Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Differensiering av Human Neural Stem Cell Line on tredimensjonal kulturer, Analyse av mikroRNA og Antatte målgener

Published: April 12, 2015 doi: 10.3791/52410
Automatic Translation
1, 1, 1
1ReNeuron

Abstract

Neurale stamceller (NSC) er i stand til selvfornyelse og differensiering til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter på bestemte lokale mikromiljøer. Her presenterer vi et sett av metoder som brukes for tredimensjonal (3D) differensiering og miRNA analyse av en klonal menneskelig nevrale stamcelle (hNSC) linje, for tiden i kliniske studier for hjerneslag uførhet (NCT01151124 og NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs ble avledet fra et etisk godkjent første trimester human foster cortex og betinget udødeliggjort ved hjelp av retroviral integrering av en enkelt kopi av c-mycER TAM konstruere. Vi beskriver hvordan måle axon prosess utvekst av hNSCs differensierte på 3D stillaser og hvordan å kvantifisere tilhørende endringer i miRNA uttrykk ved hjelp av PCR array. Videre kan vi eksemplifisere beregnings analyse med sikte på å velge miRNA mulige mål. SOX5 og NR4A3 ble identifisert som egnet miRNA antatte målet for valgt betydelig ned-regulered mirnas i differensiert hNSC. MiRNA mål validering ble utført på SOX5 og NR4A3 3'UTRs av dual reporter plasmid transfeksjon og dual luciferase assay.

Introduction

Stamcelleforskning spiller en sentral rolle i regenerativ medisin, som også spenner over fagområdene tissue engineering, utviklingscellebiologi, celle therapeutics, genterapi, og biomaterialer (stillaser og matriser). Stamceller er viktig i begge organ developmentand vev reparasjon; forstå hvordan stamceller fungerer er avgjørende for utvikling av ny stamcellebaserte behandlinger en. CTX0E03 er en klonal, betinget udødelig menneskelig nevrale stamcelle (hNSC) linje 2 isolert fra første trimester human foster cortex. CTX0E03 har definert kvalitet egenskaper som er avgjørende for klinisk cellen banktjenester i henhold til Good Manufacturing Practice (GMP) 3. HNSCs kan spontant differensiere i nevroner, gliaceller, og oligodendrocytter og har vist seg å lindre nevrologiske utfall når transplantert i en gnager modell av fokus iskemi 2,4,5. Den CTX0E03 hNSCs er for tiden i kliniske studier for hjerneslag funksjonshemminger;ligheten (NCT01151124 6 og NCT02117635, Clinicaltrials.gov).

Mirnas har en gjennomsnittlig 22 nukleotider i lengde og er bevist regulatoriske molekyler 7, har de ikke koder for proteiner, men heller binde tre prime uoversatt region (3'UTR) av mRNA, regulere sin stabilitet og oversettelse til proteiner. Mirnas er rapportert til å delta i reguleringen av en rekke cellulære prosesser, blant annet utviklingen, proliferasjon og differensiering 8. Flere mirnas har vært innblandet i regulering skjebnen og spesifisering av nevrale stamceller 9.

I to-dimensjonale (2D) standard kulturmiljøet kompleksiteten av in vivo miljøet ikke er tilpasset, og følgelig induksjon og regulering av hNSC differensiering er ikke optimal. In vivo, blir celler omgitt av en tre-dimensjonal (3D) mikromiljø bestående av annen celler og ekstracellulære ligander, inkludert mangetyper av kollagener, laminin og andre matriksproteiner (ekstracellulær matriks, ECM). Tidligere studier har rapportert at den arkitektoniske topografi av materialene mimicking ECM'er og deres geometri innflytelse cellefenotype og skjebne 10-15. En rekke kommersielt tilgjengelige 3D stillasene er tilgjengelige; vi brukt et høyporøst polystyren stillaset konstruert med en godt definert og ensartet arkitekturen til en 200 um tykk membran som gir en 3D-rom i hvilket cellene kan invadere og differensiere 16-18.

Heri 2D og 3D differensieringsanalyser brukes til å vurdere axonprocess utvekst. Videre beskriver vi en metode for å profilere miRNA uttrykk for en klinisk klasse hNSC linje til videre undersøke miRNA effekter på sin differensiering. Metodene i her illustrert er basert på de som opprinnelig ble beskrevet i 19.

Protocol

1. HNSC differensiering på Three Dimensional (3D) Kultur

MERK: Isoler og utlede hNSCs, fra et etisk godkjent vev, beskrevet i en tidligere publikasjon to. Følg de etiske og institusjonelle retningslinjer mens du følger denne prosedyren.

1.1) 3D Kultur hjelp 12-brønners plate

  1. Bruk aseptisk teknikk gjennom hele prosedyren. I et biologisk sikkerhetskabinett, rehydrere stillasene ved å legge 2 ml / godt av 70% etanol fremstilt ved bruk av vann til vanning (WFIr). Unngå å ta på stillasene ved utlevering av 70% etanol ned veggen av hver brønn.
  2. Aspirere nøye 70% etanol og vasker stillasene med 2 ml / brønn DMEM: F12 i 1 min. Gjenta vaskeprosedyren to ganger. Nøye suge DMEM: F12 etter siste vask.
  3. Coat stillasene ved tilsetning av 2 ml / brønn av laminin (10 pg / ml) i DMEM: F12. Inkuber platen ved 37 ° C i en 5% CO 2 humidified inkubator i minst 2 timer. Vask plate med varm DMEM: F12.
  4. Seed hver stillas med ca 500.000 hNSCs i et volum på 150 ul RMM + GFS.
  5. Inkuber platen i 3 timer ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator for å tillate cellene å avgjøre i stillasene.
  6. Legg 3,5 ml RMM til hver brønn tar seg ikke å løsne cellene fra stillas.
  7. Inkuber platen i 7 dager; erstatte RMM medium (3,5 ml / brønn) etter en dag (første fôring) og igjen etter 2-3 dager fra første fôring.
  8. Etter 7 dager, fjerne medium og fikse celler med 4% Paraformaldehyde (PFA) for immunocytokjemi (ICC) eller legge til 500 mL / brønn lysereagensen for total RNA ekstraksjon (butikken plate ved ≤ -80 ° C eller gå videre til total RNA ekstraksjon) .

1.2) Måling av Axon Process utvekst

  1. Flekk 4% PFA fast differensierte hNSCs henhold til en standard ICC protokoll 20 ved hjelp av β3-tubulin (TUBB3) primært antistoff påvises med en fluorokrom konjugert sekundært antistoff. Counterstain cellekjerner med Hoechst (1 mm).
  2. Fange representative bilder av β3-tubulin fargede celler ved hjelp av en fluorescerende mikroskop; lagre bilder som tiff eller jpeg. Mål av axon prosess utvekst ved hjelp av en programvare måleverktøy (f.eks Bilde-Pro Plus).
  3. Åpne bildet, velger målinger alternativ i verktøylinjen, og velg sporingsfunksjonen.
  4. Å starte kurven, velge startpunkt på axon utvekst ved å klikke museknappen. Spore langs hele lengden av axon utvekst; høyreklikk for å fullføre hvert spor. Gjenta for å måle alle axon outgrowthswith i synsfeltet.
  5. Uttrykke målinger som piksler eller mikrometer (pending kalibrering satt opp). Eksport lengdemåling til et regnearkprogram for prøven komparativ og statistisk analyse.

2. Mirna Expression hjelp av en stamceller ogUtviklings Pathways Fokusert miRNA PCR Array

2.1) miRNA total RNA ekstraksjon

  1. Utføre miRNA utvinning på stillaser og 2D vokst prøver (differensiert og udifferensiert, hNSC kontroll).
  2. Tine stillasene, satt inn i en 12-brønners plate, hvis det er nødvendig. Kombiner lysereagensen innholdet (500 mikroliter) av to brønner i samme 1,5 ml Eppendorf tube, endelig volum 1 ml Lysis reagens. Ta vare å forlate stillaset i brønnen.
  3. For tidligere innsamlede som tørr celle pelletert 2D vokst prøver (differensierte hNSC 2D kulturer og udifferensiert kontroll) legge en ml lysereagensen og overføre innholdet til 1,5 ml mikro tube.
  4. Homogen hver testprøve ved anvendelse av en 1 ml sprøyte og et kort 20 til 25 gauge nål. Bestå lysat gjennom nålen ved hjelp av en 1 ml sprøyte opp til fem ganger inntil en homogen lysat er oppnådd.
  5. Tilsett 200 ul av kloroform til hver Eppendorf rør og hetten sikkert. Inverter og vortex rør tilblande innholdet.
  6. Sentrifuger hver 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende homogenat i 15 minutter ved ≥12,000 x g.
  7. Overfør den øvre vandige fase av hver prøve (unngå overføring av en hvilken som helst mellomfase, rosa farget væske) til en frisk 1,5 ml mikrosentrifugerør som inneholdt 750 ul av 100% etanol. Bland grundig ved inversjon.
  8. Pipettere opp til 700 ul av hver testprøve, inkludert eventuell utfelling, til en mini-kolonne i en 2 ml oppsamlingsrør. Lukk lokket og sentrifuger ved ≥8,000 xg i ca. 30 sekunder ved romtemperatur. Kast gjennomstrømning. Gjenta dette trinnet ved hjelp av det gjenværende av prøven.
  9. Utføre en DNA digest i 15 min.
  10. Legg 700 mL buffer RWT til mini-kolonnen og sentrifuger i ca 30 sek på ≥8,000 x g. Kast gjennomstrømning.
  11. Vask mini kolonne ved å legge 500 mL buffer RPE og sentrifugering for ca 30 sek på ≥8,000 x g. Kast gjennomstrømning. Gjenta wash.Centrifuge ved ≥12,000 xg i 1 min for å tørke membranen ytterligere.
  12. Eluere totalt RNA i en 1,5 ml Eppendorf-rør ved å tilsette 40 ul RNase-fritt vann til mini-kolonne og sentrifugering i 1 minutt ved ≥8,000 x g. Måle total RNA-konsentrasjonen ved hjelp av et egnet spektrofotometer.

2.2) miRNA cDNA Forberedelse

  1. Forberede revers-transkripsjon mester mix. Hver prøve krever 4 mL av 5x miScript HiSpec buffer, 2 mL av 10x nucleics mix, miScript 2 ul revers transkriptase mix.
  2. Alikvoter 8 ul masterblanding i et PCR-rør, legger nødvendige volum av total RNA (250 ng), og legge til RNase-fritt vann til et sluttvolum på 20 ul.
  3. Inkuber i 60 minutter ved 37 ° C.Incubate i 5 min ved 95 ° C for å inaktivere miScript revers transkriptase Mix.
  4. Legg 200 mL RNase-fritt vann til hver 20 ul revers-transkripsjon reaksjon, oppbevares ved -20 ° C, eller fortsette med real-timeg PCR-umiddelbart.

2.3) Stamceller og utviklings Pathways Fokusert miRNA PCR Array

  1. Forberede PCR komponenter mix i en 15 ml tube ved å legge til 1375 mL av 2x SYBR grønn mester mix, 100 mL miRNA cDNA forberedelse, 275 mL av 10x miScript Universal Primer, og 1000 mikroliter av RNase-fritt vann (totalt volum 2750 mL).
  2. Overføre PCR komponenter mix på en PCR lasting reservoaret. Fjern forsiktig 96-brønns plate PCR utvalg fra den forseglede posen.
  3. Tilsett 25 ul PCR-komponenter blanding til hver brønn av PCR Array ved hjelp av en 8-kanal pipette, eller en 12-kanals pipette ved hjelp av bare 8 tips. Endre pipettes tips etter hver pipettering skritt for å unngå krysskontaminering mellom brønnene.
  4. Tetningsplate med optisk klebefilm, og sentrifuger i 1 min ved 1000 x g ved værelsestemperatur (15-25 ° C) for å fjerne bobler. Inspiser platen fra undersiden for å sikre at ingen luftbobler i brønnene.
  5. Plasser 96 brønners plate PCR array i sanntid cycler.
  6. Program sanntids cycler tilsvarende: en syklus ved 95 ° C i 10 minutter og 45 sykluser av 15 sekunder ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C satt en enkelt (fluorescens datainnsamling).
  7. Eksportere Ct-verdiene for alle brønner til en blank Excel regneark for bruk med PCR Array Data Analysis Mal Excel og web-basert programvare.
    MERK: Programvaren er tilgjengelig på www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php .

3. Computational Analyse for miRNA Target Tippe og validering av Target mRNA ved Reporter Plasmid Transfeksjon og Ddual Luciferase analysen.

3.1) Computational Analyse for miRNA Target Prediction

  1. Bla PicTar ( http://pictar.mdc-berlin.de/ ) 21, online tilgjengelig algoritme for identifisering av MirNA målrette prediksjon mRNA.
  2. Klikk på "klikk her for PicTar prediksjon på virveldyr". En ny side åpnes.
  3. I den nye siden, PicTar webgrensesnitt, velger arter i rullegardinmenyen og sett miRNA av interesse i miRNA ID-boksen. Klikk søk ​​etter mål av en miRNA.
  4. Observere en liste over geografiske mRNAs rangert etter aPicTar poengsum.
    MERK: PicTar beregner en poengsum som gjenspeiler sannsynligheten for at en gitt UTR vil bli målrettet av den valgte miRNA, og basert på frø komplementaritet, termodynamikk og en kombinatorisk prediksjon for felles mål i sett på co-uttrykt mirnas 22.
  5. Tilsvar hente liste over geografiske mRNA ved hjelp DIANA-LAB ( http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/ ) 23, og TargetScan ( http://www.targetscan.org/ ) 24, alternativ på linje tilgjengelig algoritmer.
  6. Kompilere en komparativ tabell over miRNAs basert på rangeringen oppnådd ved bruk av ulike dataverktøy. PicTar rangerer etter poengsum, DianaLab av presisjon (basert på signal til støy-forhold og en presisjon poengsum for evaluering av betydningen av den anslåtte resultater), og TargetScan av samlet PCT (basert på frø komplementaritet, termodynamisk fri energi av bindende, bevaring løpet forskjellige arter), se tabell 1.

3.2) Validering av Target mRNA ved Reporter Plasmid Transfeksjon og Dual Luciferase analysen.

MERK: 3 'UTR luciferase reportere for validering av målet mRNA har vært tidligere beskrevet 25.

  1. Transfeksjon
    1. Seed HeLa-celler ved en tetthet på 10 5 celler / brønn i 24-brønners plate.
    2. Etter 24 timer co-transfisere HeLa celler med 1,5 mL av transfeksjon reagens og enten 100 ng av NR4A3 3 'UTRor SOX5 3' UTR plasmid, samt 20 nM miRNA etterligner (HSA-Mir-96-5p for SOX5 3217; UTR, og HSA-Mir-7-5p, og HSA-Mir-17-5p for NR4A3 3 'UTR henholdsvis) per brønn.
    3. Co-transfisere kontrollbrønner med NR4A3 3 'UTRor SOX5 3' UTRplasmid og fluorokromkonjugerte merket negativ kontroll sirnas. Transfeksjon av kontrollbrønner med fluorokromkonjugerte merket negative kontroll sirnas tillater evaluering av transfeksjonseffektivitet og står for ligne miRNA 3'UTR bind spesifisitet.
  2. Måling av Dual Luciferase Aktiviteter
    1. Mål Firefly og Renilla luciferase aktiviteter 24 timer etter transfeksjon. Fjerne cellevekst medium.
    2. Forbered arbeidsløsning I ved tilsetning av 50 ul substrat I til 10 ml løsning I; bland godt. Legg 300 mL av arbeidsløsning jeg inn i hver 24 godt.
    3. Overføre innholdet i hver 24 brønn i tre brønner i en 96 hvit plate, 100 ul hver. Vent 10 min og måle Firefly luciferase i luminometer sett for luminescens oppkjøpet.
    4. Forberede arbeider solution II ved å tilsette 50 ul substrat II i 10 ml av oppløsning II; bland godt. Tilsett 100 mL av arbeidsløsning jeg inn i hver 96 brønner som allerede inneholder 100 mL av arbeidsløsning I.
    5. Vent 10 min og måle Renilla luciferase i luminometer sett for luminescens oppkjøpet. Beregne forholdet av luminescens fra ildflueluciferase til Renilla luciferase.

Representative Results

I figur 1 er visualisert etterforskningen og kvantifisering av hNSC differensiering på 3D stillaser sammenlignet med tradisjonelle plant kulturer (2D) og expressedas axon prosess utvekst målinger. I figur 2 er representedthe arbeidsflyt og resultatene for miRNA kvantifisering ved hjelp av stamceller og utviklingsveier fokusert miRNA PCR array å undersøke differensial uttrykk for miRNAs i 2D og 3D differensierte hNSCs sammenlignet med udifferensiert kontroll. Etter miRNA komparativ analyse mellom differensierte og udifferensierte hNSCs, og beregningsorientert analyse for target prediksjon, SOX5 og NR4A3 (NOR1) ble identifisert som mulige mål mRNA. Å studere direkte interaksjon mellom miRNAs og deres antatte nettsted på 3'UTR mRNA vi brukte to kommersielt tilgjengelige plasmider inneholder enten SOX5 eller NR4A3 3'UTR sekvens satt nedstrøms ildflueluciferase reporter genet, en nd som i samme plasmid Renilla luciferasegen for normalisering. De representative resultater fra 3 'UTR luciferaseaktivitet nedreguleringen er presentert i figur 3.

Figur 1
Figur 1:. Differensiering av hNSCs på 3D stillasene, og måling av axon prosess es utvekst (A) Etter standard ICC farging for β3-tubulin (grønn) og kjerner motfarget med Hoechst (blå) representative microphotographs ble ervervet og måling av axon prosessene var utføres ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare. (B) Diagrams rapportering måling av axon prosess utvekst utført i 2D og 3D differensierte hNSCs for 1 (1 W) eller 3 uker (3W).com / filer / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2:. Skjematisk arbeidsflyten av miRNA profilering i differensierte hNSCs Total RNA, inkludert mirnas, ble hentet fra enten differensierte hNSCs på 3D stillaser og standard 2D kulturer, eller udifferensiert kontroll. 250 ng av total RNA ble retro-transkribert ved en fremgangsmåte som muliggjør den selektive omdannelse av modne mirnas til cDNA egnet for miRNA kvantifisering med human celledifferensiering og utvikling miScript miRNA PCR-array. Den geo-gjennomsnittet av SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, og RNU6-2 ble anvendt for dataanalyser basert på 2--ΔΔct metoden. Signifikante endringer ble definert som +/- 1,5 brette opp og ned regulering til en statistically betydelig grad. Data ble analysert ved hjelp av web-basert programvare tilgjengelig på Resultatene er uttrykt som en clustergram. Modifisert fra Figur 3 19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Validering av miRNA mål spådd mRNA ved hjelp av en dual luciferase rapport analysen. (A) Representant diagram av en dual luciferase reporter plasmid brukes som et verktøy for å validere 3'UTR sekvens som et direkte mål på en miRNA. (B) Representant mikrograf viser transfeksjonseffektivitet. (C)   Signaler, uttrykt som relativ luciferaseaktivitet, fra human 3 & #39, UTR reportere ofSOX5 og NR4A3 gener ble betydelig slått ned i nærvær av HSA-Mir-96, og HSA-Mir-7 og 17 miRNA ligner hhv. Modifisert fra Figur 5 19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

<td> 0,94
DIANALAB PicTar TargetScan
miRNA Målgen Målwebområder / gener funnet Presisjon Score Aggregate P CT
HSA-Mir-96 SOX5 1214/763 1 6.74
HSA-Mir-183 DUSP10 302/190 0.72 4.75 0,85
HSA-Mir-302a NR4A3 863/473 0.84 3.05 NF
HSA-Mir-182 FOXN3 1358/794 0.94 NF 0,96
HSA-Mir-7 NR4A3 NF NF 1.61 0,17
HSA-Mir-7 FOXN3 399/136 0,17 NF 0,88
HSA-Mir-20a NR4A3 1650/841 0,85 5,87 0.63
NR4A3 1955/973 0.9 5,87 0.63
HSA-Mir-17 NR4A3 1928/961 0.9 5,38 0,63 + 0,37
HSA-Mir-20a EIF4G3 1650/841 0,97 NF NF
HSA-Mir-20b EIF4G3 1955/973 0.94 NF NF
HSA-Mir-17 EIF4G3 1928/961 0.94 NF NF

Tabell 1: Liste over miRNA mål prediksjon mRNA. Representative tabell over mirnas, målrette prediktive gener, og algoritmer analyse (forutsiion / poengsum / aggregat gitt med Diana Lab, PicTar, og TargetScan henholdsvis). Modifisert fra Tabell 3 19.

Discussion

Utviklingen av nye in vitro å vurdere og forbedre differensiering av stamceller har alltid presentert en utfordring for etterforskningen av sine funksjoner og terapeutiske evner. Langtids og stabil festing av hNSCs, som kreves for utvikling av en robust 3D in vitro differensiering assay ble adressert ved å teste flere 3D-substrater med forskjellige egenskaper i begrepet av materialer og konstruksjoner. Som en del av analysen utvikling vi også vurdert optimal celle seeding konsentrasjon og identifisert kravet til stillasene som skal belegges laminin. Selv om våre hNSCs kan spontant skille ved 4-OHT og vekstfaktor-fjerning, gjennomføring av en 3D-kultur-system viste en betydelig forbedring i deres differensiering evne som målt ved axon prosessen utvekst i forhold til standard 2D differensiert hNSCs.

For å undersøke effekten av 3D-indusert differentiation på hNSC miRNA uttrykket vi brukte en PCR array. Sammenlignet med standard chip microarray PCR matrise tilbyr fordelene ved en direkte kvantifisering og validering av miRNA av interesse. Selv om PCR matrisen er begrenset på sikt av totalt antall miRNA per rekke, for eksempel i her mindre enn 96, kan det være skreddersydd for å spesifikt omfatter mirnas av interesse, i vårt tilfelle tidligere rapportert i stamcelle utvikling. Uttrykket av pathway fokusert mirnas ble profilert i 3D og 2D differensierte hNSCs sammenlignet med udifferensierte hNSCs. De mest signifikant nedregulert mirnas ble valgt ut og analysert for å vurdere deres antatte målet mRNA med den hensikt å bestemme deres funksjonalitet og biologisk tolkning ved hjelp av online tilgjengelige algoritmer (DIANA Lab, PicTar, og TargetScans).

En enkelt miRNA kan gjenkjenne hundrevis av mål og av denne grunn vi validert miRNA interaksjoner med 3 'UTR mRNAsthat kan være egnede kandidater i enxonal regulering. NR4A3, et mål av HSA-Mir-7, og Mir-17-familien, er medlem av NR4A familiens kjernereseptorer som, avhengig av deres nivå av uttrykk, er involvert i differensiering, overlevelse, apoptose og regulering av hippocampus axon veiledning 26. Tilsvar SOX5, et mål av HSA-Mir-96, er rapportert å kontrollere cellecyklusprogresjonen i nevrale stamceller 27 axon lengde 28, migrasjon, etter vandrende differensiering, og projeksjoner av nevroner 29. Både SOX5 og NR4A3 ble identifisert som et direkte mål mRNA av HSA-Mir-96, og henholdsvis HSA-Mir-7 og 17 av dual luciferase reporter analyser. Dual luciferase (Firefly og Renilla) er avhengig av to forskjellige reportergener på det samme plasmid, og gir et forbedret system som tillater normalisering av effekter forårsaket av suboptimal transfeksjon og cytotoksiske effekter sammenlignet med et enkelt plasmid luciferase-systemet. Som en del av analysen vår utvikling vi også optimalisert vår transfeksjon conditions for å oppnå god effekt.

Den protocolsdescribed her, kan utnyttes til å optimalisere og karakter in vitro hNSC differensiering som kan beimplemented intransplantation protokoller for pre-kliniske studier og fremtidige kliniske applikasjoner ytterligere.

Disclosures

Alle forfatterne er ansatte, lager og / eller opsjonsinnehavere i ReNeuron Ltd eller dets morselskap. Denne studien ble støttet av ReNeuron (RENE.L).

Acknowledgments

Vi erkjenner Julie Heward for å hjelpe i utarbeidelsen av hNSCs, og Lavaniya Thanabalasundaram for henne teknisk støtte med HeLa dyrkning og transfeksjon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM:F12 Invitrogen 21331-020 For RMM medium preparation
Human Albumin Solution  Baxter health care limited  1501052 For RMM medium used at a final concentration of  0.03%
Transferrin, Human recombinant Sigma T8158 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Putrescine DiHCl  Sigma P5780 For RMM medium used at a final concentration of  16.2 µg/ml
Insulin, Human recombinant   Sigma I9278 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Progesterone  Sigma P6149 For RMM medium used at a final concentration of  60 ng/ml
L-Glutamine  Invitrogen 25030-24 For RMM medium used at a final concentration of  2 mM
Sodium Selenite   Sigma S9133 For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml
bFGF      Peprotech AF-100-15 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml
EGF        Peprotech AF-100-188 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml
4-OHT Sigma H7904 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM
Laminin AMS Biotech 3400-010-10
TrypZean/EDTA Lonza  BE02-034E
Water for irrigation Baxter Healthcare UKF7114
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20°C) Invitrogen R007-100
Alvetex 12 well plate  Reinnervate Ltd AVP002
Ethanol  Merck  1.00986.1000
βIII tubulin antibody Sigma T8660
Hoechst Sigma B2261
miRNeasy mini kit Qiagen  217004
RNase free DNase  Qiagen  79254
Chloroform Sigma C7559-5VL
miScript II RT Kit  Qiagen  218160
SYBR green PCR kit Qiagen  218073
Cell Development & Differentiation miScript miRNA PCR Array Qiagen/ SABiosciences MIHS-103Z
Lightcycler 480 white 96 plate Roche  4729692001
Lightcycler 480  sealing foil Roche  4729757001
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
Vector NR4A3 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT019538-MT0
Vector SOX5 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT017632-MT01
Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen). Qiagen  1027284 MiRNA transfection control
Luc-Pair miR Luciferase Assay GeneCopeia LPFR-M010
Lightcycler 480  Roche
GloMax 96 microplate luminometer  Promega

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Falanga, V. Stem cells in tissue repair and regeneration. J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).
  2. Pollock, K., et al. A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke. Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).
  3. Hodges, H., et al. Making stem cell lines suitable for transplantation. Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).
  4. Smith, E. J., et al. Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke. Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).
  5. Stroemer, P., et al. The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion. Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).
  6. Kalladka, D., Muir, K. W. Brain repair: cell therapy in stroke. Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  8. Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
  9. Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 329-338 (2010).
  10. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Semin Cell Dev Biol. 13 (5), 377-383 (2002).
  11. Buxboim, A., Discher, D. E. Stem cells feel the difference. Nat Methods. 7 (9), 695-697 (2010).
  12. Li, W. J., et al. A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 26 (6), 599-609 (2005).
  13. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  14. Ortinau, S., et al. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed Eng Online. 9 (1), 70 (2010).
  15. Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. Designing synthetic materials to control stem cell phenotype. Curr Opin Chem Biol. 11 (4), 381-387 (1016).
  16. Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture. Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).
  17. Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity. J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).
  18. Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).
  19. Stevanato, L., Sinden, J. D. The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 49 (2014).
  20. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
  21. Chen, K., Rajewsky, N. Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data. Nat Genet. 38 (12), 1452-1456 (2006).
  22. Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
  23. Maragkakis, M., et al. Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels. BMC Bioinformatics. 10, 295 (2009).
  24. Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell. 120 (1), 15-20 (2005).
  25. Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells. J Vis Exp. (55), (2011).
  26. Ponnio, T., Conneely, O. M. nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility. Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).
  27. Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway. EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).
  28. Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).
  29. Lai, T., et al. SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes. Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).

Tags

Developmental Biology Klinisk karakter nevrale stamceller miRNA profilering og effekter in vitro differensiering tredimensjonal kultur
Differensiering av Human Neural Stem Cell Line on tredimensjonal kulturer, Analyse av mikroRNA og Antatte målgener
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stevanato, L., Hicks, C., Sinden, J. … More

Stevanato, L., Hicks, C., Sinden, J. D. Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes. J. Vis. Exp. (98), e52410, doi:10.3791/52410 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter