Abstract
鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）开始7天受精后制定和成熟通过12天的CAM是自然免疫缺陷和高度血管，使其成为肿瘤植入的理想系统。此外，所述CAM包含细胞外基质蛋白，如纤连蛋白，层粘连蛋白，胶原蛋白，整合素（v）的β3，和MMP-2，使其成为有吸引力的模型来研究肿瘤侵袭和转移。科学家长期以来采取所述CAM的生理学优点通过使用它作为血管生成的模型。最近，CAM分析已被修改，使其成为对各种癌症的体内异种移植物模型体系桥接基本体外工作和更复杂的动物癌症模型之间的差距。 CAM分析允许肿瘤生长，抗肿瘤疗法，和亲肿瘤分子途径以生物相关的系统，既具有成本和时间有效的研究。在这里，我们描述了CAM的Xen的发展肝细胞癌（HCC）的高达93％的胚胎存活率和可靠的肿瘤ograft模型上导致立体，血管瘤的生长。
Introduction
肝细胞癌（HCC）是癌症死亡率在世界1中的第三大原因。目前，只有30％的肝癌患者有资格有可能治愈手术治疗2，和全身化疗不灵验3。因此，有迫切未满足的临床需要新的肝癌的治疗，并且适用于新的代理程序有效的测试模型系统的发展。鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）试验提供了在体内测试潜在的抗肿瘤药物的可重复的，具有成本效益，并快速介质通量方法。
CAM分析已被广泛用于研究血管生成4。还已经成功地发展成癌症的肿瘤异种移植物模型，包括成胶质细胞瘤5，胰腺癌6，黑素瘤7-9和骨肉瘤10-11 无论是在OVO 12 和前OVO13技术已被用在文献中，以改变从协议到协议的细节。一个主要的挑战CAM移植瘤模型是胚胎死亡的操控卵子后的发病率比较高，与已发表 的鸡胚死亡率从25 - 50％的11-14。
在这篇文章中，我们描述了一个卵内肝癌移植瘤模型，可靠地产生三维，血管瘤的病理类似未分化肝癌生长的发展。我们已经适应首先由Ossowski 等人 14所述的协议，并已实现了高达93％鸡胚存活率具有极高的肿瘤植入。
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Protocol
1.卵孵化
- 获得8天龄的无特定病原体鸡胚。
- 将鸡蛋在旋转蛋托，朝上加盖结束，并把一个鸡蛋孵化器内的旋转托盘。孵化鸡蛋48小时在36℃和50％的湿度。
2.删除的CAM和打开鸡蛋
- 从孵化器收集的鸡蛋。将鸡蛋放在蛋架，加盖的一面朝上，并提请层流罩。
- 关闭室和发动机罩灯。
- 轻轻握住蛋的加盖端蛋坎德勒以暴露所述CAM的脉管以及空气囊。
注：蛋烛台是用于可视化发育中的胚胎和相关的空气囊和血管的光源。 - 在两个主要血管之间的铅笔标记。
- 开灯，并使用无菌推针使一个孔在气囊（加盖端）之上蛋的尖端和一个孔在所述的pencil大关。不要推则推销一路过关斩将;大约3毫米的孔深通常就足够了。
- 把灯关掉。挤压安全球，稳稳地按下开口端对上方的空气囊孔。应用吸拉空气进入孔在铅笔标记，导致CAM下落离开壳的铅笔标记。
- 检查空气囊已经从卵到使用坎德勒铅笔标记孔加盖结束感动。如果没有，用图钉，使两个孔略深，然后用安全球重新申请吸力。
- 开灯。拿着一手拿鸡蛋，打开DREMEL旋转工具连接了15/16英寸的切割轮，并两次横向切割只是深足通过壳削减，但不够深削减一路下跌至郁闷CAM。使约2厘米长，1厘米彼此间隔开的切口。使切口足够宽，从而硅环1厘米，直径可通过但比标准的透明胶带宽度更薄。
- 接着，通过轻轻接触切割轮与壳之间做出，并在两次横向切割的端部1纵向切口。
- 滑动壳片和平行于下壳无菌镊子。抢壳片的镊子和删除干净整片。
- 将透明胶带在新打开的窗口中，确保了自身折叠一端，便于拆卸。
- 将鸡蛋放回孵化器中的蛋托（而不是在旋转蛋架），直到接种时间。
3.接种
- 保持基底膜蛋白混合物，如基质胶，在冰上（防止聚合），并装在罩。
- 使用2mM EDTA的分离的细胞（4 - 每个T75烧瓶5毫升）并置于烧瓶中的组织培养培养箱中5分钟。
- 重悬分离的细胞介质，并使用血球和台盼蓝计数。间50万吨使用Ø2000000细胞移植到CAM，取决于细胞系。优化在初步实验中的适当数量。
- 在500 XG需要合适的细胞数量和离心5分钟测量体积。
- 弃上清，然后悬浮细胞沉淀在40μ微升PBS ++和20μ升基底膜的混合物。
注意：在这一点上，细胞可以用药物或其他测试试剂如重悬到细胞/基底膜混合物悬浮所需实验处理。另外，代理可以嫁接后吸至电池/基底膜混合物悬浮体。 - 检索与从培养箱和发生在层流罩鸡蛋蛋架。
- 剥离胶带关闭窗口，检索从使用灭菌镊子低温小瓶的帽的1毫米硅胶圈，并通过窗口滴环。
- 吸取PBS的60μ升细胞溶液++和基底膜mixturË直接进入硅胶圈搁在所述CAM的中心。
- 胶带重新贴到窗口，移动蛋架回孵化器。在这一点上，请小心地移动鸡蛋为环和细胞悬浮液时，很容易成为流离失所。
- 允许肿瘤生长5至7天。
4.收获肿瘤
- 在引擎盖下面垫的地方。根据需要，用于组织学准备35×10mm的板和多聚甲醛的容器。放1毫升的PBS ++中的每一个35×10毫米的钢板。
- 将生物危害袋罩。以无菌解剖剪刀和在接近年底加盖孔插入尖端进入卵子。
- 整个鸡蛋围绕纵向切开。
注意：所述CAM和肿瘤与环应粘到外壳与窗口的上半部分。 - 用解剖剪和钳子，解剖肿瘤远离CAM和放置肿瘤中的35×10毫米的钢板。测量和称重肿瘤。在paraformaldehy修复肿瘤德然后石蜡嵌入它们的组织学和免疫组织化学实验。
5.（可选）：肿瘤细胞分离
- 使用夹层剪刀剁碎在35×10毫米的钢板肿瘤。倾切碎肿瘤入15ml离心管中，并除去尽可能多的PBS ++尽可能通过移液。
- 加入2毫升胶原酶（1mg / ml的在PBS ++），转管数次，孵育管中在37℃下至少30分钟（长达数小时）。
- 加入5 ml的媒体到每个管中，通过上下抽吸20重悬彻底 - 40倍。彻底移液是完整的细胞分离的关键。
- 允许沉淀沉降，将上清液转移到新的管中。离心在500×g离心5分钟。除去上清液，留下游离的细胞团。
注意：在这一点上，细胞沉淀可用于各种实验（流式细胞术，裂解为在Western印迹，RNA分离等用途）。总肿瘤细胞计数也可使用血细胞计数器和台盼蓝染色获得的。需要注意的是较小的，椭圆形的细胞是鸡细胞从CAM和不应该算作肿瘤细胞。应该有污染性非肿瘤（CAM）细胞如果肿瘤是从所述CAM解剖远仔细的最少数量。
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Representative Results
在协议的关键步骤代表性照片在这里显示。 图1A示范了使用坎德勒形象化发育中的胚胎中，空气囊，和所述CAM的脉管系统的图1B-1C示出通过使丢弃的CAM的过程的两个孔，然后施加负压使用安全灯泡，并且图1D示出一个成功删除的CAM用铅笔标记孔下一个大的气泡。 图1E和图1F展示DREMEL旋转工具的使用，以进行必要的削减在上面的气泡，并在外壳内的暴露血管CAM打开的窗口的外壳。
立体，血管瘤使用人HCC细胞系HUH7（图2A-2B）和PLC / PRF / 5（图2C-2D）中成功地生长。从HUH7和PLC / PRF / 5细胞生长的肿瘤喜stologically类似于未分化的HCC（ 图2E-2F），也类似在小鼠异种移植模型15,16生长HUH7和PLC / PRF / 5肿瘤。此外，使用的肿瘤重量通过表明肿瘤重量是高度相关的使用胶原酶（图3）肿瘤完全离解后得到的总肿瘤细胞计数进行了验证肿瘤大小的测量。
使用此协议中，高达93％的胚胎存活率达到（表1）。 表1示出从在CAM异种移植模型三个独立实验的HCC聚合的数据。在总共33个鸡蛋已成功移植50万肿瘤细胞（HUH7或PLC / PRF5）中，只有3个鸡蛋导致鸡胚死亡，90.9％的整体生存率。此外，肿瘤被非常稳定地生长5天后，如鸡蛋与存活的胚胎的100％（三十分之三十）已成功肿瘤的形成。
图1.删除了CAM和打开的命令行管理程序窗口。 （一）胚胎的鉴定（蓝色箭头）和脉管（黑色箭头）使用坎德勒，（b）做壳牌一孔，（c）将吸去孔中天然存在的气囊，（D）可视化气泡显示凸轮的成功滴离壳，（E - F）。打开使用的Dremel旋转工具，在命令行管理程序窗口，请点击此处查看该图的放大版本。
图2的CAM支持的三维生长，血管瘤的组织学上类似未分化肝癌。 （A - B）后第5天，在CAM模型，HUH7细胞肿瘤生长（500,000细胞接种）（比例尺为1厘米），（C - D）肿瘤后第5天，在CAM模型增长，PLC / PRF / 5细胞（500,000细胞接种）（比例尺为1厘米），HUH7与PLC（E-F）组织学/ PRF / 5肿瘤，分别为（比例尺= 100μM） 点击此处查看该图的放大版本。 。
图3.绘制肿瘤重量与细胞计数。肿瘤的重量是高度相关的collagenas后总的肿瘤细胞计数Ë解离。
| 鸡蛋总数 | 鸡蛋与鸡胚胎存活率的百分比 | 率肿瘤采取鸡蛋存活的胚胎 | |
| HUH7 | 27 | 92.6％（25/27） | 100％（25/25） |
| PLC / PRF / 5 | 6 | 83.3％（5/6） | 100％（5/5） |
| 总体 | 33 | 90.9％（30/33） | 100％（三十零分之三十〇） |
肿瘤表1.胚胎存活率和价格您可以在两种人类肝癌细胞系的CAM模型。
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Discussion
在这个协议中几个关键步骤最有可能占了改进的胚胎存活以及肿瘤生长的增加的可靠性。通过施加抽吸到空气囊丢弃所述CAM远离壳是侵入性比其它现有的方法（使用针从卵，钝性分离等除去白蛋白）以下。使用无菌图钉创造这种方法需要使用两个小孔是协议中最具挑战性的部分。使用过大的力可能会损坏到CAM及其脉管通过过度穿透的推针或者甚至可能导致破裂或破坏的蛋。使用图钉动手实践，使非受精，杂货店买来的鸡蛋小孔可以最大限度地减少在下降的CAM的第一次尝试时所犯的错误。此外，使用乙醇或其它消毒剂溶液清洁壳减小胚胎活力，并且应该避免。最后，用无菌硅胶圈到＆＃8220;畜栏“的肿瘤细胞在一个特定的位置在接种肿瘤生长助攻，并有助于肿瘤的高利率后拍摄出现在我们的协议。
用不同的细胞系和/或药物中工作时将最有可能被要求在协议关键步骤一些优化。细胞播种的建议的数量为0.5和200万之间的，但某些细胞系，可能需要更高或更低的接种密度，以形成一个好的，三维肿瘤。接枝太少细胞可导致肿瘤形成不良，而接枝太多细胞可导致肿瘤过度生长，其中肿瘤占据整个硅氧烷环，变得平坦和较少三维比是理想的，并能逃脱环的边界。我们建议设置一个初步实验，以确定最佳的细胞接种密度为任何特定的细胞系。此外， 在体外的药物浓度进行一些调整，以标准的，可要求ð。我们计算药物浓度，参照被接种到所述CAM（60 微升）的总体积，但有时“更高”的药物浓度高于体外平行实验中使用的需要，以便看到对肿瘤生长的影响，大概是由于通过吸收CAM和药物分散到鸡蛋的其余部分。
该协议为特定细胞系和药物的成功优化后，所述CAM异种移植物模型可用于研究多种肿瘤特性和细胞机制的。肿瘤的生长可通过重量和大小的测量以及总肿瘤细胞计数进行评估。肿瘤可以固定并进行免疫组织化学染色对肿瘤标志物或感兴趣的特定蛋白质。血管生成可以通过染色SNA1，其特异性地染色小鸡内皮细胞17进行评估。肿瘤细胞可用于溶解的分子途径的审讯。如在桥接纯与癌症更复杂的模型体外工作一个中间步骤，例如原位的动物模型，所述CAM异种移植物模型是快速获取数据中的设置是更生物学相关比培养物中生长的细胞的成本效益的方法。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
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