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Developmental Biology

तीन आयामी संस्कृति, MicroRNA का विश्लेषण और ख्यात लक्ष्य जीन पर एक मानव तंत्रिका स्टेम सेल लाइन के भेदभाव

Published: April 12, 2015 doi: 10.3791/52410
Automatic Translation
1, 1, 1
1ReNeuron

Abstract

तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) विशिष्ट स्थानीय microenvironments तहत न्यूरॉन्स, astrocytes और oligodendrocytes में आत्म नवीकरण और भेदभाव करने में सक्षम हैं। यहाँ में, हम वर्तमान में स्ट्रोक विकलांगता (NCT01151124 और NCT02117635, Clinicaltrials.gov) के लिए नैदानिक ​​परीक्षण में, तीन आयामी (3 डी) भेदभाव और एक प्रतिरूप मानव तंत्रिका स्टेम सेल (hNSC) लाइन की miRNA विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया तरीकों का एक सेट प्रस्तुत करते हैं। HNSCs एक नैतिक अनुमोदित पहली तिमाही के मानव भ्रूण कॉर्टेक्स से ली गई है और सशर्त निर्माण सी-mycER टैम की एक प्रति की रेट्रोवायरल एकीकरण का उपयोग कर अमर हो गया। हम 3 डी scaffolds और कैसे पीसीआर सरणी का उपयोग miRNA अभिव्यक्ति में एसोसिएटेड परिवर्तन यों पर भेदभाव hNSCs के अक्षतंतु प्रक्रिया परिणाम को मापने के लिए कैसे का वर्णन। इसके अलावा हम miRNA के ख्यात लक्ष्य का चयन करने के उद्देश्य से कम्प्यूटेशनल विश्लेषण उदाहरण देना। SOX5 और NR4A3 काफी चयनित की उपयुक्त miRNA के ख्यात लक्ष्य के रूप में पहचान की गई नीचे विनियमितविभेदित hNSC में डी miRNAs। Mirna लक्ष्य सत्यापन दोहरी संवाददाता प्लाज्मिड अभिकर्मक और दोहरी luciferase परख द्वारा SOX5 और NR4A3 3'UTRs पर प्रदर्शन किया गया था।

Introduction

स्टेम सेल अनुसंधान भी ऊतक इंजीनियरिंग, विकास कोशिका जीव विज्ञान, सेलुलर चिकित्सा विज्ञान, जीन थेरेपी के विषयों तक फैला है जो पुनर्योजी चिकित्सा, में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है, और biomaterials (scaffolds और Matrices)। स्टेम कोशिकाओं दोनों अंग developmentand ऊतकों की मरम्मत में महत्वपूर्ण हैं; स्टेम कोशिकाओं कैसे काम समझने नई स्टेम सेल आधारित उपचार एक के विकास के लिए निर्णायक है। CTX0E03 पहली तिमाही के मानव भ्रूण प्रांतस्था से अलग एक प्रतिरूप, सशर्त अमर मानव तंत्रिका स्टेम सेल (hNSC) पंक्ति 2 है। CTX0E03 अच्छा विनिर्माण प्रैक्टिस (जीएमपी) 3 के तहत नैदानिक ​​सेल बैंकिंग के लिए आवश्यक हैं कि गुणवत्ता विशेषताओं को परिभाषित किया गया है। HNSCs अनायास न्यूरॉन्स, glia, और oligodendrocytes में अंतर कर सकते हैं और फोकल ischemia के 2,4,5 के कृंतक मॉडल में प्रत्यारोपित जब न्यूरोलॉजिकल घाटा सुधारने के लिए सिद्ध किया गया है। CTX0E03 hNSCs स्ट्रोक disabil के लिए नैदानिक ​​परीक्षण में वर्तमान में कर रहे हैंअल्पसंख्यक (NCT01151124 6 और NCT02117635, Clinicaltrials.gov)।

MiRNAs लंबाई में एक औसत 22 न्यूक्लियोटाइड है और विनियामक अणुओं 7 साबित हो रहे हैं, वे प्रोटीन सांकेतिक शब्दों में नहीं है, बल्कि प्रोटीन में अपनी स्थिरता और अनुवाद को विनियमित करने, mRNAs का तीन प्रधानमंत्री untranslated क्षेत्र (3'UTR) बाँध। MiRNAs विकास, प्रसार, और भेदभाव 8 सहित सेलुलर प्रक्रियाओं के एक नंबर के नियमन में भाग लेने के लिए रिपोर्ट कर रहे हैं। कई miRNAs तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं 9 के भाग्य और विनिर्देश को विनियमित करने में फंसाया गया है।

मानक संस्कृति वातावरण दो आयामी (2 डी) में vivo वातावरण की जटिलता के अनुरूप नहीं है, और फलस्वरूप hNSC भेदभाव की प्रेरण और विनियमन इष्टतम नहीं है। में vivo, कोशिकाओं अन्य द्वारा रचित एक तीन आयामी (3 डी) microenvironment से घिरे रहे हैं कई सहित कोशिकाओं और बाह्य ligands के,कोलेजन, laminin, और अन्य मैट्रिक्स प्रोटीन (बाह्य मैट्रिक्स, ईसीएम) के प्रकार। पिछले अध्ययनों की सूचना दी है कि ECMs और उनके ज्यामिति प्रभाव सेल phenotype और भाग्य 10-15 नकल उतार सामग्री की स्थापत्य स्थलाकृति। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 3 डी scaffolds के एक संख्या में उपलब्ध हैं; हम कोशिकाओं पर आक्रमण और 16-18 अंतर कर सकते हैं जिसमें एक 3 डी अंतरिक्ष प्रदान करता है जो एक 200 माइक्रोन मोटी झिल्ली में एक अच्छी तरह से परिभाषित किया है और वर्दी वास्तुकला के साथ इंजीनियर एक अत्यंत झरझरा polystyrene के पाड़ प्रयोग किया जाता है।

इस के साथ साथ 2 डी और 3 डी भेदभाव assays के axonprocess परिणाम का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इसके अलावा, हम आगे अपनी भेदभाव पर miRNA के प्रभाव की जांच के लिए एक नैदानिक ​​ग्रेड hNSC लाइन की miRNA अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के लिए एक विधि का वर्णन। सचित्र यहाँ में तरीकों मूल रूप से 19 में वर्णित लोगों पर आधारित हैं।

Protocol

तीन आयामी (3 डी) संस्कृति पर 1. HNSC भेदभाव

नोट: अलग करने और पिछले एक प्रकाशन 2 में वर्णित एक नैतिक अनुमोदित ऊतक, से, hNSCs निकाले जाते हैं। इस प्रक्रिया का अनुसरण करते हुए नैतिक और संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन करें।

1.1) 3 डी संस्कृति 12 अच्छी तरह से थाली का प्रयोग

  1. प्रक्रिया के दौरान सड़न रोकनेवाला तकनीक का प्रयोग करें। एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, / अच्छी तरह से 70% इथेनॉल के 2 मिलीलीटर जोड़कर फिर से हाइड्रेट scaffolds के सिंचाई (WFIr) के लिए पानी का उपयोग कर तैयार है। अच्छी तरह से प्रत्येक की दीवार के नीचे 70% इथेनॉल के वितरण से scaffolds के छूने से बचें।
  2. ध्यान से 70% इथेनॉल महाप्राण और तुरंत 2 मिलीग्राम / अच्छी तरह DMEM के साथ scaffolds धो: 1 मिनट के लिए F12 के। दो बार धोने की प्रक्रिया को दोहराएं। ध्यान से DMEM के महाप्राण: F12 के अंतिम धोने के बाद।
  3. F12: DMEM में laminin की 2 मिलीग्राम / अच्छी तरह से (10 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) जोड़कर कोट scaffolds के। एक 5% सीओ 2 गुंजन में 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते2 घंटे की एक न्यूनतम के लिए idified इनक्यूबेटर। गर्म DMEM के साथ धो प्लेट: F12 के।
  4. आरएमएम + gfs के 150 μl की मात्रा में लगभग 500,000 hNSCs के साथ प्रत्येक पाड़ बीज।
  5. कोशिकाओं scaffolds के रूप में व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए थाली सेते हैं।
  6. Scaffolds के कोशिकाओं से बेदखल करने के लिए नहीं हर अच्छी तरह से देखभाल करने के लिए आरएमएम के 3.5 मिलीलीटर जोड़ें।
  7. 7 दिनों के लिए थाली सेते हैं; एक दिन (पहली खिला) के बाद (3.5 मिलीग्राम / अच्छी तरह से) और आरएमएम मध्यम जगह फिर से पहले खिलाने से 2-3 दिनों के बाद।
  8. सात दिनों के बाद, मध्यम हटाने और immunocytochemistry (आईसीसी) के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक करने या / अच्छी तरह से कुल शाही सेना निकासी के लिए सेल अभिकर्मक के 500 μl जोड़ने (≤ -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर थाली या कुल शाही सेना निकासी के लिए आगे बढ़ना) ।

एक्सोन प्रक्रिया परिणाम के 1.2) मापन

  1. 4% पीएफए ​​एक मानक आईसीसी प्रोटोकॉल 20 का उपयोग कर β के अनुसार अलग-अलग hNSCs तय दाग3-ट्यूबिलिन (TUBB3) एक fluorochrome संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ पाया प्राथमिक एंटीबॉडी। हेक्स्ट (1 माइक्रोन) के साथ Counterstain सेल नाभिक।
  2. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग β3 ट्यूबिलिन दाग कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों पर कब्जा; झगड़ा या JPEG के रूप में छवियों को बचाने के लिए। एक सॉफ्टवेयर माप उपकरण (उदाहरण के लिए छवि प्रो प्लस) का उपयोग अक्षतंतु प्रक्रिया परिणाम के उपाय।
  3. छवि, टूल बार में चुनिंदा माप विकल्प खुला, और ट्रेस सुविधा का चयन करें।
  4. ट्रेस शुरू करने के लिए, माउस बटन पर क्लिक करके अक्षतंतु परिणाम पर शुरू बिंदु का चयन करें। अक्षतंतु परिणाम की पूरी लंबाई के साथ ट्रेस; सही प्रत्येक ट्रेस खत्म करने के लिए क्लिक करें। देखने के क्षेत्र में सभी अक्षतंतु outgrowthswith को मापने के लिए दोहराएँ।
  5. पिक्सल या माइक्रोन (लंबित अंशांकन सेट अप) के रूप में माप व्यक्त करते हैं। नमूना तुलनात्मक और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम के लिए निर्यात लंबाई माप।

2. Mirna अभिव्यक्ति एक स्टेम कोशिकाओं का उपयोग औरविकासात्मक रास्ते फोकस्ड miRNA पीसीआर ऐरे

2.1) miRNA के कुल शाही सेना निकासी

  1. Scaffolds और 2 डी उगाया नमूनों पर miRNA के निष्कर्षण प्रदर्शन (भेदभाव और समान, hNSC नियंत्रण)।
  2. यदि जरूरी हुआ तो पिघलना scaffolds के लिए, एक 12 अच्छी तरह से थाली में डाला। अंतिम मात्रा Lysis अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर, एक ही 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में दो कुओं की सेल अभिकर्मक सामग्री (500 μl) गठबंधन। कुएं में पाड़ छोड़ने के लिए ध्यान रखना।
  3. पहले से एकत्र के रूप में सूखी सेल pelleted 2D उगाया नमूने (विभेदित hNSC 2D संस्कृतियों और समान नियंत्रण) के लिए सेल अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर जोड़ने और 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में सामग्री हस्तांतरण।
  4. 1 मिलीलीटर सिरिंज और एक छोटी 20-25 गेज सुई का उपयोग प्रत्येक परीक्षा नमूना homogenize। एक सजातीय lysate हासिल की है, जब तक एक एक मिलीलीटर 5 गुना तक सिरिंज का उपयोग कर सुई के माध्यम से lysate गुजरती हैं।
  5. प्रत्येक Eppendorf ट्यूब को क्लोरोफॉर्म के 200 μl जोड़ें और सुरक्षित रूप से टोपी। पलटना और भंवर ट्यूबों के लिएसामग्री मिश्रण।
  6. अपकेंद्रित्र ≥12,000 x जी पर 15 मिनट के लिए प्रत्येक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब युक्त homogenate।
  7. 100% इथेनॉल के 750 μl युक्त एक ताजा 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब (किसी Interphase, गुलाबी रंग का तरल के हस्तांतरण से बचने) प्रत्येक नमूने के ऊपरी जलीय चरण हस्तांतरण। उलटा द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  8. एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में एक मिनी स्तंभ में, किसी भी वेग सहित प्रत्येक परीक्षा नमूना के 700 μl, अप करने के लिए पिपेट। कमरे के तापमान पर लगभग 30 सेकंड के लिए ≥8,000 XG पर ढक्कन और सेंट्रीफ्यूज को बंद करें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें। नमूना के शेष का उपयोग करते हुए इस चरण को दोहराएँ।
  9. 15 मिनट के लिए एक डीएनए डाइजेस्ट प्रदर्शन करते हैं।
  10. ≥8,000 x जी पर लगभग 30 सेकंड के लिए मिनी स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज के लिए 700 μl बफर RWT जोड़ें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  11. 500 μl बफर RPE जोड़ने और ≥8,000 x जी पर लगभग 30 सेकंड के लिए centrifuging द्वारा मिनी स्तंभ धो लें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें। दोहराएँ wash.Ceएक मिनट के लिए ≥12,000 XG पर ntrifuge आगे झिल्ली सुखाने के लिए।
  12. मिनी स्तंभ के लिए RNase मुक्त पानी के 40 μl जोड़ने और ≥8,000 x जी पर 1 मिनट के लिए centrifuging द्वारा एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में कुल शाही सेना elute। एक उपयुक्त स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की सहायता से कुल शाही सेना एकाग्रता उपाय।

2.2) miRNA सीडीएनए तैयारी

  1. रिवर्स प्रतिलेखन मास्टर मिश्रण तैयार करें। प्रत्येक नमूना 5x miScript HiSpec बफर के 4 μl, 10x nucleics मिश्रण के 2 μl की आवश्यकता है, 2 μl ट्रांसक्रिपटेस मिश्रण रिवर्स miScript।
  2. एक पीसीआर ट्यूब में मास्टर मिश्रण के विभाज्य 8 μl, कुल शाही सेना (250 एनजी) की आवश्यक मात्रा जोड़ने के लिए, और 20 μl की अंतिम मात्रा को RNase मुक्त पानी जोड़ें।
  3. MiScript रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस मिक्स निष्क्रिय करने के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 37 डिग्री C.Incubate पर 60 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. -20 डिग्री सेल्सियस पर, प्रत्येक 20 μl रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए दुकान में 200 μl RNase मुक्त पानी जोड़ें, या असली तिवारी के साथ आगे बढ़नामुझे तुरंत पीसीआर।

2.3) स्टेम सेल और विकासात्मक रास्ते miRNA पीसीआर ऐरे केंद्रित

  1. 2x SYBR ग्रीन मास्टर मिश्रण के 1375 μl, 100 μl miRNA सीडीएनए तैयारी, 10x miScript यूनिवर्सल प्राइमर के 275 μl, और RNase मुक्त पानी (कुल मात्रा 2750 μl) के 1000 μl जोड़कर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में पीसीआर घटकों मिश्रण तैयार करें।
  2. एक पीसीआर लोड हो रहा है जलाशय पर पीसीआर घटकों मिश्रण स्थानांतरण। ध्यान से अपनी सील बैग से 96 अच्छी तरह से थाली पीसीआर सरणी हटा दें।
  3. एक 8 चैनल pipettor का, या केवल 8 टिप्स का उपयोग कर एक 12-चैनल pipettor का उपयोग पीसीआर सरणी के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 25 μl पीसीआर घटकों मिश्रण जोड़ें। कुओं के बीच पार संक्रमण से बचने के लिए प्रत्येक pipetting के कदम के बाद pipet सुझावों को बदलें।
  4. बुलबुले को दूर करने के लिए कमरे के तापमान (15-25 डिग्री सेल्सियस) पर 1000 XG पर 1 मिनट के लिए ऑप्टिकल चिपकने वाली फिल्म के साथ थाली, और अपकेंद्रित्र सील। दिखने में कोई बुलबुले कुओं में मौजूद हैं सुनिश्चित करने के लिए नीचे से थाली का निरीक्षण किया।
  5. वास्तविक समय cycler में 96 अच्छी तरह से थाली पीसीआर सरणी रखें।
  6. कार्यक्रम तदनुसार वास्तविक समय Cycler: 10 मिनट और 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड के लिए 45 चक्र, और 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक चक्र एक एकल (प्रतिदीप्ति डेटा संग्रह) की स्थापना की।
  7. पीसीआर सरणी डेटा विश्लेषण खाका एक्सेल और वेब आधारित सॉफ्टवेयर के साथ प्रयोग के लिए एक खाली एक्सेल स्प्रेडशीट के लिए सभी कुओं के लिए सीटी मूल्यों में निर्यात करें।
    नोट: सॉफ्टवेयर पर उपलब्ध है www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php ।

3. कम्प्यूटेशनल विश्लेषण miRNA लक्ष्य भविष्यवाणी के लिए और लक्ष्य mRNAs का मान्यकरण रिपोर्टर प्लाज्मिड अभिकर्मक और Ddual luciferase परख द्वारा।

3.1) miRNA लक्ष्य भविष्यवाणी के लिए कम्प्यूटेशनल विश्लेषण

  1. ब्राउज़ PicTar ( http://pictar.mdc-berlin.de/ ) 21, मीर की पहचान के लिए ऑनलाइन उपलब्ध एल्गोरिथ्मएनए भविष्यवाणी mRNAs लक्ष्य।
  2. "रीढ़ पर PicTar भविष्यवाणी के लिए यहाँ क्लिक करें" पर क्लिक करें। एक नया पेज खुलेगा।
  3. नया पृष्ठ, PicTar वेब अंतरफलक में, ड्रॉप डाउन मेनू में प्रजातियों का चयन करें और miRNA ID बॉक्स में ब्याज की miRNA डालें। एक miRNA के लक्ष्यों के लिए खोज पर क्लिक करें।
  4. APicTar स्कोर द्वारा क्रम लक्ष्य mRNAs की एक सूची को ध्यान से देखें।
    नोट: PicTar एक दिया UTR से चयनित miRNA द्वारा लक्षित, और बीज पूरकता, ऊष्मा और सह व्यक्त miRNAs 22 के सेट में आम लक्ष्यों के लिए एक मिश्रित भविष्यवाणी के आधार पर किया जाएगा कि संभावना को दर्शाती एक स्कोर गणना करता है।
  5. इसी प्रकार डायना-प्रयोगशाला (का उपयोग कर लक्ष्य mRNAs की सूची प्राप्त http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/ ) 23, और TargetScan ( http://www.targetscan.org/ उपलब्ध लाइन पर) 24, वैकल्पिक एल्गोरिदम।
  6. एम की एक तुलनात्मक तालिका संकलित करेंiRNAs विभिन्न सॉफ्टवेयर उपकरण का उपयोग कर प्राप्त रैंकिंग के आधार पर। PicTar कुल पीसीटी द्वारा, और TargetScan (शोर अनुपात और भविष्यवाणी परिणामों के महत्व के मूल्यांकन के लिए एक सटीक स्कोर करने के लिए संकेत के आधार पर) परिशुद्धता से स्कोर, DianaLab द्वारा रैंकों (बीज पूरकता, बंधन के thermodynamic मुक्त ऊर्जा, संरक्षण पर आधारित विभिन्न प्रजातियों), 1 टेबल देखें।

रिपोर्टर प्लाज्मिड अभिकर्मक और दोहरी luciferase परख द्वारा लक्ष्य mRNAs का 3.2) मान्यकरण।

नोट: mRNA के लिए किया गया है लक्ष्य की मान्यता के लिए 3 'UTR luciferase संवाददाताओं को पहले 25 में वर्णित है।

  1. अभिकर्मक
    1. / अच्छी तरह से 24 अच्छी तरह से थाली में 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर बीज हेला कोशिकाओं।
    2. अभिकर्मक अभिकर्मक और NR4A3 3 'UTRor SOX5 3' UTR प्लाज्मिड के 100 एनजी या तो 1.5 μl है, साथ ही 20 एनएम miRNA mimics (SOX5 3 के लिए HSA-मीर 96-5p के साथ 24 घंटा, सह transfect हेला कोशिकाओं के बाद217; अच्छी तरह से प्रति UTR से, और HSA-मीर 7-5p, और क्रमशः NR4A3 3 'UTR के लिए HSA-मीर 17-5p)।
    3. NR4A3 3 'UTRor SOX5 3' UTRplasmid और fluorochrome के लेबल वाले नकारात्मक नियंत्रण siRNAs के साथ सह-transfect नियंत्रण कुओं। fluorochrome के लेबल वाले नकारात्मक नियंत्रण siRNAs के साथ नियंत्रण कुओं के अभिकर्मक अभिकर्मक दक्षता के मूल्यांकन की अनुमति देता है और नकल miRNA 3'UTR बाँध विशिष्टता के लिए खातों।
  2. दोहरी luciferase क्रियाएँ का मापन
    1. जुगनू और Renilla luciferase गतिविधियों के 24 घंटे बाद अभिकर्मक उपाय। सेल के विकास मध्यम निकालें।
    2. 10 समाधान मैं मिलीलीटर में सब्सट्रेट मैं के 50 μl जोड़कर समाधान मैं काम कर तैयार करें; अच्छी तरह से मिश्रण। मैं अच्छी तरह से प्रत्येक 24 में काम कर समाधान के 300 μl जोड़ें।
    3. अच्छी तरह से एक 96 सफेद प्लेट के तीन कुओं, प्रत्येक μl 100 में प्रत्येक 24 की सामग्री को स्थानांतरित। 10 मिनट रुको और luminescence अधिग्रहण के लिए luminometer सेट में जुगनू luciferase उपाय।
    4. काम कर solut तैयार करेंआयन द्वितीय समाधान द्वितीय के 10 एमएल में सब्सट्रेट द्वितीय के 50 μl जोड़कर; अच्छी तरह से मिश्रण। पहले से ही काम कर समाधान आई के 100 μl युक्त प्रत्येक 96 कुएं में काम कर समाधान मैं के 100 μl जोड़ें
    5. 10 मिनट रुको और luminescence अधिग्रहण के लिए luminometer सेट में Renilla luciferase उपाय। Renilla luciferase को जुगनू luciferase से luminescence के अनुपात की गणना।

Representative Results

चित्र 1 में पारंपरिक फ्लैट सतह संस्कृतियों (2 डी) के साथ तुलना में 3 डी scaffolds पर hNSC भेदभाव की जांच और मात्रा का ठहराव कल्पना और अक्षतंतु प्रक्रिया परिणाम माप expressedas है। चित्रा 2 में representedthe कार्यप्रवाह और स्टेम कोशिकाओं का उपयोग miRNA मात्रा का ठहराव के लिए परिणाम है और विकास के रास्ते समान नियंत्रण के साथ तुलना में 2 डी और 3 डी विभेदित hNSCs में miRNAs की अंतर अभिव्यक्ति की जांच के लिए miRNA पीसीआर सरणी ध्यान केंद्रित किया। विभेदित और समान hNSCs, और लक्ष्य भविष्यवाणी, SOX5 और NR4A3 (NOR1) के लिए कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के बीच निम्न miRNA के तुलनात्मक विश्लेषण ख्यात लक्ष्य mRNAs के रूप में पहचान की गई। MiRNAs और हम SOX5 या NR4A3 3'UTR अनुक्रम या तो युक्त दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लास्मिड जुगनू luciferase रिपोर्टर जीन के बहाव डाला इस्तेमाल किया 3'UTR mRNA के, पर उनके ख्यात साइट के बीच सीधी बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक एन डी सामान्य बनाने के लिए एक ही प्लाज्मिड renilla luciferase जीन में से युक्त। 3 'UTR luciferase गतिविधि नीचे विनियमन के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3 में प्रस्तुत किया है।

चित्र 1
चित्रा 1:। 3 डी scaffolds पर hNSCs के भेदभाव, और अक्षतंतु प्रक्रिया तों परिणाम की माप (ए) β3 ट्यूबिलिन (हरा) और Hoechst (नीला) प्रतिनिधि microphotographs साथ counterstained नाभिक के लिए मानक आईसीसी धुंधला के बाद हासिल किया गया और अक्षतंतु प्रक्रियाओं की माप थे एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर की सहायता से प्रदर्शन किया। (बी) 1 (1W) या तीन सप्ताह (3W) के लिए 2 डी और 3 डी विभेदित hNSCs में प्रदर्शन अक्षतंतु प्रक्रिया परिणाम की माप रिपोर्टिंग चित्र।कॉम / फ़ाइलें / ftp_upload / 52,410 / 52410fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। विभेदित hNSCs में miRNA रूपरेखा के योजनाबद्ध कार्यप्रवाह कुल शाही सेना, miRNAs सहित 3 डी scaffolds और मानक 2D संस्कृतियों, या undifferentiated नियंत्रण पर विभेदित hNSCs तो से निकाला गया था। कुल शाही सेना के 250 एनजी रेट्रो लिखित मानव सेल भेदभाव और विकास miScript miRNA पीसीआर सरणी के साथ miRNA मात्रा का ठहराव के लिए उपयुक्त सीडीएनए में परिपक्व miRNAs की चयनात्मक रूपांतरण की सुविधा है कि एक विधि के साथ थे। SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, और RNU6-2 की भू-मतलब दो -ΔΔct पद्धति पर आधारित डेटा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था। महत्वपूर्ण परिवर्तन एक स्टेशन को गुना +/- 1.5 और नीचे विनियमन के रूप में परिभाषित किया गयाtistically महत्वपूर्ण हद तक। डाटा एक clustergram के रूप में व्यक्त कर रहे हैं परिणामों पर उपलब्ध वेब आधारित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। चित्रा 3 19 से संशोधित। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: miRNA लक्ष्य के मान्यकरण एक दोहरी luciferase रिपोर्ट परख का उपयोग mRNA की भविष्यवाणी की। (ए) एक miRNA के एक सीधा लक्ष्य के रूप में 3'UTR अनुक्रम मान्य करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल एक दोहरी luciferase संवाददाता प्लाज्मिड के प्रतिनिधि आरेख। (बी) अभिकर्मक दक्षता दिखा प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ। (सी)   सिग्नल, मानव 3 & # से, रिश्तेदार luciferase गतिविधि के रूप में व्यक्त39; UTR संवाददाताओं ofSOX5 और NR4A3 जीन काफी HSA-मीर 96 की उपस्थिति में नीचे गिरा दिया गया था, और HSA-मीर 7 और 17 miRNA mimics क्रमशः। चित्रा 5 19 से संशोधित। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

<टीडी> 0.94
DIANALAB PicTar TargetScan
miRNA लक्ष्य जीन लक्ष्य साइटों / जीन पाया शुद्धता स्कोर सकल पी सीटी
HSA-मीर 96 SOX5 1214/763 1 6.74
HSA-मीर 183 DUSP10 302/190 0.72 4.75 0.85
HSA-मीर 302a NR4A3 863/473 0.84 3.05 एनएफ
HSA-मीर 182 FOXN3 1358/794 0.94 एनएफ 0.96
HSA-मीर 7 NR4A3 एनएफ एनएफ 1.61 0.17
HSA-मीर 7 FOXN3 399/136 0.17 एनएफ 0.88
HSA-मीर-20A NR4A3 1650/841 0.85 5.87 0.63
NR4A3 1955/973 0.9 5.87 0.63
HSA-मीर 17 NR4A3 1928/961 0.9 5.38 0.63 + 0.37
HSA-मीर-20A EIF4G3 1650/841 0.97 एनएफ एनएफ
HSA-मीर 20B EIF4G3 1955/973 0.94 एनएफ एनएफ
HSA-मीर 17 EIF4G3 1928/961 0.94 एनएफ एनएफ

तालिका 1: miRNA लक्ष्य भविष्यवाणी mRNAs की सूची। MiRNAs की प्रतिनिधि मेज, भविष्य कहनेवाला जीनों को लक्ष्य बनाते हैं, और एल्गोरिदम विश्लेषण (भविष्यवाणीआयन / स्कोर / कुल क्रमश: डायना लैब, PicTar, और TargetScan का उपयोग करते हुए प्रदान की)। 3 टेबल 19 से संशोधित।

Discussion

आकलन और स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को सुधारने के लिए इन विट्रो assays में नए के विकास को हमेशा अपने functionalities और चिकित्सीय क्षमताओं की जांच के लिए एक चुनौती पेश की है। दीर्घकालिक और इन विट्रो भेदभाव परख में एक मजबूत 3 डी के विकास के लिए आवश्यक hNSCs के स्थिर लगाव, सामग्री और संरचनाओं के कार्यकाल में विभिन्न विशेषताओं के साथ कई 3 ​​डी substrates के परीक्षण के द्वारा संबोधित किया गया था। परख विकास के हिस्से के रूप में हम भी इष्टतम सेल बोने एकाग्रता और मूल्यांकन scaffolds के laminin लेपित किया जा करने के लिए आवश्यकता की पहचान की। हमारे hNSCs अनायास पर अंतर कर सकते हैं हालांकि मानक 2D विभेदित hNSCs की तुलना में जब अक्षतंतु प्रक्रिया परिणाम द्वारा मापा के रूप में चार-OHT और विकास का पहलू को हटाने, एक 3 डी संस्कृति प्रणाली के कार्यान्वयन उनके भेदभाव क्षमता में एक महत्वपूर्ण सुधार दिखाया।

3 डी प्रेरित विभिन्न के प्रभाव की जांच करने के लिएhNSC miRNA अभिव्यक्ति पर ntiation हम एक पीसीआर सरणी का इस्तेमाल किया। मानक चिप माइक्रोएरे मुकाबले के साथ पीसीआर सरणी ब्याज की miRNA का एक सीधा मात्रा का ठहराव और सत्यापन का लाभ प्रदान करता है। पीसीआर सरणी 96 से यहां भी कम समय में, उदाहरण के लिए सरणी प्रति miRNA की कुल संख्या के कार्यकाल में ही सीमित है, यह पहले से स्टेम सेल के विकास में सूचना दी कि हमारे मामले में, विशेष रूप से ब्याज की miRNAs को शामिल करने के आधार पर किया जा सकता है। मार्ग ध्यान केंद्रित miRNAs की अभिव्यक्ति समान hNSCs के साथ तुलना में 3 डी और 2 डी विभेदित hNSCs में profiled गया था। सबसे महत्वपूर्ण नीचे विनियमित miRNAs चयनित और ऑनलाइन उपलब्ध एल्गोरिदम (डायना लैब, PicTar, और TargetScans) का उपयोग कर अपनी कार्यक्षमता और जैविक व्याख्या का निर्धारण करने के इरादे के साथ उनके ख्यात लक्ष्य mRNAs का आकलन करने के लिए विश्लेषण किया गया।

एक एकल miRNA लक्ष्य के सैकड़ों पहचान कर सकते हैं और इस कारण हम एक में उपयुक्त उम्मीदवार हो सकता है 3 'UTR mRNAsthat साथ miRNA बातचीत मान्यxonal विनियमन। NR4A3, HSA-मीर 7, और मीर-17 परिवार का एक लक्ष्य, हिप्पोकैम्पस अक्षतंतु के भेदभाव, अस्तित्व, apoptosis और विनियमन में शामिल कर रहे हैं, अभिव्यक्ति के अपने स्तर पर निर्भर करता है जो NR4A परिवार परमाणु रिसेप्टर्स के एक सदस्य है, मार्गदर्शन 26। इसी प्रकार SOX5, HSA-मीर 96 का लक्ष्य, तंत्रिका progenitors 27 अक्षतंतु लंबाई 28, प्रवास, बाद प्रवासी भेदभाव, और न्यूरॉन्स 29 के अनुमानों में कोशिका चक्र प्रगति को नियंत्रित करने की सूचना दी है। SOX5 और NR4A3 दोनों HSA-मीर 96 का एक सीधा लक्ष्य mRNA के रूप में पहचान है, और दोहरी luciferase संवाददाता assays के द्वारा क्रमशः HSA-मीर 7 और 17 थे। दोहरी luciferase (जुगनू और Renilla) एक ही प्लाज्मिड में दो अलग-अलग संवाददाता जीन पर निर्भर करता है और suboptimal अभिकर्मक और एक एकल luciferase प्लाज्मिड प्रणाली के साथ तुलना में साइटोटोक्सिक प्रभाव की वजह से प्रभाव के लिए सामान्य बनाने की इजाजत दी एक बेहतर प्रणाली प्रदान करता है। हमारे परख विकास के हिस्से के रूप में हम भी अपने अभिकर्मक conditi अनुकूलितआदेश में ons उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए।

protocolsdescribed इस के साथ साथ आगे का अनुकूलन और पूर्व नैदानिक ​​अध्ययन और भविष्य नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए intransplantation प्रोटोकॉल beimplemented सकता है जो इन विट्रो hNSC भेदभाव को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Disclosures

सभी लेखकों कर्मचारियों, स्टॉक और / या ReNeuron लिमिटेड या अपनी मूल कंपनी में शेयर विकल्प धारक हैं। इस अध्ययन ReNeuron (RENE.L) द्वारा समर्थित किया गया।

Acknowledgments

हम हेला संवर्धन और अभिकर्मक के साथ उसे तकनीकी सहायता के लिए hNSCs की तैयारी में मदद करने के लिए जूली Heward, और Lavaniya Thanabalasundaram स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM:F12 Invitrogen 21331-020 For RMM medium preparation
Human Albumin Solution  Baxter health care limited  1501052 For RMM medium used at a final concentration of  0.03%
Transferrin, Human recombinant Sigma T8158 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Putrescine DiHCl  Sigma P5780 For RMM medium used at a final concentration of  16.2 µg/ml
Insulin, Human recombinant   Sigma I9278 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Progesterone  Sigma P6149 For RMM medium used at a final concentration of  60 ng/ml
L-Glutamine  Invitrogen 25030-24 For RMM medium used at a final concentration of  2 mM
Sodium Selenite   Sigma S9133 For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml
bFGF      Peprotech AF-100-15 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml
EGF        Peprotech AF-100-188 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml
4-OHT Sigma H7904 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM
Laminin AMS Biotech 3400-010-10
TrypZean/EDTA Lonza  BE02-034E
Water for irrigation Baxter Healthcare UKF7114
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20°C) Invitrogen R007-100
Alvetex 12 well plate  Reinnervate Ltd AVP002
Ethanol  Merck  1.00986.1000
βIII tubulin antibody Sigma T8660
Hoechst Sigma B2261
miRNeasy mini kit Qiagen  217004
RNase free DNase  Qiagen  79254
Chloroform Sigma C7559-5VL
miScript II RT Kit  Qiagen  218160
SYBR green PCR kit Qiagen  218073
Cell Development & Differentiation miScript miRNA PCR Array Qiagen/ SABiosciences MIHS-103Z
Lightcycler 480 white 96 plate Roche  4729692001
Lightcycler 480  sealing foil Roche  4729757001
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
Vector NR4A3 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT019538-MT0
Vector SOX5 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT017632-MT01
Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen). Qiagen  1027284 MiRNA transfection control
Luc-Pair miR Luciferase Assay GeneCopeia LPFR-M010
Lightcycler 480  Roche
GloMax 96 microplate luminometer  Promega

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विकास जीवविज्ञान अंक 98 क्लीनिकल ग्रेड तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं miRNA रूपरेखा और प्रभाव इन विट्रो भेदभाव तीन आयामी संस्कृति
तीन आयामी संस्कृति, MicroRNA का विश्लेषण और ख्यात लक्ष्य जीन पर एक मानव तंत्रिका स्टेम सेल लाइन के भेदभाव
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Stevanato, L., Hicks, C., Sinden, J. D. Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes. J. Vis. Exp. (98), e52410, doi:10.3791/52410 (2015).

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