Abstract
Chick korioallantoinmembranet (CAM) börjar att utvecklas genom dag 7 efter befruktning och mognar dag 12. CAM är naturligt immunbrist och högt vaskulariserad, vilket gör det till ett idealiskt system för tumörimplantation. Vidare CAM innehåller extracellulära matrisproteiner såsom fibronektin, laminin, kollagen, integrin alfa (v) beta3, och MMP-2, vilket gör det till en attraktiv modell för att studera tumörinvasion och metastas. Forskare har länge utnyttjat fysiologi CAM genom att använda det som en modell av angiogenes. På senare tid har CAM-analysen ändrats för att fungera som en in vivo xenograft modellsystem för olika typer av cancer som överbryggar gapet mellan grundforskning in vitro arbete och mer komplexa djur cancermodeller. CAM-analysen möjliggör studier av tumörtillväxt, antitumörläkemedel, och pro-tumör molekylära vägar i ett biologiskt relevant system som är både kostnads- och tidseffektiv. Här beskriver vi utvecklingen av CAM xenograft modell av hepatocellulär cancer (HCC) med embryonala överlevnad på upp till 93% och tillförlitlig tumör tar leder till tillväxt av tredimensionella, vaskulariserade tumörer.
Introduction
Hepatocellulär cancer (HCC) är den 3: e största orsaken till cancerdödlighet i världen 1. För närvarande endast 30% av HCC patienter är berättigade till potentiellt läkande kirurgiska behandlingar 2 och systemisk kemoterapi inte är effektiv 3. Därför finns det ett trängande ouppfyllt kliniskt behov av nya HCC terapier, och utveckling av modellsystem som lämpar sig för effektiv testning av nya agenter. Chick korioallantoinmembranet (CAM) analysen möjliggör reproducerbar, kostnadseffektiv, och snabb medel genomströmning metod för att testa potentiella antitumörläkemedel in vivo.
CAM-analysen har använts i stor utsträckning för att studera angiogenes 4. Det har också framgångsrikt utvecklats till en tumör xenograft modell av cancer, inklusive glioblastom 5, pankreascancer 6, melanom 7-9, och osteosarkom 10-11. Både in ovo 12 och ex ovo13 tekniker har använts i litteraturen, med detaljer varierar från protokoll till protokollet. En stor utmaning till CAM xenotransplantatmodell är den relativt höga förekomsten av embryonal död efter manipulering av ägget, med publicerade chick embryodödlighet som sträcker sig från 25 - 50 procent 11 till 14.
I den här artikeln beskriver vi utvecklingen av en in ovo xenotransplantatmodell av HCC som tillförlitligt producerar tillväxten av tredimensionella, vaskulariserade tumörer som histologiskt liknar odifferentierade HCC. Vi har anpassat ett protokoll som först beskrivits av Ossowski et al. 14 och har uppnått chick embryonala överlevnadsnivåer på upp till 93% med extremt hög tumör engraftment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ägg Inkubation
- Skaffa 8 dygn gamla specifika patogenfria embryonerade ägg.
- Placera ägg i roterande äggfack, stansade ändar vända uppåt, och placera den roterande brickan inuti ett ägg inkubator. Inkubera ägg för 48 timmar vid 36 ° C och 50% luftfuktighet.
2. Tappa CAM och Öppna ägg
- Samla ägg från inkubatorn. Placera ägg i ägg rack, stämplat uppåt, och ta med till laminärt flöde huva.
- Stäng av rummet och huva ljus.
- Håll stämplade slutet av ägg lätt till ägget candler att exponera kärl av CAM samt luftsäcken.
OBS: Ägget candler är en ljuskälla som används för att visualisera det växande embryot och tillhörande luftsäck och vaskulatur. - Placera en blyertsmarkering mellan två stora blodkärl.
- Slå på belysningen och använda en steril Markeringen visar att ett hål på toppen av ägget över luftsäcken (stämplat slut) och ett hål på pencil märke. Tryck inte Markeringen visar hela vägen; ett hål ca 3 mm djup vanligen tillräcklig.
- Släck ljuset. Pressa säkerhets glödlampa, trycker den öppna änden stadigt mot hålet ovanför luftsäcken. Applicera sug för att dra luft in i hålet vid blyertsmarkering, vilket orsakar nämnda CAM att falla bort från skalet på blyertsmarkeringen.
- Kontrollera att luftsäcken har flyttat från den stämplade änden av ägget till pennan-märkta hålet med candler. Om så inte är fallet, använd Markeringen visar att båda hålen något djupare och sedan åter avsugning med hjälp av säkerhets glödlampa.
- Slå på belysningen. Håll ägget i ena handen, slå på dremel roterande verktyg med en 15/16 tums kapskiva fäst och göra två tvärgående snitt bara djupt nog att skära genom skalet men inte tillräckligt djupt för att skära hela vägen ner till den deprimerade CAM. Gör de skär runt 2 cm långa och 1 cm från varandra. Gör snitten tillräckligt brett så att en silikonring 1 cm i diameter kan passera genommen tunnare än bredden på standard scotch tape.
- Därefter gör en längsgående snitt mellan och vid ändarna av de två tvärgående snitt genom att lätt trycka på kapskivan till skalet.
- Skjut steril tång under skalet stycket och parallellt med skalet. Ta skalet stycket med pincett och ta bort hela bit rent.
- Placera tejp över det nyöppnade fönstret och se till att vika ena änden över sig själv för att underlätta avlägsnande.
- Placera äggen tillbaka i inkubatorn i ägget facket (inte i de roterande ägg rack) förrän vid ympning.
3. Inokulation
- Håll basalmembranprotein blandning, såsom matrigel, på is (för att förhindra polymerisation) och placera i huva.
- Använd 2 mM EDTA för att lösgöra celler (4 - 5 ml per T75-kolv) och placera flaskor i vävnadsodling inkubator under 5 min.
- Resuspendera fristående celler i media och räkna med en hemocytometer och trypanblått. Använd mellan 500 tusen tono 2.000.000 celler för ympning på CAM, beroende på cellinje. Optimera rätt antal i preliminära experiment.
- Mät volymen som erfordras för lämplig cellnummer och centrifugera vid 500 xg under 5 minuter.
- Kassera supernatanten och sedan resuspendera cellpelleten i 40 μ l PBS ++ och 20 μ l basmembranet blandning.
OBS: På denna punkt, celler kan behandlas med läkemedel eller andra testmedel som behövs för experiment genom återsuspendering i cellen / basalmembranet blandning suspension. Alternativt kan medel pipetteras på cell / basalmembranet blandning suspension efter ympning. - Hämta ägg rack med ägg från inkubatorn och plats i laminärt flöde huva.
- Skal tejpen i fönstret hämta en 1 mm silikonring från locket av en kryogen flaska med hjälp av steriliserade pincett, och släppa ringen genom fönstret.
- Pipettera den 60 μ l cellösningen PBS ++ och basalmembranet mixture direkt i mitten av silikonring vilar på CAM.
- Re-tape fönstret och flytta ägg rack tillbaka till inkubatorn. Vid denna punkt, vara försiktig när du flyttar äggen som ringen och cellsuspensionen kan lätt bli förskjutna.
- Låt tumörer att växa under 5 till 7 dagar.
4. Skörd Tumörer
- Placera under-pad i huva. Förbered 35 x 10 mm plattor och paraformaldehyd behållare som behövs för histologi. Sätt 1 ml PBS ++ i varje 35 x 10 mm platta.
- Placera biologiskt påse i huva. Ta sterila dissektion sax och sätt den spetsiga änden i ägget vid hål nära stämplade slutet.
- Skär runt hela ägg i längdled.
OBS: CAM och tumören med ringen bör hålla fast vid den övre halvan av skalet med fönstret. - Använda dissektion sax och pincett, dissekera tumören från CAM och placera tumör i 35 x 10 mm platta. Mät och väga tumörer. Fasta tumörer i paraformaldehyde och sedan paraffin bädda in dem för användning i histologi och immunohistokemi experiment.
5. (Valfritt): Tumörcell Dissociation
- Använd dissekering sax för att finhacka tumör i 35 x 10 mm platta. Häll malet tumör i ett 15 ml centrifugrör och ta bort så mycket PBS ++ som möjligt genom pipettering.
- Tillsätt 2 ml av kollagenas (1 mg / ml i PBS ++), vänd röret över flera gånger, och inkubera röret vid 37 ° C under minst 30 min (upp till flera timmar).
- Tillsätt 5 ml media till varje rör och återsuspendera noggrant genom att pipettera upp och ned 20 - 40x. Noggrann pipettering är avgörande för fullständig cell dissociation.
- Låt sediment att bosätta sig, och överför supernatanten till ett nytt rör. Centrifugera vid 500 xg under 5 minuter. Avlägsna supernatanten, lämnar bakom dissocierad cellpellet.
Anmärkning Vid denna punkt kan cellpelletar användas för olika experiment (flödescytometri, lys för användning i Western-blotting, RNA-isolering, etc.). Totalt tumörcellräkning kan också erhållas med användning av en hemocytometer och trypanblått-färgning. Observera att mindre, ovala celler är kycklingceller från CAM och bör inte räknas som tumörceller. Det bör finnas ett minimalt antal av kontaminerande icke-tumör (CAM) celler om tumören dissekeras bort från CAM noggrant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa bilder av viktiga steg i protokollet Här visas. Figur 1A visar användningen av candler att visualisera det växande embryot, luftsäcken och kärl av CAM. Figur 1B-1C visar processen att släppa CAM genom att göra de två hålen och sedan applicera negativt tryck med hjälp av säkerhets glödlampa, och figur 1D visar en framgång tappade CAM med en stor luftbubbla under penn märkt hål. Figur 1E och figur 1F visar användningen av dremel roterande verktyg för att göra de nödvändiga nedskärningar i skalet ovanför luftbubblan och öppnade fönstret i skalet med den exponerade vaskulariserad CAM inom.
Tredimensionella, vaskulariserade tumörer framgångsrikt odlas med användning av de humana HCC cellinjer Huh7 (figur 2A-2B) och PLC / PRF / 5 (figur 2C-2D). Tumörer vuxit från Huh7 och PLC / PRF / 5-celler histologically liknar odifferentierade HCC (Figur 2E-2F) samt likna Huh7 och PLC / PRF / 5 tumörer odlade i mus xenograft-modeller 15,16. Vidare användning av tumörvikten validerats som en mätning av tumörstorlek genom att visa att tumörvikten var starkt korrelerade med totala tumörcellantal erhållits efter fullständig dissociation av tumörer med användning av kollagenas (Figur 3).
Tabell 1 visar med hjälp av detta protokoll, har embryonala överlevnad på upp till 93% uppnås (tabell 1). Aggregerade data från tre separata HCC experiment i CAM xenograftmodell. Av totalt 33 ägg som framgångsrikt transplanterades med 500.000 tumörceller (Huh7 eller PLC / PRF5), bara 3 ägg resulterade i kycklingembryo död, en total överlevnad på 90,9%. Vidare tumörer mycket tillförlitligt odlas efter 5 dagar, som 100% (30/30) av ägg med överlevande embryon hade framgångsrikt tumörbildning.
Figur 1. Tappa CAM och öppna ett fönster i Shell. (A) Identifiering av Embryo (Blue Arrow) och kärlsystemet (svart pil) med hjälp av Candler, (B) göra ett hål i Shell, (C) Tillämpa sug till hålet vid Naturligt förekommande Air Sac, (D) Visualisera Air Bubble Visar Framgångsrik sättning av CAM från Shell, (E - F). Öppna ett fönster i Shell använder Dremel-verktyg Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. CAM stöder Tillväxt av Tredimensionell, vaskulariserade tumörer som Histologiskt Liknar Odifferentierad HCC. (A - B) Tumörtillväxt efter 5 dagar i CAM-modellen, Huh7 celler (500.000 celler seedade) (skala bar = 1 cm), (C - D) Tumörtillväxt efter 5 dagar i CAM-modellen, PLC / PRF / 5 celler (500.000 celler sådda) (skala bar = 1 cm), (E-F) Histologi av Huh7 och PLC / PRF / 5 tumörer, respektive (skal barer = 100 μ m) Klicka här för att se en större version av denna siffra .
Figur 3. Rita av tumörvikt vs. celltal. Tumörvikt är starkt korrelerad med total tumörcellräkning efter collagenase dissociation.
| Totalt antal ägg | Procent av ägg med kycklingembryo överlevnad | Graden av tumör ta in ägg med överlevande embryon | |
| Huh7 | 27 | 92,6% (25/27) | 100% (25/25) |
| PLC / PRF / 5 | 6 | 83,3% (5/6) | 100% (5/5) |
| Total | 33 | 90,9% (30/33) | 100% (30/30) |
Tabell 1. Embryonala överlevnaden och priser av tumör Ta in CAM Modell med hjälp av två Human HCC cellinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera viktiga steg i detta protokoll svarar troligen för förbättrad överlevnad av embryo samt ökad tillförlitlighet av tumörtillväxt. Tappa CAM bort från skalet genom att applicera sug till luftsäcken är mindre invasiv än andra befintliga metoder (med hjälp av en nål för att ta bort albumin från ägget, dissektion, etc.). Med hjälp av en steril Markeringen visar att skapa de två små hål som krävs för denna metod är den mest utmanande delen av protokollet. Använda för mycket kraft kan leda till skador på CAM och dess kärl genom över penetration med tryck stift eller kan även resultera i sprickor eller förstöra ägget. Praktisk övning med hjälp av en push stift att göra små hål i icke-befruktade, livsmedelsköpta ägg kan minimera misstagen under det första försöket på att tappa CAM. Vidare har användningen av etanol eller andra desinficerande lösningar för att rengöra skalet minskar embryonala viabilitet, och bör undvikas. Slutligen, för att med hjälp av den sterila silikon Ring &# 8220; fålla "tumörceller i en specifik plats efter ympning hjälper till tumörtillväxt och bidrar till den höga graden av tumör tar ses i våra protokoll.
Viss optimering av kritiska steg i protokollet kommer sannolikt att krävas när man arbetar med olika cellinjer och / eller droger. Den föreslagna antalet celler för sådd är mellan 0,5 och 2 miljoner, men vissa cellinjer kan kräva högre eller lägre sådd densiteter för att bilda en fin, tredimensionell tumör. Ympning för få celler kan resultera i dålig tumörbildning, medan ympning för många celler kan resultera i tumör överväxt där tumören upptar hela silikonring, blir planare och mindre tredimensionell än är perfekt, och kan fly gränsen av ringen . Vi rekommenderar att du ställer upp ett preliminärt experiment för att bestämma den optimala cellsåddtäthet för en viss cellinje. Dessutom kan viss justering till standard i läkemedels vitro koncentrationer kräverd. Vi beräknar läkemedelskoncentrationer med hänvisning till den totala volymen som sås på CAM (60 | j, l), men ibland "högre" läkemedelskoncentrationer än de som används i parallella experiment in vitro krävs för att se effekter på tumörtillväxt, förmodligen på grund av absorption genom CAM och spridning av läkemedlet till resten av ägget.
Efter framgångsrik optimering av protokollet för specifika cellinjer och läkemedel, kan CAM xenograft modellen användas för att undersöka ett stort antal olika tumöregenskaper och cellulära mekanismer. Tumörtillväxt kan bedömas genom vikt och storleksmätningar samt totala tumörkroppar. Tumörer kan fixeras och utsättas för immunhistokemi för att färga för tumörmarkörer eller specifika proteiner av intresse. Angiogenes kan bedömas genom färgning för SNA1, som specifikt färgar chick endotelceller 17. Tumörceller kan lyseras för förhör av molekylära vägar. Som ett mellansteg för att överbrygga ren in vitro arbete med mer komplicerade modeller av cancer, såsom orthotopic djurmodeller, är CAM xenotransplantatmodell ett kostnadseffektivt sätt att snabbt få uppgifter i en miljö som är mer biologiskt relevant än celler odlade i kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma--an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241 (2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58 (2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522 (2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485 (2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
