotype. Curr Opin Chem Biol. 11 (4), 381-387 (1016).
  16. Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture. Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).
  17. Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity. J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).
  18. Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).
  19. Stevanato, L., Sinden, J. D. The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 49 (2014).
  20. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
  21. Chen, K., Rajewsky, N. Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data. Nat Genet. 38 (12), 1452-1456 (2006).
  22. Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
  23. Maragkakis, M., et al. Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels. BMC Bioinformatics. 10, 295 (2009).
  24. Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell. 120 (1), 15-20 (2005).
  25. Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells. J Vis Exp. (55), (2011).
  26. Ponnio, T., Conneely, O. M. nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility. Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).
  27. Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway. EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).
  28. Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).
  29. Lai, T., et al. SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes. Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 98، الصف السريرية الخلايا الجذعية العصبية، ميرنا التنميط والآثار، في المختبر التمايز، ثلاثة ثقافة الأبعاد
التمايز من العصبية البشرية خط الخلايا الجذعية على الثقافات الثلاث الأبعاد، تحليل الجينات الرنا الميكروي، واعتبارا الهدف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stevanato, L., Hicks, C., Sinden, J. … More

Stevanato, L., Hicks, C., Sinden, J. D. Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes. J. Vis. Exp. (98), e52410, doi:10.3791/52410 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter