Abstract
غشاء مشيمائي الفرخ (CAM) يبدأ في تطوير بعد يوم 7 بعد الإخصاب وينضج بعد يوم 12. وCAM هو العوز المناعي بشكل طبيعي وأوعية دموية للغاية، مما يجعله نظام مثالي للورم زرع. علاوة على ذلك، CAM يحتوي على البروتينات المصفوفة خارج الخلية مثل فبرونيكتين، laminin، الكولاجين، إنتغرين ألفا (V) beta3، وMMP-2، مما يجعلها نموذجا جذابا لدراسة غزو الورم والانبثاث. وقد أخذ العلماء منذ فترة طويلة الاستفادة من علم وظائف الأعضاء من CAM عن طريق استخدامه كنموذج من الأوعية الدموية. وفي الآونة الأخيرة، تم تعديل مقايسة CAM في العمل بوصفه في الجسم الحي طعم أجنبي نظام نموذجي لمختلف أنواع السرطان الذي يسد الفجوة بين العمل الأساسي في المختبر ونماذج سرطان الحيوانات أكثر تعقيدا. مقايسة CAM يسمح لدراسة نمو الورم، والعلاجات المضادة للورم، والمؤيدة للورم المسارات الجزيئية في نظام بيولوجيا في آن معا من حيث التكلفة وفعالة في الوقت المحدد. هنا، نحن تصف تطوير CAM كسيننموذج ograft من سرطان الخلايا الكبدية (HCC) مع معدلات البقاء على قيد الحياة الجنينية لمدة تصل إلى 93٪ والورم موثوق تأخذ يؤدي إلى نمو ثلاثية الأبعاد، وأورام أوعية دموية.
Introduction
سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو السبب الرئيسي الثالث 3 وفيات السرطان في العالم 1. حاليا 30٪ فقط من المرضى HCC مؤهلة للحصول على العلاجات الجراحية يحتمل العلاجية 2، والعلاج الكيميائي النظامية ليس فعال 3. ولذلك، هناك حاجة ملحة السريرية غير الملباة لعلاجات HCC جديدة، وتطوير نظم نموذج مناسبة لاختبار كفاءة وكلاء الجديد. يوفر فرخ مشيمائي غشاء (CAM) فحص واستنساخه وفعالة من حيث التكلفة، وسريع طريقة متوسطة مرت من اختبار العقاقير المحتملة المضادة للورم في الجسم الحي.
وقد استخدمت مقايسة CAM على نطاق واسع لدراسة الأوعية الدموية 4. كما تم وضع بنجاح في نموذج طعم أجنبي الورم من السرطانات، بما في ذلك ورم أرومي 5، 6 سرطان البنكرياس، سرطان الجلد 7-9، وعظمية 10-11. سواء في البيضة والبيضة السابقين 12وقد تم استخدام 13 تقنيات في الأدب، مع تفاصيل متفاوتة من بروتوكول للبروتوكول. واحد تحديا كبيرا للنموذج CAM طعم أجنبي هو معدلات عالية نسبيا من وفاة الجنين بعد التلاعب في البيض، مع نشر معدلات وفيات الأجنة الفرخ تتراوح 25-50 في المئة 11-14.
في هذه المقالة، نحن تصف وضع البيضة في نموذج طعم أجنبي من سرطان الكبد الذي ينتج موثوق نمو ثلاثية الأبعاد، وأورام أوعية دموية تشبه تشريحيا HCC غير متمايزة. تكيفنا بروتوكول وصف لأول مرة من قبل Ossowski وآخرون. 14 وحققت الفرخ الجنينية معدلات البقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى 93٪ مع ارتفاع للغاية engraftment الورم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الحضانة 1. البيض
- الحصول على 8 يوم البيض خالية من مسببات الأمراض المحددة القديمة المحتوي.
- وضع البيض في الدورية علبة البيض، وينتهي ختمها تواجه صعودا، ووضع علبة الدورية داخل حاضنة البيض. احتضان البيض لمدة 48 ساعة على 36 درجة مئوية والرطوبة 50٪.
2. اسقاط CAM وفتح البيض
- جمع البيض من الحاضنة. مكان البيض في رف البيض، يختم حتى الجانب، وتقديمهم إلى غطاء تدفق الصفحي.
- إيقاف الغرفة وغطاء محرك السيارة أضواء.
- عقد نهاية مختومة من البيض برفق إلى كاندلر البيض لفضح الأوعية الدموية من CAM فضلا عن كيس الهواء.
ملاحظة: كاندلر البيض هو مصدر الضوء المستخدمة لتصور الجنين النامي وما يرتبط بها من كيس الهواء والأوعية الدموية. - وضع علامة قلم رصاص بين اثنين من الأوعية الدموية الرئيسية.
- بدوره عن الاضواء واستخدام دبوس معقم دفعة لجعل ثقب واحد في طرف البيضة فوق كيس الهواء (النهاية ختمها) وثقب واحد في المؤسسة العامةncil علامة. لا دفع دبوس دفع كل طريق. حفرة حوالي 3 ملم عميق لن يكون كافيا عادة.
- أطفي الأنوار. ضغط مصباح سلامة، والضغط على نهاية مفتوحة بحزم ضد الثقب فوق كيس الهواء. تطبيق الشفط لسحب الهواء في حفرة في علامة قلم رصاص، مما تسبب في CAM لإسقاط بعيدا عن قذيفة على علامة قلم رصاص.
- تأكد من أن كيس الهواء قد انتقلت من نهاية مختومة من البيضة إلى الحفرة بعلامات قلم رصاص باستخدام كاندلر. إذا كان لديه لا، استخدم دبوس دفعة لجعل كل الثقوب أعمق قليلا ثم إعادة تطبيق الشفط باستخدام لمبة السلامة.
- تشغيل الأضواء. عقد البيض في يد واحدة، بدوره على أداة دوارة DREMEL مع 15/16 بوصة قطع عجلة المرفقة وجعل اثنين من التخفيضات عرضية فقط عميقة بما فيه الكفاية لقطع طريق الصدفة لكن ليست عميقة بما فيه الكفاية لقطع كل الطريق وصولا الى الاكتئاب CAM. جعل التخفيضات حوالي 2 سم في الطول و 1 سم بعيدا عن بعضها البعض. جعل تخفيضات واسعة بما فيه الكفاية بحيث حلقة سيليكون 1 سم في القطر يمكن أن تمر من خلالولكن أرق من عرض الشريط سكوتش القياسية.
- بعد ذلك، جعل 1 قطع طولية بين وفي نهايات اثنين من التخفيضات عرضية عن طريق لمس طفيفة عجلة قطع للقذيفة.
- الشريحة ملقط معقم تحت قطعة قذيفة وبالتوازي مع قذيفة. الاستيلاء على قطعة قذيفة مع ملقط وإزالة قطعة كاملة نظيفة.
- وضع لاصق شفاف على النافذة التي فتحت حديثا، والتأكد من أن يطوي نهاية واحدة على أكثر من نفسه لسهولة إزالة.
- مكان البيض مرة أخرى في حاضنة في علبة البيض (وليس في رفوف البيض بالتناوب) حتى وقت التلقيح.
3. التلقيح
- إبقاء الطابق السفلي خليط من البروتين الغشاء، مثل matrigel، على الثلج (لمنع البلمرة) ومكان في غطاء محرك السيارة.
- استخدام 2 مم EDTA لفصل الخلايا (4-5 مل لكل قارورة T75) وقوارير مكان في نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 5 دقائق.
- resuspend الخلايا فصل في وسائل الإعلام والعد باستخدام عدادة الكريات والأزرق التريبان. استخدام بين 500،000 طنس 2،000،000 الخلايا للتطعيم على CAM، اعتمادا على خط الخلية. تحسين عدد مناسب في التجارب الأولية.
- حجم التدبير اللازمة لعدد الخلايا المناسبة وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق.
- تجاهل وطاف resuspend ثم بيليه الخلية في 40 μ لتر من PBS ++ و 20 μ لتر من خليط الغشاء القاعدي.
ملاحظة: عند هذه النقطة، والخلايا يمكن علاجها بالعقاقير أو وكلاء اختبارات أخرى حسب الحاجة لإجراء التجارب عن طريق إعادة التعليق في الخلية / الطابق السفلي خليط غشاء تعليق. بدلا من ذلك، وكلاء يمكن pipetted على الخلية / الطابق السفلي خليط غشاء تعليق بعد التطعيم. - استرداد رف البيض مع البيض من الحاضنة ومكان في غطاء تدفق الصفحي.
- الشريط انزع من النافذة، استرداد 1 مم حلقة من السيليكون من الغطاء من قارورة المبردة باستخدام ملقط معقم، وإسقاط عصابة من خلال النافذة.
- الماصة 60 μ حل ل خلية من برنامج تلفزيوني ++ والغشاء القاعدي mixturالبريد مباشرة في وسط الحلبة سيليكون يستريح على CAM.
- إعادة الشريط النافذة ونقل رف البيض إلى الحاضنة. عند هذه النقطة، يجب توخي الحذر عند نقل البيض كما الحلبة وتعليق الخلية يمكن بسهولة يصبحون مشردين.
- السماح أورام لتنمو لمدة 5 إلى 7 أيام.
4. حصاد الأورام
- وضع تحت وسادة في غطاء محرك السيارة. إعداد 35 × 10 ملم وحاويات لوحات امتصاص العرق حسب الحاجة لالأنسجة. وضع 1 مل PBS ++ في كل 35 × 10 ملم لوحة.
- ضع حقيبة واقية في غطاء محرك السيارة. خذ مقص تشريح العقيمة وادخال الطرف المدبب في البيض في حفرة قرب نهاية ختمها.
- خفض حول البيض كله طوليا.
ملاحظة: CAM والورم مع عصابة يجب ان يلتزم النصف العلوي من وعاء مع النافذة. - باستخدام مقص تشريح وملقط، تشريح الورم بعيدا عن CAM ومكان الورم في ملم لوحة 35 × 10. قياس ووزن الأورام. الأورام الثابتة في paraformaldehyدي ثم البارافين تضمين-لاستخدامها في الأنسجة والمناعية التجارب.
5. (اختياري): ورم الخلية تفارق
- استخدام مقص تشريح لتخطر على الورم في ملم لوحة 35 × 10. صب الورم مفروم في أنبوب الطرد المركزي 15 مل وإزالة PBS قدر ++ ممكن من خلال pipetting ل.
- إضافة 2 مل من كولاجيناز (1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني ++)، وتحويل أنبوب على مدى عدة مرات، واحتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل (تصل إلى عدة ساعات).
- إضافة 5 مل وسائل الإعلام إلى كل أنبوب و resuspend بدقة من قبل pipetting صعودا وهبوطا من 20 - 40X. pipetting لشامل هو أمر حاسم لكامل تفكك خلية.
- السماح الرواسب ليستقر، وطاف لنقل أنبوب جديد. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف، تاركا وراءه بيليه الخلية فصلها.
ملاحظة: عند هذه النقطة، والكريات الخلايا يمكن استخدامها لتجارب مختلفة (التدفق الخلوي، تحلل للاستخدام في الغرب النشاف، والعزلة RNA، الخ). كما يمكن الحصول على العدد الكلي للخلية السرطانية باستخدام عدادة الكريات وتلطيخ التريبان الأزرق. لاحظ أن الخلايا أصغر بيضاوية الشكل هي خلايا الدجاج من CAM، وينبغي ألا تحسب الخلايا السرطانية. يجب أن يكون هناك عدد ضئيل من تلويث غير ورم (CAM) الخلايا إذا تم تشريح الورم بعيدا عن CAM بعناية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتظهر الصور التمثيلية من الخطوات الرئيسية في البروتوكول هنا. الشكل 1A يدل على استخدام كاندلر لتصور الجنين النامي، كيس الهواء، والأوعية الدموية من CAM إظهار الشكل 1B-1C عملية اسقاط CAM بجعل اثنين من الثقوب ثم الضغط السلبي باستخدام لمبة السلامة، و1D الشكل يدل على تراجع بنجاح CAM مع فقاعة الهواء كبيرة تحت حفرة بعلامات قلم رصاص. الشكل 1E والشكل 1F تثبت استخدام الأداة الدوارة DREMEL لجعل الضرورة تخفيضات في وعاء فوق فقاعة الهواء والنافذة التي فتحت في وعاء مع CAM أوعية دموية يتعرض الداخل.
وقد نمت ثلاثي الأبعاد، وأورام أوعية دموية بنجاح باستخدام HCC الإنسان خطوط الخلايا HUH7 (الشكل 2A-2B) والمجلس التشريعي الفلسطيني / PRF / 5 (الشكل 2C-2D). الأورام نمت من HUH7 والمجلس التشريعي الفلسطيني / PRF / 5 خلايا مرحبا stologically تشبه HCC غير متمايزة (الشكل 2E-2F)، وكذلك تشبه HUH7 والمجلس التشريعي الفلسطيني / PRF / 5 الأورام التي تزرع في نماذج الفئران طعم أجنبي 15،16. وعلاوة على ذلك، تم التحقق من صحة استخدام وزن الورم كمقياس لحجم الورم عن طريق إثبات أن وزن الورم كان يرتبط بعلاقة متبادلة مع عدد خلايا الورم الكلي التي تم الحصول عليها بعد تفكك كامل للأورام باستخدام كولاجيناز (الشكل 3).
باستخدام هذا البروتوكول، تم تحقيق معدلات البقاء على قيد الحياة الجنينية لمدة تصل إلى 93٪ (الجدول 1). ويبين الجدول 1 تجميع البيانات من ثلاث تجارب HCC منفصلة في نموذج CAM طعم أجنبي. من ما مجموعه 33 البيض التي تم زرعها بنجاح مع 500،000 الخلايا السرطانية (HUH7 أو المجلس التشريعي الفلسطيني / PRF5)، أسفرت سوى 3 بيضات في الفرخ وفاة الجنين، وهو معدل البقاء على قيد الحياة من 90.9٪. وعلاوة على ذلك، تم الأورام نمت بشكل موثوق جدا بعد 5 أيام، إلى 100٪ (30/30) من البيض مع الأجنة على قيد الحياة نجحت تشكيل الورم.
ق ق = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 1. اسقاط CAM وفتح نافذة في شل. (A) تحديد الأجنة (السهم الأزرق) والأوعية الدموية (السهم الأسود) باستخدام كاندلر، (B) إحداث ثقب في شل، (C) تطبيق شفط للهول في طبيعيا كيس الهواء، (D) تصور فقاعة الهواء عرض اسقاط الناجح لCAM بعيدا عن شل، (E - F). فتح نافذة في شل باستخدام أداة الروتاري دريميل الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. CAM يدعم نمو ثلاثي الأبعاد، أوعية دموية الأورام التي تشبه تشريحيا HCC غير متمايزة. (A - B) نمو الورم بعد 5 أيام في نموذج CAM، خلايا HUH7 (500،000 الخلايا المصنفة) (الحانات نطاق = 1 سم)، (C - D) نمو الورم بعد 5 أيام في نموذج CAM، PLC / PRF / 5 الخلايا (500،000 خلايا المصنف) (الحانات نطاق = 1 سم)، (E-F) الأنسجة من HUH7 والمجلس التشريعي الفلسطيني / PRF / 5 الأورام، على التوالي (الحانات نطاق = 100 μ م) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم .
ويرتبط إلى حد كبير الشكل 3. قطعة ورم الوزن مقابل عدد خلايا. وزن الورم مع إجمالي عدد خلايا الورم بعد collagenasالبريد التفكك.
| إجمالي عدد البيض | في المئة من البيض مع بقاء الفرخ الجنين | معدل ورم يأخذ في البيض مع الأجنة على قيد الحياة | |
| HUH7 | 27 | 92.6٪ (25/27) | 100٪ (25/25) |
| المجلس التشريعي الفلسطيني / PRF / 5 | 6 | 83.3٪ (5/6) | 100٪ (5/5) |
| عموما | 33 | 90.9٪ (30/33) | 100٪ (30/30) |
الجدول 1. الجنينية بقاء الأسعار ومعدلات ورم يأخذ في نموذج CAM باستخدام اثنين HCC الإنسان خطوط الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
العديد من الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول على الأرجح حساب لتحسين البقاء على قيد الحياة الجنينية، وكذلك زيادة موثوقية نمو الورم. اسقاط CAM بعيدا عن قذيفة من خلال تطبيق الشفط لكيس الهواء هو أقل الغازية من الطرق الأخرى القائمة (باستخدام إبرة لإزالة الزلال من البيضة، تشريح حادة، وما إلى ذلك). باستخدام دبوس دفع العقيمة لإنشاء اثنين من الثقوب الصغيرة المطلوبة لهذه الطريقة هو الجزء الأكثر تحديا للبروتوكول. يمكن استخدام الكثير من القوة يؤدي إلى تلف الأوعية الدموية CAM وعن طريق الإفراط في اختراق مع دبوس دفعة أو يمكن أن يؤدي حتى في تكسير أو تحطيم البيض. التدريب العملي على الممارسة باستخدام دبوس دفعة لجعل ثقوب صغيرة في غير مخصبة، اشترى البقالة البيض يمكن أن تقلل الأخطاء التي ارتكبت خلال المحاولة الأولى في إسقاط CAM. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الإيثانول أو حلول مطهر أخرى لتنظيف قذيفة يقلل قابلية الجنينية، ويجب تجنبها. وأخيرا، وذلك باستخدام حلقة من السيليكون معقمة ل&# 8220؛ زريبة "الخلايا السرطانية في مكان واحد محدد بعد البذر يساعد في نمو الورم، ويسهم في ارتفاع معدل الورم اتخاذ ينظر في بروتوكول لدينا.
من المرجح أن تكون هناك حاجة بعض التحسين من الخطوات الحاسمة في البروتوكول عند العمل مع خطوط مختلفة من الخلايا و / أو المخدرات. العدد المقترح من خلايا الزرع هو بين 0.5 و 2 مليون نسمة، ولكنها قد تتطلب بعض خطوط الخلايا أعلى أو أقل كثافة البذر لتشكيل لطيفة، ورم ثلاثي الأبعاد. يمكن تطعيم عدد قليل جدا من الخلايا تؤدي إلى تكوين الأورام الفقراء، في حين تطعيم عدد كبير جدا من الخلايا يمكن أن يؤدي إلى فرط نمو الورم الذي الورم تحتل حلقة من السيليكون بأكملها، يصبح تملق وأقل ثلاثي الأبعاد من هو المثل الأعلى، ويمكن الهروب من حدود الحلبة . نوصي بإنشاء تجربة أولية لتحديد أفضل كثافة البذر الخلية لأي خط خلية معينة. وعلاوة على ذلك، بعض التعديل لمعيار في تركيزات الدواء في المختبر يمكن أن تتطلبد. نحسب تركيز الدواء مع الإشارة إلى الحجم الكلي التي بذرت على CAM (60 ميكرولتر)، ولكن هناك حاجة في بعض الأحيان تركيزات المخدرات "أعلى" من تلك التي استخدمت في التجارب موازية في المختبر من أجل أن نرى آثار ذلك على نمو الورم، ويفترض نظرا ل امتصاص من خلال CAM وتشتت المخدرات لبقية البيض.
بعد التحسين الناجح لبروتوكول لخطوط خلية معينة والمخدرات، ونموذج طعم أجنبي CAM يمكن استخدامها لتحقيق مجموعة متنوعة واسعة من خصائص الورم والآليات الخلوية. ويمكن تقييم نمو الورم من خلال الوزن وقياسات حجم فضلا عن مجموع عدد الخلايا السرطانية. الأورام يمكن أن تكون ثابتة وتعرضوا لالمناعية وصمة عار للعلامات الورم أو بروتينات معينة من الاهتمام. يمكن تقييم الأوعية الدموية عن طريق تلطيخ لSNA1، التي بقع تحديدا الخلايا البطانية الفرخ 17. الخلايا السرطانية يمكن هي lysed للاستجواب من المسارات الجزيئية. وكخطوة وسيطة في سد نقية في العمل في المختبر مع نماذج أكثر تعقيدا من السرطان مثل النماذج الحيوانية مثلي، ونموذج طعم أجنبي CAM هو وسيلة فعالة من حيث التكلفة للحصول على البيانات بسرعة في الإعداد الذي هو أكثر بيولوجيا أهمية من الخلايا المزروعة في الثقافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma--an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241 (2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58 (2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522 (2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485 (2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
