Abstract
Neurale stamceller (NSC) er i stand til selv-fornyelse og differentiering til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter under særlige lokale mikromiljøer. Herinde, præsenterer vi en række metoder til tredimensional (3D) differentiering og miRNA-analyse af en klonal humane neurale stamceller (hNSC) linje, der i øjeblikket i kliniske forsøg for slagtilfælde handicap (NCT01151124 og NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs blev afledt fra et etisk godkendt første trimester human føtal cortex og betinget udødeliggjort hjælp retroviral integration af en enkelt kopi af c-mycER TAM konstruere. Vi beskriver, hvordan man måler axon proces udvækst af hNSCs differentierede på 3D stilladser og hvordan at kvantificere tilhørende ændringer i miRNA-ekspression ved hjælp af PCR array. Derudover eksemplificerer vi beregningsanalyse med henblik på at udvælge miRNA formodede mål. SOX5 og NR4A3 blev identificeret som egnet miRNA formodede mål for udvalgte markant nedregulereU-miRNA i differentieret hNSC. Mirna målvalidering blev udført på SOX5 og NR4A3 3'UTRs ved dobbelt reporterplasmidet transfektion og dobbelt luciferaseassayet.
Introduction
Stamcelleforskning spiller en central rolle i regenerativ medicin, som også strækker sig over disciplinerne tissue engineering, udviklingsmæssige cellebiologi, cellulære Therapeutics, genterapi og biomaterialer (stilladser og matricer). Stamceller er vigtige i både orgel udviklingog væv reparation; forstå, hvordan stamceller fungerer, er afgørende for at udvikle nye stamcelle baserede behandlinger 1. CTX0E03 er en klonal, betinget udødeliggjort human neural stamcelle (hNSC) linje 2 isoleret fra første trimester human føtal cortex. CTX0E03 har defineret kvalitetsegenskaber, der er afgørende for klinisk celle bank under god fremstillingspraksis (GMP) 3. HNSCs kan spontant differentiere til neuroner, glia, og oligodendrocytter og har vist sig at forbedre neurologiske underskud, når transplanteret i en gnaver-model af fokal iskæmi 2,4,5. Den CTX0E03 hNSCs er i øjeblikket i kliniske forsøg for slagtilfælde disability (NCT01151124 6 og NCT02117635, Clinicaltrials.gov).
MiRNA har en gennemsnitlig 22 nukleotider i længden og har vist regulatoriske molekyler 7, behøver de ikke koder for proteiner, men snarere binder 3 prime utranslaterede region (3'UTR) af mRNA'er, regulering deres stabilitet og translation i proteiner. MiRNA er rapporteret til at deltage i reguleringen af en række cellulære processer, herunder udvikling, proliferation og differentiering 8. Flere miRNA har været impliceret i reguleringen skæbne og specifikation af neurale stamceller 9.
I todimensionale (2D) standard kultur miljø kompleksiteten af in vivo miljø ikke matches, og dermed induktion og regulering af hNSC differentiering er ikke optimal. In vivo celler omgivet af en tredimensional (3D) mikromiljø komponeret af andre celler og ekstracellulære ligander, herunder mangetyper af collagener, laminin og andre matrixproteiner (ekstracellulær matrix, ECM). Tidligere undersøgelser har rapporteret, at den arkitektoniske topografi materialerne efterligner ECM'er og deres geometri indflydelse cellefænotype og skæbne 10-15. Et antal kommercielt tilgængelige 3D stilladser er til rådighed; brugte vi en meget porøs polystyren stillads manipuleret med en veldefineret og ensartet arkitektur til en 200 um tyk membran, som tilvejebringer et 3D-rum, i hvilket celler kan invadere og differentiere 16-18.
Heri 2D og 3D differentiering assays anvendes til at vurdere axonprocess udvækst. Desuden beskriver vi en metode til at profilere miRNA udtryk for en klinisk kvalitet hNSC linje for yderligere at undersøge miRNA virkninger på sin differentiering. Metoderne i her illustrerede, er baseret på dem, der oprindeligt er beskrevet i 19.
Protocol
1. HNSC differentiering om Three Dimensional (3D) Kultur
BEMÆRK: Isoler og udlede hNSCs, fra et etisk godkendt væv, der er beskrevet i en tidligere publikation 2. Følg de etiske og institutionelle retningslinier mens efter denne procedure.
1.1) 3D kultur under anvendelse af 12 brønde
- Brug aseptisk teknik under hele proceduren. I et biologisk sikkerhedsskab, re-hydrat stilladser ved tilsætning af 2 ml / brønd af 70% ethanol fremstillet ved anvendelse af vand til vanding (WFIr). Undgå at berøre stilladser ved dispensering af 70% ethanol ned væg hver brønd.
- Aspirere forsigtigt 70% ethanol og vaske stilladser med 2 ml / brønd DMEM: F12 i 1 min. Gentag vaskeproceduren to gange. Aspireres forsigtigt DMEM: F12 efter den sidste vask.
- Coat scaffolds ved tilsætning af 2 ml / brønd af laminin (10 ug / ml) i DMEM: F12. Inkubér pladen ved 37 ° C i en 5% CO 2 humidified inkubator i minimum 2 timer. Vask plade med varmt DMEM: F12.
- Seed hver stillads med ca. 500.000 hNSCs i et volumen på 150 pi risikohåndteringsforanstaltninger + GFS.
- Inkubér pladen i 3 timer ved 37 ° C i en 5% CO 2 befugtet inkubator for at tillade celler at løse i skeletterne.
- Tilføj 3,5 ml RMM til hver brønd pas på ikke at fjerne celler fra stilladser.
- Inkubér pladen i 7 dage; erstatte RMM medium (3,5 ml / brønd) efter 1 dag (første fodring) og igen efter 2-3 dage efter den første fodring.
- Efter 7 dage fjernes medium og løse celler med 4% paraformaldehyd (PFA) for immuncytokemi (ICC) eller tilsæt 500 pl / brønd af lysis reagens for total RNA-ekstraktion (butik plade ved ≤ -80 ° C eller videre til total RNA-ekstraktion) .
1.2) Måling af Axon Process Udvækst
- Farv 4% PFA fast differentierede hNSCs efter en standard ICC-protokol 20, under anvendelse af β3-tubulin (TUBB3) primært antistof påvist med et fluorokrom-konjugeret sekundært antistof. Kontrastfarve cellekerner med Hoechst (1 uM).
- Capture repræsentative billeder af β3-tubulin farvede celler ved hjælp af en fluorescerende mikroskop; gemme billeder som tiff eller jpeg. Måling af axon proces udvækst ved hjælp af en software-måleværktøj (f.eks Image-Pro Plus).
- Åbn billedet ved at vælge målinger indstilling i værktøjslinjen, og vælg spor funktion.
- Hvis du vil starte optagelsen, skal du vælge startpunktet på Axon udvækst ved at klikke på musen. Spore langs hele længden af axon-udvækst; højreklik for at afslutte hvert spor. Gentag for at måle alle Axon outgrowthswith i synsfeltet.
- Hurtig målinger som pixels eller pm (indtil kalibrering oprettet). Export længde målinger til et regneark for prøve komparativ og statistisk analyse.
2. Mirna Expression Ved hjælp af en stamceller ogUdviklingsveje Fokuseret miRNA PCR Array
2.1) miRNA total RNA-ekstraktion
- Udfør miRNA udvinding på stilladser og 2D dyrket prøver (differentieret og udifferentieret, hNSC kontrol).
- Optø stilladser, indsat i en 12 brønds plade, hvis det kræves. Kombiner lysereagens indhold (500 pi) 2 brønde i den samme 1,5 ml Eppendorf-rør, slutvolumen 1 ml Lysis reagens. Pas at forlade stilladset i brønden.
- For tidligere indsamlede som tørre celle pelleteret 2D dyrket prøver (differentierede hNSC 2D kulturer og udifferentieret kontrol) tilsættes 1 ml lysis reagens og overføre indhold i 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Homogeniser hver prøve ved hjælp af en 1 ml sprøjte og en kort 20 til 25 gauge nål. Før lysatet gennem nålen ved hjælp af en 1 ml sprøjte op til 5 gange, indtil en homogen lysat er opnået.
- Tilsæt 200 pi af chloroform til hver Eppendorf-rør og hætten sikkert. Inverter og vortexrør tilblande indholdet.
- Centrifuger hvert 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende homogenat i 15 minutter ved ≥12,000 x g.
- Den øvre vandige fase af hver prøve overføres (undgå at overføre enhver interfase, lyserød væske) til et frisk 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 750 pi 100% ethanol. Bland grundigt ved at vende.
- Pipette op til 700 pi af hver prøve, herunder eventuelt bundfald, i en mini-søjle i en 2 ml opsamlingsrør. Luk låget og centrifugeres ved ≥8,000 xg for ca. 30 sekunder ved stuetemperatur. Kassér gennemstrømning. Gentag dette trin ved hjælp af resten af prøven.
- Udfør en DNA-fordøjelse i 15 min.
- Tilføj 700 pi buffer RWT til mini kolonne og centrifugeres i ca. 30 sek ved ≥8,000 x g. Kassér gennemstrømning.
- Vask mini kolonne ved tilsætning 500 pi buffer RPE og centrifugering i ca. 30 sek ved ≥8,000 x g. Kassér gennemstrømning. Gentag wash.Centrifuge på ≥12,000 xg i 1 min for at tørre membranen yderligere.
- Eluer total RNA i et 1,5 ml Eppendorf-rør ved tilsætning af 40 pi RNase-frit vand til mini søjlen og centrifugering i 1 min ved ≥8,000 x g. Måling af total RNA-koncentrationen ved hjælp af et passende spektrofotometer.
2.2) miRNA cDNA Preparation
- Forbered omvendt transkription mester mix. Hver prøve kræver 4 pi 5x miScript HiSpec buffer, 2 pi 10X nucleics mix, miScript 2 pi revers transkriptase mix.
- Alikvot 8 pi master mix i et PCR-rør, tilføje nødvendige mængde af total RNA (250 ng), og der tilsættes RNase-frit vand til et slutvolumen på 20 pi.
- Inkuber i 60 minutter ved 37 ° C.Incubate i 5 minutter ved 95 ° C for at inaktivere miScript revers transkriptase Mix.
- Tilsæt 200 pi RNase-frit vand til hver 20 pi reverse transkriptionsreaktion, opbevares ved -20 ° C, eller fortsætte med real-TImig PCR straks.
2.3) stamceller og udviklingsveje Fokuseret miRNA PCR Array
- Forbered PCR komponenter blanding i et 15 ml rør ved tilsætning af 1375 pi 2x SYBR green Master mix, 100 pi miRNA cDNA-fremstilling, 275 pi 10x miScript Universal Primer, og 1000 pi RNase-frit vand (totalt volumen 2.750 pi).
- Overførsel PCR-komponenter mix på en PCR-loading reservoir. Fjern forsigtigt den 96 brønde PCR vifte fra den forseglede pose.
- 25 pi PCR komponenter blanding til hver brønd af PCR array ved hjælp af en 8-kanals pipette, eller en 12-kanals pipette ved hjælp af kun 8 tips. Skift pipettespidser efter hver pipettering skridt for at undgå krydskontaminering mellem brøndene.
- Forseglingsplade med optisk selvklæbende film, og centrifugeres i 1 min ved 1000 xg ved stuetemperatur (15-25 ° C) for at fjerne bobler. Visuel kontrol pladen nedefra at sikre, at ingen bobler i brøndene.
- Anbring 96-brønds plade PCR array i realtid cycler.
- Program realtid cycler overensstemmelse: 1 cyklus ved 95 ° C i 10 min, og 45 cykler for 15 sekunder ved 95 ° C, og 1 min ved 60 ° C sat en enkelt (fluorescens dataindsamling).
- Eksporter de Ct-værdier for alle brønde til en tom Excel-regneark til brug med PCR Array Data Analysis Template Excel og web-baseret software.
BEMÆRK: Software er tilgængelig på www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php .
3. Computational Analyse for miRNA Target forudsigelse og Validering af Target mRNA'er ved Reporter plasmidtransfektion og Ddual Luciferase Assay.
3.1) Computational Analyse for miRNA Target Prediction
- Gennemse PicTar ( http://pictar.mdc-berlin.de/ ) 21, online tilgængelig algoritme til identifikation af miRNA målrette forudsigelse mRNA'er.
- Klik på "Klik her for PicTar forudsigelse på hvirveldyr". En ny side åbner.
- I den nye side, PicTar web interface, skal du vælge arter i rullemenuen og indsæt miRNA af interesse i miRNA ID kassen. Klik på Søg efter målene om miRNA.
- Overhold en liste over mål-mRNA klassificeret efter aPicTar score.
BEMÆRK: PicTar beregner en score afspejler sandsynligheden for, at en given UTR vil blive ramt af den valgte miRNA, og er baseret på frø komplementaritet, termodynamik og et kombinatorisk forudsigelse for fælles mål i sæt af co-udtrykte miRNA 22. - Ligeledes hente listen over target mRNA ved hjælp DIANA-LAB ( http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/ ) 23, og Targetscan ( http://www.targetscan.org/ ) 24, alternativ online tilgængelige algoritmer.
- Udarbejde en sammenlignende oversigt over miRNAs baseret på ranking opnået ved hjælp af forskellige software-værktøjer. PicTar rangerer efter karakter, DianaLab med præcision (baseret på signal støjforhold og en præcision score til vurdering af betydningen af de forudsagte resultater), og Targetscan af samlet PCT (baseret på frø komplementaritet, termodynamisk frie bindingsenergi, bevaring løbet forskellige arter), se tabel 1.
3.2) Validering af Target mRNA'er ved Reporter plasmidtransfektion og Dual Luciferase Assay.
BEMÆRK: 3'UTR luciferase reportere til validering af mål-mRNA har været beskrevet tidligere 25.
- Transfektion
- Seed HeLa-celler ved en densitet på 10 5 celler / brønd i 24-brønds plade.
- Efter 24 timer, co-transficere HeLa-celler med 1,5 pi transfektionsreagens og enten 100 ng NR4A3 3'UTRor SOX5 3'UTR plasmid, samt 20 nM miRNA efterligner (HSA-MIR-96-5p for SOX5 3217; UTR, og HSA-MIR-7-5p, og HSA-MIR-17-5p for NR4A3 3'UTR henholdsvis) pr.
- Co-transfektion kontrolbrønde med NR4A3 3 'UTRor SOX5 3' UTRplasmid og fluorochrom mærket negative kontrol siRNA'er. Transfektion af kontrolbrønde med fluorochrom mærket negativ kontrol siRNA'er muliggør evaluering af transfektionseffektivitet og tegner sig for efterligne miRNA 3'UTR binder specificitet.
- Måling af Dual Luciferaseaktiviteter
- Mål Firefly og Renilla luciferaseaktiviteter 24 timer efter transfektion. Fjern cellevækstmedium.
- Forbered brugsopløsning I ved tilsætning af 50 pi substrat I i 10 ml af opløsning I; blandes grundigt. Tilføj 300 pi brugsopløsning jeg i hver 24 godt.
- Overfør indholdet af hver 24 brønde i 3 brønde i en 96 hvid plade, 100 pi hver. Vent 10 min og måle ildflueluciferase i luminometer sæt til luminescens erhvervelse.
- Forbered arbejdet solution II ved tilsætning af 50 pi substrat II i 10 ml opløsning II; blandes grundigt. Tilsæt 100 pi brugsopløsning jeg i hver 96 godt allerede indeholder 100 pi brugsopløsning I.
- Vent 10 min og måle Renilla luciferase i luminometer sæt til luminescens erhvervelse. Beregn forholdet af luminescens fra Firefly luciferase til Renilla-luciferase.
Representative Results
I figur 1 er visualiseret undersøgelsen og kvantificering af hNSC differentiering på 3D stilladser sammenlignet med traditionelle flade overflade kulturer (2D) og expressedas Axon proces udvækst målinger. I figur 2 er representedthe workflow og resultaterne for miRNA kvantificering ved hjælp af stamceller og udviklingsmæssige veje fokuseret miRNA PCR array til at undersøge forskellen udtryk for miRNA i 2D og 3D differentierede hNSCs sammenlignet med udifferentierede kontrol. Efter miRNA sammenlignende analyse mellem differentierede og udifferentierede hNSCs, og beregningsmæssige analyse for target forudsigelse, SOX5 og NR4A3 (NOR1) blev identificeret som formodede target mRNA. For at undersøge den direkte interaktion mellem miRNA og deres formodede site på 3'UTR mRNA vi brugte 2 kommercielt tilgængelige plasmider indeholdende enten SOX5 eller NR4A3 3'UTR-sekvens indsat nedstrøms for ildflue luciferase reporter gen, et nd indeholder i samme plasmid renilla luciferasegenet til normalisering. De repræsentative resultater af 3'UTR luciferaseaktivitet nedregulering er præsenteret i figur 3.
Figur 1:. Differentiering af hNSCs på 3D stilladser, og måling af axon proces es udvækst (A) Efter standard ICC farvning for β3-tubulin (grøn) og kerner modfarvet med Hoechst (blå) repræsentative mikrofotografier blev erhvervet og måling af Axon processer var udføres ved hjælp af en billedanalyse-software. (B) diagrammer rapportering måling af axon proces udvækst udført i 2D og 3D differentierede hNSCs for 1 (1W) eller 3 uger (3W).dk / filer / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2:. Skematisk workflow af miRNA profilering i differentierede hNSCs Total RNA, herunder miRNA, blev ekstraheret fra enten differentierede hNSCs på 3D stilladser og standard 2D kulturer eller udifferentieret kontrol. 250 ng af total RNA blev retro-transcriberet med en metode, der letter selektiv omdannelse af modne miRNA til cDNA egnet til miRNA kvantificering med celledifferentiering human og udvikling miScript miRNA PCR array. Den geo-gennemsnit af SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, og RNU6-2 blev anvendt til dataanalyse baseret på 2 -ΔΔct metoden. Væsentlige ændringer blev defineret som +/- 1,5 gange op og ned regulering til en statistically betydeligt omfang. Data blev analyseret ved anvendelse af web-baseret software til rådighed på Resultaterne udtrykkes som en clustergram. Modificeret fra Figur 3 19. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3: Validering af miRNA target forudsagt mRNA ved hjælp af en dobbelt luciferase rapport assay. (A) Repræsentant diagram af en dobbelt luciferasereporterplasmid bruges som et værktøj til at validere 3'UTR sekvens som et direkte mål for en miRNA. (B) repræsentant mikrograf viser transfektionseffektivitet. (C) Signaler, udtrykt som relativ luciferaseaktivitet fra human 3 & #39; UTR reportere ofSOX5 og NR4A3 generne blev væsentligt slået ned i nærværelse af HSA-miR-96, og HSA-miR-7 og 17 miRNA efterligner hhv. Modificeret fra figur 5 19. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| DIANALAB | PicTar | Targetscan | |||
| miRNA | Target-genet | Target sites / gener fundet | Precision | Score | Aggregate P CT |
| HSA-MIR-96 | SOX5 | 1214/763 | 1 | 6,74 | <td> 0,94|
| HSA-MIR-183 | DUSP10 | 302/190 | 0,72 | 4.75 | 0,85 |
| HSA-MIR-302a | NR4A3 | 863/473 | 0,84 | 3.05 | NF |
| HSA-MIR-182 | FOXN3 | 1358/794 | 0,94 | NF | 0,96 |
| HSA-MIR-7 | NR4A3 | NF | NF | 1,61 | 0,17 |
| HSA-MIR-7 | FOXN3 | 399/136 | 0,17 | NF | 0,88 |
| HSA-MIR-20a | NR4A3 | 1650/841 | 0,85 | 5,87 | 0,63 |
| NR4A3 | 1955/973 | 0,9 | 5,87 | 0,63 | |
| HSA-MIR-17 | NR4A3 | 1928/961 | 0,9 | 5.38 | 0,63 + 0,37 |
| HSA-MIR-20a | EIF4G3 | 1650/841 | 0,97 | NF | NF |
| HSA-miR-20b | EIF4G3 | 1955/973 | 0,94 | NF | NF |
| HSA-MIR-17 | EIF4G3 | 1928/961 | 0,94 | NF | NF |
Tabel 1: Liste over miRNA target forudsigelse mRNA. Repræsentant bord af miRNA, målrette prædiktive gener, og algoritmer analyse (forudsigeion / score / aggregat leveres ved hjælp af Diana Lab, PicTar og Targetscan henholdsvis). Modificeret fra tabel 3 19.
Discussion
Udviklingen af nye in vitro assays til at vurdere og forbedre differentieringen af stamceller har altid været en udfordring for undersøgelse af deres funktioner og terapeutiske kapaciteter. Langsigtet og stabil fastgørelse af hNSCs, der kræves for at udvikle en robust 3D in vitro differentiering assay blev behandlet ved at teste flere 3D-substrater med forskellige karakteristika i sigt af materialer og konstruktioner. Som en del af analysen udvikling, vi også vurderet optimal celle seeding koncentration og identificerede kravet til stilladser skal laminin belagt. Selv om vores hNSCs spontant kan differentiere på 4-OHT og vækstfaktor fjernelse, gennemførelse af en 3D-dyrkningssystem viste en signifikant forbedring i deres differentiering kapacitet målt ved Axon proces udvækst i forhold til standard 2D differentieret hNSCs.
For at undersøge effekten af 3D induceret Forskelntiation på hNSC miRNA udtryk vi brugte en PCR array. Sammenlignet med standard chip microarray-PCR-antenne giver fordelene ved en direkte kvantificering og validering af miRNA af interesse. Selvom PCR array er begrænset på sigt af det samlede antal miRNA per array, for eksempel i her under 96, kan det være skræddersyet til specifikt omfatte miRNA af interesse, i vores tilfælde tidligere rapporteret i stamceller udvikling. Ekspressionen af pathway fokuseret miRNA blev profileret i 3D og 2D differentierede hNSCs sammenlignet med udifferentierede hNSCs. De mest markant ned-regulerede miRNA blev udvalgt og analyseret for at vurdere deres formodede target mRNA med den hensigt at bestemme deres funktionalitet og biologisk fortolkning ved hjælp af online tilgængelige algoritmer (DIANA Lab, PicTar og TargetScans).
En enkelt miRNA kan genkende hundredvis af mål og derfor vi validerede miRNA interaktioner med 3'UTR mRNAsthat kan være egnede kandidater i enxonal regulering. NR4A3, et mål for HSA-miR-7, og miR-17 familien, er medlem af NR4a familie nukleare receptorer, som, afhængigt af deres niveau af udtryk, der er involveret i differentiering, overlevelse, apoptose og regulering af hippocampus axon vejledning 26. Tilsvarende SOX5, et mål om HSA-miR-96, er rapporteret at styre cellecyklusprogression i neurale stamceller 27 Axon længde 28, migration, post-vandrende differentiering og fremskrivninger af neuroner 29. Både SOX5 og NR4A3 blev identificeret som et direkte mål mRNA af HSA-MIR-96, og HSA-MIR-7 og 17 ved dobbelt luciferase reporter assays. Dual luciferase (Firefly og Renilla) påberåbt sig to forskellige reportergener i samme plasmid og tilbyder et forbedret system tillader normalisering for virkninger forårsaget af suboptimal transfektion og cytotoksiske virkninger sammenlignet med en enkelt luciferase plasmid system. Som led i vores assay udvikling, vi også optimeret vores transfektion conditions for at opnå en høj effektivitet.
Den protocolsdescribed heri kan udnyttes til yderligere at optimere og karakterisere in vitro hNSC differentiering, som kan beimplemented intransplantation protokoller for prækliniske studier og fremtidige kliniske anvendelser.
Disclosures
Alle forfattere er medarbejdere, materiel og / eller aktieoptionsprogrammer indehavere i ReNeuron Ltd eller dets moderselskab. Denne undersøgelse blev støttet af ReNeuron (RENE.L).
Acknowledgments
Vi anerkender Julie Heward for at hjælpe i udarbejdelsen af hNSCs, og Lavaniya Thanabalasundaram for hendes teknisk support med HeLa dyrkning og transfektion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 21331-020 | For RMM medium preparation |
| Human Albumin Solution | Baxter health care limited | 1501052 | For RMM medium used at a final concentration of 0.03% |
| Transferrin, Human recombinant | Sigma | T8158 | For RMM medium used at a final concentration of 5 µg/ml |
| Putrescine DiHCl | Sigma | P5780 | For RMM medium used at a final concentration of 16.2 µg/ml |
| Insulin, Human recombinant | Sigma | I9278 | For RMM medium used at a final concentration of 5 µg/ml |
| Progesterone | Sigma | P6149 | For RMM medium used at a final concentration of 60 ng/ml |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-24 | For RMM medium used at a final concentration of 2 mM |
| Sodium Selenite | Sigma | S9133 | For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml |
| bFGF | Peprotech | AF-100-15 | To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-188 | To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml |
| 4-OHT | Sigma | H7904 | To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM |
| Laminin | AMS Biotech | 3400-010-10 | |
| TrypZean/EDTA | Lonza | BE02-034E | |
| Water for irrigation | Baxter Healthcare | UKF7114 | |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20°C) | Invitrogen | R007-100 | |
| Alvetex 12 well plate | Reinnervate Ltd | AVP002 | |
| Ethanol | Merck | 1.00986.1000 | |
| βIII tubulin antibody | Sigma | T8660 | |
| Hoechst | Sigma | B2261 | |
| miRNeasy mini kit | Qiagen | 217004 | |
| RNase free DNase | Qiagen | 79254 | |
| Chloroform | Sigma | C7559-5VL | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218160 | |
| SYBR green PCR kit | Qiagen | 218073 | |
| Cell Development & Differentiation miScript miRNA PCR Array | Qiagen/ SABiosciences | MIHS-103Z | |
| Lightcycler 480 white 96 plate | Roche | 4729692001 | |
| Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Vector NR4A3 miRNA 3' UTR target clones | GeneCopeia | HmiT019538-MT0 | |
| Vector SOX5 miRNA 3' UTR target clones | GeneCopeia | HmiT017632-MT01 | |
| Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen). | Qiagen | 1027284 | MiRNA transfection control |
| Luc-Pair miR Luciferase Assay | GeneCopeia | LPFR-M010 | |
| Lightcycler 480 | Roche | ||
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega |
References
- Falanga, V. Stem cells in tissue repair and regeneration. J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).
- Pollock, K., et al. A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke. Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).
- Hodges, H., et al. Making stem cell lines suitable for transplantation. Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).
- Smith, E. J., et al. Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke. Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).
- Stroemer, P., et al. The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion. Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).
- Kalladka, D., Muir, K. W. Brain repair: cell therapy in stroke. Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
- Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 329-338 (2010).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Semin Cell Dev Biol. 13 (5), 377-383 (2002).
- Buxboim, A., Discher, D. E. Stem cells feel the difference. Nat Methods. 7 (9), 695-697 (2010).
- Li, W. J., et al. A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 26 (6), 599-609 (2005).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Ortinau, S., et al. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed Eng Online. 9 (1), 70 (2010).
- Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. Designing synthetic materials to control stem cell phenotype. Curr Opin Chem Biol. 11 (4), 381-387 (1016).
- Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture. Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity. J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).
- Stevanato, L., Sinden, J. D. The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 49 (2014).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
- Chen, K., Rajewsky, N. Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data. Nat Genet. 38 (12), 1452-1456 (2006).
- Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
- Maragkakis, M., et al. Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels. BMC Bioinformatics. 10, 295 (2009).
- Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell. 120 (1), 15-20 (2005).
- Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells. J Vis Exp. (55), (2011).
- Ponnio, T., Conneely, O. M. nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility. Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).
- Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway. EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).
- Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).
- Lai, T., et al. SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes. Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).
