Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Odling av Published: April 6, 2015 doi: 10.3791/52412
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 1
1Institute of Immunology and Infection Research, University of Edinburgh, 2Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research

Summary

Heligmosomoides polygyrus är en mus nematod med kraftfulla immunmoduler funktioner som liknar dem för högt utbrett mänskligt helmintinfektion. Här beskriver vi ett protokoll för det långsiktiga underhållet av H. polygyrus livscykel.

Abstract

Heligmosomoides polygyrus (tidigare känt som Nematospiroides dubius, och även kallad av vissa som H. bakeri) är en gastrointestinal inälvsmask som sysselsätter flera immunmoduler mekanismer för att etablera kronisk infektion hos möss och liknar förhärskande mänskliga helmintinfektioner. H. polygyrus har studerats ingående inom inälvsmask-derived immunreglering och har visat sig kraftigt undertrycka experimentella modeller av allergi och autoimmunitet (båda med aktiv infektion och isolerade utsöndrade produkter). Det protokoll som beskrivs i detta dokument beskriver hanteringen av H. polygyrus livscykel för konsekvent produktion av L3 larver, återvinning av vuxna parasiter, och insamling av deras utsöndrings-sekretoriska produkter (HES).

Introduction

Heligmosomoides polygyrus är en naturlig mus gastrointestinal inälvsmask som är nära besläktat med högt förhärskande humana nematod parasiter 1. I motsats till andra nematod modeller såsom Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus etablerar konsekvent kronisk infektion hos möss som ett direkt resultat av flera kraftfulla immunmodulermekanismer sysselsätter att undertrycka värdens immunsvar 2.

H. polygyrus har en direkt livscykel: smitt L3 larver har förtärts av FeCo-muntlig överföring (eller administreras genom oral sondmatning i laboratoriemiljö), varefter de flyttar till subserosal lagret av tolvfingertarmen och encyst innan han återvände till tarmlumen som vuxna maskar cirka åtta dagar efter första infektionen. Parning och äggproduktion sker dag 10 och det är möjligt att skörda vuxna maskar för kultur och insamling av utsöndrings-sekretoriska produkter från day 14 och framåt tre. H. polygyrus samverkar dessutom med kommensalism mikroflora, med ökad laktobaciller närvarande i infekterade mottagliga möss 4-6, och ökade nivåer av H. polygyrus infektion efter exponering av möss för laktobaciller 6.

Aktiv infektion med H. polygyrus har visat sig skydda mot immunopatologi i många djurmodeller för autoimmunitet 7-10, kolit 11,12 och allergi 13-16. Det har därför varit stort intresse för de möjligheter som Uttagsklemmor-Sekretoriska molekyler från denna parasit ("HES") till ner-modulera patologi in vivo 17,18. Faktum är skyddande effekter ses efter behandling av möss med HES-produkter 19 genom vägar som nu identifierats 18,20. Här beskriver vi ett protokoll för tillförlitlig produktion av Heligmosomoides polygyrus och återvinning av dess utsöndrade produktersom kan utnyttjas ytterligare för en rad funktionella biokemiska och immunologiska undersökningar.

Protocol

OBS: Alla Metoderna i det här protokollet utförs i enlighet med riktlinjer från den brittiska inrikesdepartementet och University of Edinburgh Veterinary Services.

1. Infektion av möss genom sondmatning

  1. Affär Heligmosomoides polygyrus L3 larver i destillerat vatten i upp till sex månader vid 4 ° C.
  2. Före användning, tvätta L3 larver tre gånger i destillerat vatten: centrifugera vid 300 xg under 10 min (med broms), ta bort alla, men 500 l vatten (för att undvika störande pellet L3 larver) och suspendera pelleten varje gång.
  3. För den tredje tvättningen, tillsätt vatten till en exakt volym (typiskt 40 ml) och aspirera 20 ul med en 200 | il spets skuren för att vidga dess öppning. Placera två 20 ul prover på ytan av en 60 mm odlingsskål och räkna L3 larver (vanligen mobil, och bäst betraktas under 50X förstoring med ett dissektionsmikroskop). Resuspendera slutliga pelleten i destillerat vatten till en concentration av 2000 L3 larver per ml.
  4. För livscykelproduktion, infektera 8 veckor gamla F1 (C57BL / 6xCBA) möss med 400 H. polygyrus L3 larver i 200 l destillerat vatten genom oral sondmatning (hålla möss i upprätt läge genom nackskinnet och försiktigt passera trubbiga sondmatning nålen genom munnen och matstrupen till magsäcken). Skaka noggrant före varje infektion (larver sätter sig snabbt i vatten) och aspirera 200 pl i en 1 ml spruta; använda en dedikerad sondmatning nål med rundad ände. För experimentell infektion i yngre möss (6-8 veckor gamla), eller andra inavlade stammar (t.ex. C57BL / 6 eller BALBc), infektera möss med 200 L3 larver.

2. Förökning och underhåll av H. polygyrus

  1. Placera träkol i centrum av en stor plastbalja och låta kallt kranvatten för att köra över det i minst 30 minuter (unwashed aktivt kol är giftigt för L3 larver). Töm ut vattnet från badkaret och placera kol på two lager av absorberande papper, lämnar det utsätts för rumsluft tills den är helt torr.
  2. Om äggen behövs, skrapa avföring först ut i tjocktarmen med pincett (och saxar vid behov). Om det krävs ett stort antal L3 larver, placera möss på en trådgaller och samla fekal pellets under flera dagar.
  3. Blanda avföring med granulerad träkol vid ett förhållande av åtminstone en 1: 1, för att uppnå en konsistens lagom fuktig att vidhäfta till filterpapper. Stryk ett tunt lager på mitten av något fuktad filterpapper i en petriskål och placera detta i en fuktig låda (lägga till några fuktig pappershandduk och en skål med vatten) i mörker under 12-14 dagar.
  4. Ta L3 larver från dag 7 och framåt, och samla dem på minst två tillfällen innan pappret slängs. Larverna bildar en ring runt kanten av filtrerpappret; lyfta filterpappret ur petriskålen och skölj larverna som finns kvar av plattan (med användning av en pipett och 5 ml sterilt vatten per platta) i ett 50 ml rör.
  5. Liftav filterpapper och skörda den återstående larverna kvar på plattan med destillerat vatten i en 50 ml tub. Centrifugera utströmmande lösningen vid 300 xg under 10 min. Tvätta larver tre gånger med destillerat vatten och sedan lagra vid 4 ° C i upp till 50 ml destillerat vatten tills de behövs.
    OBS: Larver förblir livskraftig och smitt i minst 6 månader.

3. Insamling av Adult H. polygyrus Worms

  1. Förbered modifierade Baermann Apparat i förväg såsom visas i figur 1.
  2. Cull möss fjorton dagar efter infektion.
  3. Tvätta buken med 70% etanol. Skär huden över buken och dra tillbaka för att avslöja den främre bukväggen. Gör mittlinjeincision att komma in i bukhålan.
  4. Avlägsna hela tunn- och tjocktarm (från proximala duodenum till distala rektum). Placera i en torr petriskål.
  5. Räta tarmen längs hela sin längd; excidera avföring innehållande kolon; placera denna i en separat skål för ägg preparat senare.
  6. Excidera proximala 20 cm av tunntarmen som innehåller de vuxna maskar -identified av den relativt tjock vägg av duodenum och ofta ett rött utseende på grund av den intraluminala maskar. Placera i en (100 mm diameter) petriskål med 5 ml Hanks 'lösning, värmdes till 37 ° C (två prover per skål).
  7. Öppna masken fyllda proximala tarmen delen i längdled med sax (runda-slutade sax är bäst för detta), och skrapa ner insidan av tarmen foder med två glasskivor för att ta bort maskar. Sedan kassera rena tarmväggen.
  8. Tips maskar i små muslin väskor, häftklammer stängda och säkra med gem runt kanten på glastratt (Figur 1).
  9. Fyll tratten med Hanks Solution och lägga ca 4 petriskålar av maskar i varje tratt.
  10. Placera apparaten i 37 ° C inkubator för 1-2 timmar, för att försiktigt omskakning halvvägs genom rubbaskräp från tarmen preparatet som kan täppa till muslin filtret. Var noga med att undvika spill av skräp utanför muslin väska - detta kommer att orsaka förorening av den slutliga HES beredningen. Vuxna maskar borde ha långsamt vandrat igenom tunt tyg och bosatte på botten av glaset provrör. Försiktigt loss provröret från anslutnings gummislang över diskhon (var noga med att undvika att förlora maskar på denna punkt).
  11. Med hjälp av en plast pipett maskar i ett 50 ml rör och tvätta sex gånger med Hanks Solution (tillåter maskar att nöja sig med gravitationen, ta bort media med en stripette, tillsätt 40 ml Hanks Solution och upprepa fem gånger).
    OBS: mask kultur måste hållas sterilt från denna punkt och framåt.
    1. Flytta till en huv med laminärt flöde och tvätta ytterligare sex gånger i steril Hanks lösning kompletterad med 100 U / ml penicillin och 100 pg / ml streptomycin, redo för in vitro-kultur.
  12. Räknavuxna maskar som återvunnits genom att ta två prover av 20 ni som tagits upp med en gul spets cut att bredda sin öppning; förväntar ca 50% av den mängd inokulerade larver.

4. Installera kulturer för HES: Medium Förberedelse, Tvättmaskin Adult Worms

  1. Blöt maskarna från 3,11 i ca 10 ml RPMI kompletterat med 10% Gentamycin i 20 min, lämnar röret vilar i en vinkel för att se maskar är helt täckta.
  2. Utför detta i ett laminärt flöde huva: Tvätta igen sex gånger med Hanks Solution (kompletterad med 5 U / ml penicillin och 5 mikrogram / ml streptomycin).
  3. Förbered H. polygrus media.
  4. Att upprätthålla sterilitet i en huv med laminärt flöde, till 500 ml av RPMI1640, tillsätt 11,1 ml av 45% glukos (slutlig koncentration 1,2% som RPMI1640 innehåller 0,2% glukos), 5 ml 100x Peniclllin-streptomycin (slutkoncentration 5 U / ml penicillin, 5 | ig / ml streptomycin), 5 ml L-glutamin (slutlig koncentration 2 mM) och5 ml av Gentamycin (slutlig koncentration 1%). Lägg inte till FCS.
  5. Alikvotera maskar i ventilerade T25-kolvar, ung. 1.000 maskar i 15 ml H. polygyrus medier per kolv och plats upprätt i 37 ° C inkubator (5% CO2) i 3 veckor.

5. Framställning av HES

  1. Samla HES-innehållande odlingsmedier från kulturer i intervaller om högst två gånger per vecka, bortsett från den första samlingen efter 24 timmar av kultur (på grund av höga halter av LPS föroreningar och värdproteiner - kan behandlas separat eller kasseras). Håll varje kollektion separat och tydligt märkt med datum och batchnummer. Ersätt med en lika stor volym H. polygyrus media vid varje tillfälle.
  2. Centrifugera HES-innehållande media vid 400 x g under 5 min. Filtrera därefter sterilisera genom 0,2 ^ m låg-proteinbindande filter i 50 ml rör. Förvaras i -20 ° C frys tydligt märkta med datum för snäck skörd och datum för HES collection.
  3. Efter 21 dagar av HES samling från kultur, kasta maskar.
  4. Pool 500-1000 ml HES supernatant (oftast från frysta lager, och inte bland de första 24 tim samling) och koncentrera över en 3.000 MWCO filter i ultrafiltreringsenhet under kvävetryck.
    OBS: Var mycket noga med att inte låta filtret gå torr.
    1. För att ställa in filteranordningen, först tvätta 3 kDa membran blanka sidan nedåt i en 1 liters bägare med destillerat vatten för 3 x 20 min under omrörning. Montera ultrafiltreringsanordning enligt tillverkarens instruktioner med filtermembranet blanka sidan uppåt. Placera i skåpet vid 4 ° C och passera 50 ml destillerat vatten genom innan du börjar koncentrera poolade HES.
    2. Lägg varje rör av HES i filtreringsanordningen enligt behov (100-140 ml per dag), tills volymen koncentrerades till 2-5 ml.
  5. I syfte att avlägsna föroreningar från HES-innehållande odlingsmedia, tillsätt 50 ml pyrogen Fritt PBS till filtreringsenheten och sedan koncentrera ner till ca 2 ml. Upprepa detta steg två gånger (150 ml PBS totalt). Överför HES i ett 15 ml rör, filtrera sterilisera (med en 0,2 ^ m filter) i en huv med laminärt flöde och mäta proteinkoncentration med användning av en spektrofotometer (E 280 = 10) eller genom Bradford-analys.
  6. Alikvot, etikett med batchnummer och datum, och frysa vid -80 ° C.
  7. Utför ett kromogent LAL-analys i enlighet med tillverkarens protokoll på varje sats av HES före användning. Om LPS nivåerna är större än 1 U LPS per 1 ^ g protein, överväga att inte använda denna sats för in vivo experiment eller in vitro kulturer.
  8. Behandla HES samlats vid 24 tim separat på samma sätt; den kommer att innehålla LPS och vissa värdproteiner och samtidigt inte lämplig för funktionella experiment, är det en användbar källa av enskilda molekyler som kan isoleras genom monoklonal antikropp affinitetsrening.

Representative Results

Mottaglighet för infektion med H. polygyrus styrs till stor del av den genetiska bakgrunden av musstam (tabell 1); C57BL / 6 och CBA-möss är mycket mottagliga 21,22. För underhåll av parasiten livscykel, har F1 hybrid mellan dessa två stammar valts för dess förmåga att motstå mycket högre snäck bördor utan morbiditet (överdriven intestinal epitelskada) jämfört med antingen moderstammen. Oral sondmatning av 400 L3 larver används för att upprätthålla livscykeln i F1-möss (som resulterar i vuxna masken bördor som visas i figur 2), medan en dos av 200 L3 larver används i allmänhet för experiment i homozygota inavlade stammar (t.ex., C57BL / 6 eller BALBc). Dock kan denna dosering behöva minskas beroende på miljösamordnare faktorer som kan skilja mellan djuranläggningar, såsom variationer i tarmfloran.

Satser av HES har visat reproducerbar effikans i funktionella analyser och i proteinkomposition; Dessutom, när supernatanter från varje successiv vecka av kultur analyserades, upp till totalt 4 veckor, var proteinprofiler befunnits vara mycket liknande (figur 3). När HES koncentration mäts genom Bradford-analys (se 5.5), den totala protein är oftast ca 1 mg / ml (Figur 4).

En alternativ metod för att koncentrera HES är med en centrifugalkoncentrator (t.ex. Vivaspin 3 kDa cut-off-membran), där prover spunna vid upp till 4000 g i en swing-out-rotor centrifug, avlägsna buffertsalter och lågmolekylära komponenter. Centrifugal koncentration är bäst lämpad för små produktionsvolymer (1-10 ml) och är begränsade till en maximal koncentration faktor på cirka 30x.

Vid insamling av HES, är undvikande av kontamination kritisk. För att undvika kontaminering med värdmolekyler, kasta vi HES-fortsaining odlingsmedier från första 24 timmar efter vuxna masken skörd från musen tarmen. Vi kvantifiera också nivån på LPS förorening i varje sats av HES med en Kromogent LAL-analys (se 5.7). 1 U LPS motsvarar ~ 100 pg LPS och nivåer under detta anses försumbara 23. I våra händer, de flesta partier av HES är betydligt under denna gräns, den genomsnittliga koncentrationen av LPS i HES var 0,23 U / ug (Figur 5). Effekterna av LPS i in vivo-modeller av patologi (t.ex. suppression av astmatiska reaktioner) kräver åtminstone 10 ng av LPS 23. Därför administrering in vivo av 5 ug HES från ett parti med 100 pg LPS / ug HES kommer att omfatta 500 pg LPS, långt under den effektiva koncentrationen där LPS blir ett problem.

Figur 1
Figur 1: Baermann Apparater Baermann Apparater setup för insamling av vuxna H. polygyrus (som beskrivs i avsnitt 2).

Figur 2
Figur 2: Genomsnittlig Worm Burden 14 dagar efter infektion med 400 L3 Larver Mean mask bördor 14 dagar efter infektion med 400 L3 larver. Datapunkter som visas är från 19 olika omgångar av infektion av C57BL / 6xCBA möss. Medelvärde ± SEM visas.

Figur 3
Figur 3: Proteinprofiler av HES Från Successiva veckor i kultur SDS-PAGE profil HES proteiner som samlats i successiva veckors odling.

Figur 4
Figur 4: Final Mängd HES från 500 ml ES-innehållande Media Utbytet av HES protein från 11 olika partier som härrör från ca 500 ml odlingssupernatant. Medelvärde ± SEM visas.

Figur 5
Figur 5: LPS Förorening av HES Nivåer av LPS förorening i 41 partier av HES mäts av Limulus ameobocyte analysen. Median LPS koncentration = 86 U per mg HES.

Figur 6
Figur 6: Animerad Schematisk bild av H. polygyrus Life Cycle Sammanfattning av viktiga livscykelstadier från oral sondmatning av L3 larver, genom återvinning av larver och vuxna maskar till isolering av HES.


Figur 7: Animerad Schematisk bild av HES och dess funktioner Viktiga immunmodulerande effekter av lösliga mediatorer och exosomer som finns i HES.

Genotyp (och bakgrunds stam) Primär infektion Fenotyp Referens
Inavlade
A / J, CBA, C3H Mycket känsliga 22,29
C57BL / 6 och C57BL / 10 Mottagliga 22,30
BALB / c, DBA / 2, 129 / J Intermediär 22,31
NIH, SJL, SWR Låg känslighet 22,32
Transgen för cytokiner eller cytokinreceptorer
IL-1β - / - Mer mottagliga 33
IL-1R - / - Mindre känsliga (a); ingen förändring av känsligheten men ökade granulom (b) (A) 33
(B) 34
IL-2RP Transgena (C57BL / 6) Resistent 35
IL-4 - / - Högre fruktsamhet 36
IL-4R - / - (C57BL / 6 eller BALB / c) Mycket känsliga 22
IL-6 - / - (BALB / c eller C57BL / 6) Mycket Resistent 37
IL-9 Transgena(FVB) Resistent 38
IL-21R - / - (C57BL / 6) Brist Th2, minskade granulom gormation 39,40
IL-25 - / - (BALB / c) Mer mottagliga 33
IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) Ingen förändring av känsligheten 33
TGFβRIIdn (C57BL / 6) Hög Th1, Ökad känslighet 41,42
Transgen för T-cellmarkörer
CD28 - / - (BALB / c) Marginellt högre fruktsamhet 43
CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) Högre fruktsamhet 44
OX40L - / - (BALB / c) Högre fruktsamhet &# 160; 45
Transgena för medfödda immun loci
Typ 1-interferon-receptor (IFNAR) - / - (C57BL / 6) Högre fruktsamhet, fler granulom 34
MyD88 - / - (C57BL / 6) Mer resistenta, fler granulom 34
C-KitW / Wv (WBB6) Mer mottagliga 46,47

Tabell 1: Primära infektioner med H. polygyrus i genetiskt olika och gen-målinriktade musstammar.

Discussion

Livscykeln för H. polygyrus skrider i ett tillförlitligt konsekvent sätt. Efter naturligt intag eller oral sondmatning av L3 larver på dag 0, cystor börjar bildas under duodenal serosa dag 5, utvecklas till larver moults och sedan fram som vuxna maskar i tarmlumen från dag 10, kan ägg ses i avföring från dag 14 och granulom är synliga på duodenal serosala ytan från dag 21. Protokollet som beskrivs ovan (och sammanfattas i figur 6) tillåter hög genomströmning produktion av H. polygyrus exkretoriska-sekretoriska produkter (HES), utöver tillförlitlig återvinning av livskraftig L3 larver för framtida experimentella och livscykel infektioner.

H. polygyrus infektion har visat sig vara skyddande i modeller av astma beroende OVA eller Der p 1 (Hus husdammskvalsterallergen) 14. Dessutom kunde undertryckande av luftvägsinflammation överföras med CD4 + CD25 + 14 eller CD19 + CD23 hi regulatoriska B-celler 24 från icke-sensibiliserade, H. polygyrus infekterade möss. I modeller av autoimmunitet, H. polygyrus infektionen har visats vara suppressiv i experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) modell för multipel skleros 9, och undertryckande kan överföras med antingen CD4 + T-celler eller CD19 + B-celler från infekterade möss 24.

Heligmosomoides polygyrus exkretoriska-sekretoriska produkter (HES) modulera värdens immunsvar och undertrycka Th2-medierad inflammation av ett antal mekanismer (som beskrivs i figur 7), inklusive: a) Hämning av dendritiska celler lyhördhet för stimulering 25, b) induktion av CD4 + Foxp3 + regulatoriska T-celler 18. och c) blockad av IL-33 produktion 20. HES har visat sig vara skyddande när det administreras ent sensibilisering eller utmaning i OVA-alum modell av astma 19 och även när de administreras intranasalt med Altern extrakt allergen 20, genom undertryckande av tidiga IL-33 release. Undvikande av LPS förorening av HES är ofta avgörande för att lyckas med framtida immunologiska experiment. I det protokoll som beskrivs här, de kritiska stegen i att uppnå detta är att se till att skräp som finns i de muslin påsar i Baermann Apparatus inte kommer in i sista HES beredningen (se 2.10) och att avsätta ES-lösning från första 24 h av kultur (se 5.1).

Under de senaste åren har HES noggrant karakteriseras på proteomic nivå med över 370 olika proteiner identifierats 26,27. Dessutom har ES från den 4: e larvstadiet utsatts för proteomik analys 28. Pågående arbete ingår karakterisera de stora glycan komponenterna i HES, kända för att vara starkt immunogent 3, och utsöndras mikro RNEftersom det är inkapslade i 50-100 nm vesiklar eller exosomes (Buck et al., Som lämnats in för publicering). Med etableringen av reproducerbara protokoll för insamling av ES från denna mycket immunmoduler parasit, och med omfattande proteomik uppgifter som identifierar de molekylära komponenterna i HES, är scenen nu inställd för identifiering och terapeutiska testning av enskilda molekyler från H. polygyrus som kan mediera centrala effekter på värdens immunsystem.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon concentrator Millipore 5112 Model 8050 50 ml
http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM
_NF-5122
Hanks’ buffered salt solution Sigma H9394 500 ml
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB
Penicillin streptomycin Invitrogen 15070-063 100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063
L-glutamine Invitrogen 25030-081 200 MM 100ml
https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081
Activated charcoal Merck 1.09624.0500 18-35 mesh
http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624
Glucose solution Sigma G8769 100 ml 45% solution
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB
Falcon tubes Sarstedt 62.547.254 50 ml
http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon
T25 Flasks Sigma CLS430639  25cm vented flask
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB
Chromogenic LAL assay Lonza 50-647U QCL-1000 assay
http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx
Gentamicin Gibco 15710-049 100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Gibco 11875093 500 ml; without L-glutamine
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monroy, F. G., Enriquez, F. J. Heligmosomoides polygyrus : a model for chronic gastrointestinal helminthiasis. Parasitol. Today. 8, 49-54 (1992).
  2. Maizels, R. M., et al. Immune modulation and modulators in Heligmosomoides polygyrus infection. Exp. Parasitol. 132, 76-89 (2012).
  3. Hewitson, J. P., et al. Heligmosomoides polygyrus elicits a dominant nonprotective antibody response directed at restricted glycan and peptide epitopes. J Immunol. 187, 4764-4777 (2011).
  4. Walk, S. T., Blum, A. M., Ewing, S. A., Weinstock, J. V., Young, V. B. Alteration of the murine gut microbiota during infection with the parasitic helminth Heligmosomoides polygyrus. Inflamm Bowel Dis. 16, 1841-1849 (2010).
  5. Rausch, S., et al. Small intestinal nematode infection of mice Is associated with increased enterobacterial loads alongside the intestinal tract. PLoS ONE. 8, e74026 (2013).
  6. Reynolds, L. A., et al. Commensal-pathogen interactions in the intestinal tract: Lactobacilli promote infection with, and are promoted by, helminth parasites. Gut Microbes. 5, 10-19 (2014).
  7. Saunders, K. A., Raine, T., Cooke, A., Lawrence, C. E. Inhibition of autoimmune type 1 diabetes by gastrointestinal helminth infection. Infect Immun. 75, 397-407 (2007).
  8. Liu, Q., et al. Helminth infection can reduce insulitis and type 1 diabetes through CD25- and IL-10-independent mechanisms. Infect Immun. 77, 5347-5358 (2009).
  9. Donskow-Łysoniewska, K., Krawczak, K., Doligalska, M. Heligmosomoides polygyrus: EAE remission is correlated with different systemic cytokine profiles provoked by L4 and adult nematodes. Exp Parasitol. 132, 243-248 (2012).
  10. Mishra, P. K., Patel, N., Wu, W., Bleich, D., Gause, W. C. Prevention of type 1 diabetes through infection with an intestinal nematode parasite requires IL-10 in the absence of a Th2-type response. Mucosal Immunol. 6, 297-308 (2013).
  11. Sutton, T. L., et al. Anti-Inflammatory mechanisms of enteric Heligmosomoides polygyrus infection against trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in a murine model. Infect Immun. 76, 4772-4782 (2008).
  12. Hang, L., et al. Heligmosomoides polygyrus bakeri infection activates colonic Foxp3+ T cells enhancing their capacity to prevent colitis. J Immunol. 191, 1927-1934 (2013).
  13. Bashir, M. E., Andersen, P., Fuss, I. J., Shi, H. N., Nagler-Anderson, C. An enteric helminth infection protects against an allergic response to dietary antigen. J Immunol. 169, 3284-3292 (2002).
  14. Wilson, M. S., et al. Suppression of allergic airway inflammation by helminth-induced regulatory T cells. J. Exp. Med. 202, 1199-1212 (2005).
  15. Kitagaki, K., et al. Intestinal helminths protect in a murine model of asthma. J Immunol. 177, 1628-1635 (2006).
  16. Hartmann, S., et al. Gastrointestinal nematode infection interferes with experimental allergic airway inflammation but not atopic dermatitis. Clin Exp Allergy. 39, 1585-1596 (2009).
  17. Pritchard, D. I., Lawrence, C. E., Appleby, P., Gibb, I. A., Glover, K. Immunosuppressive proteins secreted by the gastrointestinal nematode parasite Heligmosomoides polygyrus. Int. J. Parasitol. 24, 495-500 (1994).
  18. Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-β pathway. J Exp Med. 207, 2331-2341 (2010).
  19. McSorley, H. J., et al. Suppression of type 2 immunity and allergic airway inflammation by secreted products of the helminth Heligmosomoides polygyrus. Eur. J. Immunol. 42, 2667-2682 (2012).
  20. McSorley, H. J., Blair, N. F., Smith, K. A., McKenzie, A. N. J., Maizels, R. M. Blockade of IL-33 release and suppression of type 2 innate lymphoid cell responses by helminth secreted products in airway allergy. Mucosal Immunol. 7, 1068-1078 (2014).
  21. Behnke, J. M., Menge, D. M., Noyes, H. Heligmosomoides bakeri: a model for exploring the biology and genetics of restance to chronic gastrointestinal nematode infections. Parasitology. 136, 1565-1580 (2009).
  22. Filbey, K. J., et al. Innate and adaptive type 2 immune cell responses in genetically controlled resistance to intestinal helminth infection. Immunology and Cell Biology. 92, 436-448 (2014).
  23. Bortolatto, J., et al. Toll-like receptor 4 agonists adsorbed to aluminium hydroxide adjuvant attenuate ovalbumin-specific allergic airway disease: role of MyD88 adaptor molecule and interleukin-12/interferon-gamma axis. Clin Exp Allergy. 38, 1668-1679 (2008).
  24. Wilson, M. S., et al. Helminth-induced CD19+CD23hi B cells modulate experimental allergic and autoimmune inflammation. Eur J Immunol. 40, 1682-1696 (2010).
  25. Segura, M., Su, Z., Piccirillo, C., Stevenson, M. M. Impairment of dendritic cell function by excretory-secretory products: A potential mechanism for nematode-induced immunosuppression. Eur J Immunol. 37, 1887-1904 (2007).
  26. Hewitson, J. P., et al. Proteomic analysis of secretory products from the model gastrointestinal nematode Heligmosomoides polygyrus reveals dominance of Venom Allergen-Like (VAL) proteins. J Proteomics. 74, 1573-1594 (2011).
  27. Moreno, Y., et al. Proteomic analysis of excretory-secretory products of Heligmosomoides polygyrus assessed with next-generation sequencing transcriptomic information. PLoS Negl Trop Dis. 5, e1370 (2011).
  28. Hewitson, J. P., et al. Secretion of protective antigens by tissue-stage nematode larvae revealed by proteomic analysis and vaccination-induced sterile immunity. PLOS Pathogens. 9, e1003492 (2013).
  29. Prowse, S. J., Mitchell, G. F. On the choice of mice for dissection of strain variations in the development of resistance to infection with Nematospiroides dubius. Austral J Exp Biol Med. 58, 603-605 (1980).
  30. Behnke, J. M., Robinson, M. Genetic control of immunity to Nematospiroides dubius: a 9-day anthelmintic abbreviated immunizing regime which separates weak and strong responder strains of mice. Parasite Immunol. 7, 235-253 (1985).
  31. Zhong, S., Dobson, C. Heligmosomoides polygyrus: resistance in inbred, outbred, and selected mice. Exp. Parasitol. 82, 122-131 (1996).
  32. Behnke, J. M., et al. Genetic variation in resistance to repeated infections with Heligmosomoides polygyrus bakeri, in inbred mouse strains selected for the mouse genome project. Parasite Immunol. 28, 85-94 (2006).
  33. Zaiss, M. M., et al. IL-1β suppresses innate IL-25 and IL-33 production and maintains helminth chronicity. PLoS Pathog. 9, e1003531 (2013).
  34. Reynolds, L. A., et al. MyD88 signaling inhibits protective immunity to the gastrointestinal helminth parasite Heligmosomoides polygyrus. J Immunol. , (2014).
  35. Morimoto, M., Utsumiya, K. Enhanced protection against Heligmosomoides polygyrus in IL-2 receptor β-chain overexpressed transgenic mice with intestinal mastocytosis. J Vet Med Sci. 73, 849-851 (2011).
  36. Urban, J. F., Katona, I. M., Paul, W. E., Finkelman, F. D. Interleukin 4 is important in protective immunity to a gastrointestinal nematode infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 5513-5517 (1991).
  37. Smith, K. A., Maizels, R. M. IL-6 controls susceptibility to helminth infection by impeding Th2 responsiveness and altering the Treg phenotype in vivo. Eur J Immunol. 44, 150-161 (2014).
  38. Hayes, K. S., Bancroft, A. J., Grencis, R. K. Immune-mediated regulation of chronic intestinal nematode infection. Immunol Rev. 201, 75-88 (2004).
  39. Fröhlich, A., et al. IL-21 receptor signaling is integral to the development of Th2 effector responses in vivo. Blood. 109, 2023-2031 (2007).
  40. King, I. L., Mohrs, K., Mohrs, M. A nonredundant role for IL-21 receptor signaling in plasma cell differentiation and protective type 2 immunity against gastrointestinal helminth infection. J Immunol. 185, 6138-6145 (2010).
  41. Ince, M. N., et al. Role of T cell TGF-β signaling in intestinal cytokine responses and helminthic immune modulation. Eur J Immunol. 39, 1870-1878 (2009).
  42. Reynolds, L. A., Maizels, R. M. Cutting Edge: In the absence of TGF-β signaling in T cells, fewer CD103+ regulatory T cells develop, but exuberant IFN-γ production renders mice more susceptible to helminth infection. J Immunol. 189, 1113-1117 (2012).
  43. Ekkens, M. J., et al. Memory Th2 effector cells can develop in the absence of B7-1/B7-2, CD28 interactions, and effector Th cells after priming with an intestinal nematode parasite. J Immunol. 168, 6344-6351 (2002).
  44. Greenwald, R. J., et al. B7-2 is required for the progression but not the initiation of the type 2 immune response to a gastrointestinal nematode parasite. J. Immunol. 162, 4133-4139 (1999).
  45. Ekkens, M. J., et al. The role of OX40 ligand interactions in the development of the Th2 response to the gastrointestinal nematode parasite Heligmosomoides polygyrus. J. Immunol. 170, 384-393 (2003).
  46. Hashimoto, K., et al. Immunity-mediated regulation of fecundity in the nematode Heligmosomoides polygyrus--the potential role of mast cells. Parasitology. 137, 881-887 (2010).
  47. Hepworth, M. R., et al. Mast cells orchestrate type 2 immunity to helminths through regulation of tissue-derived cytokines. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 6644-6649 (2012).

Tags

Immunology , Helminth Life Cycle Uttagsklemmor-Sekretorisk Produkter immunologi infektion mus
Odling av<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; En immunoreglerande Nematode Parasite och dess utsöndrade produkter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnston, C. J. C., Robertson, E.,… More

Johnston, C. J. C., Robertson, E., Harcus, Y., Grainger, J. R., Coakley, G., Smyth, D. J., McSorley, H. J., Maizels, R. Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products. J. Vis. Exp. (98), e52412, doi:10.3791/52412 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter