Abstract
Die Hühner-Chorioallantoismembran (CAM) beginnt am Tag 7 nach der Befruchtung zu entwickeln und reift bis zum Tag 12. Die CAM ist natürlich immungeschwächten und gefäßreiche, so dass es ein ideales System für die Tumorimplantation. Weiterhin enthält der CAM extrazelluläre Matrixproteine wie Fibronektin, Laminin, Kollagen, Integrin alpha (v) beta3 und MMP-2, so dass es ein attraktives Modell zur Tumorinvasion und Metastasenbildung zu untersuchen. Wissenschaftler haben lange Vorteil der Physiologie des CAM durch Verwendung als ein Modell der Angiogenese gemacht. Vor kurzem hat der CAM-Assay wurde geändert, um als ein in vivo-Xenotransplantat-Modellsystem für verschiedene Krebsarten, die die Lücke zwischen Grundlagenarbeit in vitro und komplexere Tierkrebsmodellen überbrückt zu arbeiten. Der CAM-Test ermöglicht die Untersuchung von Tumorwachstum, Anti-Tumor-Therapien und pro-Tumor molekularen Wege in einem biologisch relevanten System, das sowohl kosten- und zeiteffektiv ist. Hier die Entwicklung von CAM xen beschreiben wirograft Modell des hepatozellulären Karzinoms (HCC) mit embryonalen Lebensraten von bis zu 93% und zuverlässigen Tumor nehmen, um das Wachstum von dreidimensionalen, vaskularisierten Tumoren führt.
Introduction
Das Leberzellkarzinom (HCC) ist die 3. häufigste Ursache der Krebssterblichkeit in der Welt 1. Derzeit werden nur 30% der HCC-Patienten sind für potenziell kurative chirurgische Behandlungen 2 und systemische Chemotherapie nicht wirksam ist 3. Daher besteht ein dringender ungedeckten klinischen Bedarf nach neuen HCC-Therapien, und die Entwicklung von Modellsystemen für eine effiziente Prüfung von neuen Wirkstoffen. Hühnchen-Chorioallantois-Membran (CAM) Assay liefert eine reproduzierbare und kosteneffiziente und schnelle mittleren Durchsatz Verfahren zum Testen potentiellen Antitumormedikamenten in vivo.
Das CAM-Assay wurde ausgiebig verwendet, um die Angiogenese 4 studieren. Es wurde auch erfolgreich in einem Tumor-Xenotransplantat-Modell von Krebs entwickelt, einschließlich Glioblastom 5, Bauchspeicheldrüsenkrebs 6, Melanom 7-9 und Osteosarkom 10-11. Sowohl in ovo 12 und ex ovo13 Techniken sind in der Literatur verwendet worden, mit Details variierend von Protokoll zu Protokoll. Eine große Herausforderung für die CAM-Xenograft-Modell ist die relativ hohe Inzidenz von embryonalen Tod nach Manipulation des Ei, mit veröffentlichten Hühnerembryosterblichkeit reicht von 25 bis 50 Prozent 11-14.
In diesem Artikel beschreiben wir die Entwicklung eines in-ovo-Xenograft-Modell des HCC, die zuverlässig das Wachstum von dreidimensionalen, vaskularisierten Tumoren, die histologisch ähnlich undifferenziert HCC produziert. Wir haben ein Protokoll zuerst von Ossowski et al. 14 beschrieben angepasst und chick embryonale Überlebensraten von bis zu 93% mit extrem hoher Tumor engraftment erreicht.
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Protocol
1. Egg Incubation
- Erhalten Sie 8 Tage alt spezifischen pathogenfreien befruchteten Eiern.
- Zeigen Eier in rotierenden Eierablage, gestempelt Enden nach oben zeigen, und setzen Sie den Drehkorb in einem Ei-Inkubator. Eier Inkubieren für 48 Stunden bei 36 ° C und 50% Luftfeuchtigkeit.
2. Löschen Sie die CAM und Öffnen der Eier
- Sammeln Eier aus Inkubator. Platz Eier im Eierregal, gestempelt Seite nach oben und bringen Sie zu Sterilbank.
- Schalten Sie die Zimmer und Kapuze Lichter.
- Halten Sie die gestempelt Ende Ei leicht, um das Ei Candler, um die Gefäßsystem des CAM sowie die Luftsack freizulegen.
HINWEIS: Das Ei candler ist ein verwendet, um den sich entwickelnden Embryo und zugehörigen Luftsack und Gefäßsystem zu visualisieren Lichtquelle. - Legen Sie einen Bleistiftstrich zwischen zwei großen Blutgefäße.
- Schalten Sie das Licht und mit einem sterilen Push-Pin, um ein Loch an der Spitze des Eis über dem Luftsack (gestempelt Ende) und ein Loch an der pe machenNciI Marke. Schieben Sie die Push-Pin den ganzen Weg durch; ein Loch ca. 3 mm tief üblicherweise ausreichend.
- Schalte das Licht aus. Squeeze Sicherheitskugel Drücken der offenen Ende fest gegen das Loch über dem Luftsack. Absaugen, um Luft in das Loch an der Bleistiftstrich zu ziehen, wodurch der CAM an der Bleistiftstrich weg von der Schale fallen.
- Prüfen, ob der Luftsack aus dem Stanz Ende des Eis auf den Bleistift markierte Loch mit der candler bewegt. Wenn nicht, verwenden Sie die Push-Pin beide Löcher etwas tiefer zu machen und dann erneut bewerben Saug mit der Sicherheitskugel.
- Schalten Sie das Licht. Mit dem Ei in einer Hand, schalten Sie den Dremel Rotationswerkzeug mit einer 15/16-Zoll-Trennscheibe angebracht und stellen zwei Querschnitte nur tief genug, um durch die Schale geschnitten, aber nicht tief genug, um den ganzen Weg hinunter zu der gedrückten geschnitten CAM. Stellen die Schnitte etwa 2 cm Länge und 1 cm voneinander entfernt sind. Nehmen Sie die Schnitte breit genug ist, so dass ein Silikonring 1 cm Durchmesser passieren kannaber dünner als die Breite der Standard-Klebeband.
- Als nächstes stellen Sie 1 Längsschnitt zwischen und an den Enden der beiden Querschnitte durch leichtes Berühren der Trennscheibe auf die Schale.
- Schieben einer sterilen Pinzette unter dem Mantelteil und parallel zur Schale. Besorgen Sie sich die Shell-Stück mit der Zange und das ganze Stück sauber zu entfernen.
- Legen Sie Klebeband über dem neu geöffneten Fenster, so dass Sie sicher, dass an einem Ende zum leichteren Entfernen fach über sich selbst.
- Die Eier zurück in Inkubator in der Eierschale (in den sich drehenden Eies Racks) bis zum Zeitpunkt der Impfung.
3. Impfung
- Halten Basalmembranprotein Gemisch, wie Matrigel, auf Eis in der Haube (um die Polymerisation zu verhindern) und Ort.
- Verwenden 2 mM EDTA, um Zellen zu trennen (4-5 ml pro T75-Flasche) und bringe Kolben für 5 Minuten in Gewebekultur-Inkubator.
- Resuspendieren der abgelösten Zellen in Medien und rechnen mit einer Zählkammer und Trypanblau. Verwenden Sie zwischen 500.000 to 2.000.000 Zellen zum Pfropfen auf dem CAM, je nach Zelllinie. Optimieren Sie die richtige Zahl in Vorversuchen.
- Maßnahme Volumen für geeignete Zellzahl und Zentrifuge bei 500 xg für 5 min benötigt.
- Überstand verwerfen und dann resuspendieren Zellpellet in 40 μ l PBS ++ und 20 μ l der Basalmembran Mischung.
HINWEIS: An diesem Punkt können die Zellen mit Arzneimitteln oder anderen Testmitteln für Experimente benötigt wird durch Resuspendieren in die Zelle / Basalmembran Gemisch Suspension behandelt. Alternativ können Mittel auf die Zelle / Basalmembran Mischung Suspension nach der Transplantation pipettiert werden. - Abrufen Eierregal mit Eier aus dem Inkubator und Platz in der Sterilbank.
- Peel off Band des Fensters, rufen Sie eine 1 mm Silikonring von der Kappe eines kryogenen Fläschchen mit sterilisierten Pinzette und legen Sie den Ring durch das Fenster.
- Pipettieren Sie die 60 μ l Zell Lösung von PBS ++ und Basalmembran Mixture direkt in das Zentrum des Silikonring auf der CAM ruht.
- Re-Band das Fenster und verschieben Eierablage zurück zum Inkubator. An dieser Stelle seien Sie vorsichtig beim Bewegen der Eier als dem Ring und der Zellsuspension kann leicht verschoben werden.
- Ermöglichen Tumoren, für 5-7 Tage wachsen gelassen.
4. Ernten Tumoren
- Zeigen under-Pad in der Haube. Vorbereitung 35 x 10 mm Platten und Paraformaldehyd als Container für die Histologie notwendig. Setzen Sie 1 ml PBS ++ je 35 x 10 mm Platte.
- Zeigen BIOHAZARD Beutel in der Haube. Nehmen sterile Dissektion Schere und legen Sie das spitze Ende in das Ei in das Loch in der Nähe des Ende gestempelt.
- Um den gesamten Ei längs geschnitten.
Hinweis: Die CAM und der Tumor mit dem Ring sollte auf die obere Hälfte der Schale mit dem Fenster zu halten. - Verwendung Dissektion Schere und Pinzette, sezieren den Tumor von der CAM und legen Tumor in der 35 x 10 mm Platte. Messen und wiegen Tumoren. Festen Tumoren in paraformaldehyde und sie für die Verwendung in der Histologie und Immunhistochemie Experimenten in Paraffin eingebettet werden.
5. (Optional): Tumor Zelldissoziation
- Verwenden Sie Dissektion Schere, um den Tumor in der 35 x 10 mm Platten Blatt vor den Mund. Pour Hackfleisch Tumor in ein 15 ml Zentrifugenrohr entfernen und so viel PBS ++ wie möglich durch Pipettieren.
- 2 ml Collagenase (1 mg / ml in PBS ++) biegen Rohr über mehrere Male, und inkubieren Rohr bei 37 ° C für mindestens 30 min (bis zu mehrere Stunden).
- 5 ml Medium in jedes Röhrchen und gründlich resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren 20 - 40x. Gründliche Pipettieren ist entscheidend für die komplette Zelle Dissoziation.
- Erlauben Sediment zu begleichen, und den Überstand in ein frisches Röhrchen. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min. Überstand entfernen und hinterlässt dissoziierten Zellpellet.
HINWEIS: An diesem Punkt kann die Zellpellets für verschiedene Experimente verwendet werden (Durchflusszytometrie Lyse für die Verwendung in Western Blots, die RNA-Isolierung, usw.). Gesamttumorzellzahl kann auch mit einer Zählkammer und Trypanblaufärbung erhalten werden. Beachten, dass kleinere, oval geformte Zellen Hühnerzellen aus dem CAM und sollten nicht als Tumorzellen gezählt. Es sollte eine minimale Anzahl von verunreinigenden Nicht-Tumor (CAM-Zellen), wenn der Tumor vom CAM sorgfältig seziert.
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Representative Results
Repräsentative Abbildungen der wichtigsten Schritte in dem Protokoll werden hier gezeigt. 1A zeigt die Verwendung des candler um den sich entwickelnden Embryo, den Luftsack und das Gefäßsystem des CAM zu visualisieren. 1B-1C zeigen den Vorgang des Fallenlassens der CAM indem die beiden Löcher und dann Anlegen eines Unterdrucks unter Verwendung der Sicherheitskugel und 1D zeigt eine erfolgreich fiel CAM mit einer großen Luftblase unter dem Bleistift markierte Loch. 1E und 1F zeigen die Nutzung des Dremel Rotationswerkzeug die erforderlich sind, um zu machen Schnitte in der Schale über der Luftblase und dem geöffneten Fenster in der Schale mit dem freiliegenden gefäß CAM innerhalb.
Dreidimensionale vaskularisierte Tumore wurden erfolgreich unter Verwendung der humanen HCC-Zellinien HUH7 (2A-2B) und PLC / PRF / 5 (2C-2D) gezüchtet. Tumoren von HUH7 und PLC / PRF / 5-Zellen gezüchtet hallostologically ähneln undifferenzierten HCC (2E-2F) und ähneln HUH7 und PLC / PRF / 5 Tumoren in Maus-Xenograft-Modellen 15,16 gewachsen. Weiterhin wurde die Verwendung von Tumorgewicht als Messung der Tumorgröße durch den Nachweis, daß das Tumorgewicht wurde stark mit insgesamt Tumorzellzahl nach vollständige Dissoziation von Tumoren durch Kollagenase (Abbildung 3) erhalten korreliert validiert.
Unter Verwendung dieses Protokolls embryonalen Überlebensraten von bis zu 93% erzielt wurden (Tabelle 1). Tabelle 1 zeigt, die von drei verschiedenen HCC Experimente im CAM Xenotransplantatmodell aggregierten Daten. Von insgesamt 33 Eiern, die erfolgreich mit 500.000 Tumorzellen (HUH7 oder SPS / PRF5) gepfropft wurden, führten nur 3 Eier im Hühnerembryo Tod, eine Gesamtüberlebensrate von 90,9%. Darüber hinaus wurden Tumoren sehr zuverlässig nach 5 Tagen gewachsen, als 100% (30/30) der Eier mit überlebenden Embryonen erfolgreich war die Tumorbildung.
Abbildung 1. Das Fallenlassen des CAM und Öffnen eines Fenster in der Shell. (A) Bezeichnung des Embryo (blauer Pfeil) und Gefäßsystem (schwarzer Pfeil) mit der Candler, (B), die ein Loch in der Schale, (C) eine Saugwirkung auf das Loch in dem natürlich vorkommenden Luftsack, (D) Visualisierung die Luftblase Zeige Erfolgreiche Dropping der CAM von der Shell, (E - F). Das Öffnen eines Fensters in der Shell mit dem Dremel Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die CAM Unterstützt Wachstum von dreidimensionalen, Vaskularisierte Tumoren, die histologisch Ähneln Undifferenzierte HCC. (A - B) Tumorwachstum nach 5 Tagen in der CAM-Modell, Huh7-Zellen (500.000 Zellen ausgesät) (Maßstabsbalken = 1 cm), (C - D) Tumorwachstum nach 5 Tagen in der CAM-Modell, PLC / PRF / 5 Zellen (500.000 Zellen ausgesät) (Maßstabsbalken = 1 cm), (E-F) Histologie HUH7 und PLC / PRF / 5 Tumoren, bzw. (Maßstabsbalken = 100 μ m) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen .
Abbildung 3. Auftragung der Tumorgewicht gegen Zellzahl. Tumorgewicht ist stark mit insgesamt Tumorzellzahl nach collagenas korrelierte-Dissoziation.
| Gesamtzahl der Eier | Prozent der Eier mit Hühnerembryo-Überleben | Rate der Tumor in Eiern nehmen mit überlebenden Embryonen | |
| HUH7 | 27 | 92,6% (25/27) | 100% (25/25) |
| PLC / PRF / 5 | 6 | 83,3% (5/6) | 100% (5/5) |
| Über alle | 33 | 90,9% (30/33) | 100% (30/30) |
Tabelle 1 embryonale Überlebensraten und Preise der Tumor Nehmen Sie in der CAM-Modell mit zwei menschlichen HCC-Zelllinien.
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Discussion
Mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll wahrscheinlichste Konto für die verbesserte Lebensrate der Embryonen sowie erhöhte Zuverlässigkeit des Tumorwachstums. Fallenlassen der CAM weg von der Schale durch eine Saugwirkung auf den Luftsack ist weniger invasiv als andere bestehende Methoden (mit einer Nadel an Albumin aus dem Ei, stumpf, usw. zu entfernen). Mit einem sterilen Push-Pin, um die beiden kleinen Löcher für dieses Verfahren erforderlich zu schaffen, ist der schwierigste Teil des Protokolls. Mit zu viel Kraft kann zu Schäden an der CAM und dessen Blutgefäßen durch über-Penetration mit der Push-Pin führen oder kann sogar in Risse oder Zerstörung des Eies führen. Praktische Übungen mit einem Push-Pin, um kleine Löcher in unbefruchtete, Lebensmittel gekauften Eier können Fehler während der erste Versuch, Fallenlassen der CAM gemacht minimieren. Weiterhin ist die Verwendung von Ethanol oder einem anderen Desinfektionsmittel, um die Schale Putzen nimmt embryonalen Lebensfähigkeit und sollte vermieden werden. Schließlich mit dem sterilen Silikonring, um &# 8220; Pferch "die Tumorzellen in einer bestimmten Position nach der Aussaat hilft beim Tumorwachstum und trägt zu der hohen Geschwindigkeit des Tumor in unserem Protokoll gesehen werden.
Optimierungen des kritischen Schritte in dem Protokoll wird wahrscheinlich erforderlich, wenn mit unterschiedlichen Zelllinien und / oder Drogen werden. Die vorgeschlagene Anzahl von Zellen zum Impfen zwischen 0,5 und 2 Millionen, aber einige Zellinien können höhere oder niedrigere Einsaatdichten um einen schönen, dreidimensionalen Tumor bilden. Pfropfen zu wenige Zellen können zu einer schlechten Tumorbildung führen, während Pfropfen zu viele Zellen in Tumorwucherung bei dem der Tumor nimmt die gesamte Silikonring, flacher und weniger dreidimensionaler als ideal ist, und kann die Grenze des Rings entweichen führen . Wir empfehlen die Einrichtung einer vorläufigen Experiment, die optimale Zellaussaatdichte für eine bestimmte Zelllinie zu bestimmen. Darüber hinaus wurden einige Anpassungen an die in-vitro-Wirkstoffkonzentrationen erfordern kannd. Berechnet man Wirkstoffkonzentrationen in Bezug auf die Gesamtmenge, die auf den CAM (60 ul) geimpft wird, aber manchmal "höheren" Arzneimittelkonzentrationen als die in parallelen Experimenten in vitro verwendet werden, um die Wirkungen auf das Tumorwachstum vermutlich aufgrund sehen erforderlichen Absorption durch die CAM und Verbreitung von Arzneimittel zu dem Rest des Eies.
Nach erfolgter Optimierung des Protokolls für bestimmte Zelllinien und Medikamente kann die CAM-Xenograft-Modell verwendet, um eine Vielzahl von Tumor-Eigenschaften und zelluläre Mechanismen zu untersuchen. Tumorwachstum durch Gewichts- und Größenmessungen sowie Gesamttumorzellzahlen bewertet werden. Tumore können festgelegt und unterzogen, um Immunhistochemie für Tumormarker oder spezifische Proteine von Interesse zu färben werden. Die Angiogenese kann durch Färbung auf SNA1, die speziell Flecken chick Endothelzellen 17 bewertet werden. Tumorzellen können für die Abfrage der molekularen Signalwege lysiert werden. Als ein Zwischenschritt bei der Überbrückung reine in vitro Arbeiten mit komplexen Modellen von Krebs wie orthotope Tiermodellen ist die CAM-Xenotransplantatmodell eine kostengünstige Möglichkeit zum schnellen Erhalten von Daten in einer Umgebung, die mehrere biologisch relevant als Zellen, die in Kultur gezüchtet.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
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