Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

زراعة Published: April 6, 2015 doi: 10.3791/52412
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 1
1Institute of Immunology and Infection Research, University of Edinburgh, 2Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research

Summary

Heligmosomoides polygyrus هي الخيطية الفئران مع قدرات المناعية القوية التي تشبه تلك التي عالية انتشارا عدوى الديدان الطفيلية البشري. نحن هنا وصف بروتوكول لصيانة طويلة الأجل للH. polygyrus دورة الحياة.

Abstract

Heligmosomoides polygyrus (المعروف سابقا باسم Nematospiroides dubius، وأشار أيضا إلى بعض كما H. المخابز) هي الديدان الطفيلية المعوية المناعية التي توظف آليات متعددة لإنشاء عدوى مزمنة في الفئران وعن كثب تشبه السائدة العدوى بالديدان الإنسان. H. وقد درست polygyrus نطاق واسع في مجال تنظيم المناعة المستمدة من الديدان الطفيلية وتم العثور على قمع أكثر قدرة النماذج التجريبية للحساسية والمناعة الذاتية (على حد سواء مع عدوى نشطة والمنتجات يفرز معزولة). بروتوكول صفها في هذه الورقة يحدد إدارة H. polygyrus دورة الحياة لإنتاج ثابت من L3 اليرقات، والانتعاش من الطفيليات الكبار، ومجموعة من المنتجات مطرح إفرازية الخاصة بهم (HES).

Introduction

Heligmosomoides polygyrus هي الديدان الطفيلية المعوية الفئران الطبيعية التي ترتبط ارتباطا وثيقا عالية السائدة الطفيليات الخيطية البشرية 1. وعلى النقيض من نماذج الخيطية أخرى مثل النيبونية البرازيلية، H. polygyrus يضع باستمرار عدوى مزمنة في الفئران كنتيجة مباشرة الآليات المناعية قوية متعددة توظف لقمع المضيف الاستجابة المناعية 2.

H. polygyrus لديها دورة الحياة المباشرة: يتم تناولها المعدية اليرقات L3 التي كتبها انتقال FECO الفم (أو عن طريق أنبوب تغذية عن طريق الفم في إعداد مختبر تدار)، وعندها تهاجر إلى طبقة subserosal من العفج والموسوعي قبل أن يعود إلى لمعة الأمعاء كما الديدان البالغة بعد حوالي ثمانية أيام الإصابة الأولى. يحدث التزاوج وإنتاج البيض بعد يوم 10 وأنه من الممكن لحصاد الديدان البالغة للثقافة وجمع من المنتجات مطرح-إفرازية من داص 14 وما بعدها 3. H. يتفاعل polygyrus أيضا مع الدقيقة المتعايشة مع زيادة البكتريا المكونة موجودة في الفئران المصابة عرضة 4-6، وزيادة مستويات H. عدوى polygyrus التالية تعرض الفئران لالبكتريا المكونة 6.

عدوى نشطة مع H. وقد تبين polygyrus للحماية ضد الباثولوجيا المناعية في العديد من النماذج الحيوانية المناعة الذاتية 7-10، والتهاب القولون والحساسية 11،12 13-16. وقد كانت هناك بالتالي اهتماما كبيرا في إمكانات جزيئات إبرازي-إفرازية من هذا الطفيلي ("HES") إلى أسفل تعدل علم الأمراض في الجسم الحي 17،18. في الواقع، وينظر إلى آثار وقائية بعد العلاج من الفئران مع منتجات HES 19 من خلال مسارات التي يجري حاليا التعرف 18،20. نحن هنا وصف بروتوكول لإنتاج موثوق لHeligmosomoides polygyrus واستعادة منتجاتها يفرزالتي يمكن استخدامها كذلك على مجموعة من التحقيقات البيوكيميائية والمناعية وظيفية.

Protocol

ملاحظة: جميع الإجراءات الواردة في هذا البروتوكول تتم وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها المملكة المتحدة وزارة الداخلية وجامعة أدنبرة الخدمات البيطرية.

1. العدوى من الفئران بواسطة التغذية الأنبوبية

  1. متجر Heligmosomoides polygyrus L3 اليرقات في الماء المقطر لمدة تصل إلى ستة أشهر في 4 درجات مئوية.
  2. قبل الاستخدام، وغسل L3 اليرقات ثلاث مرات في الماء المقطر: أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة (مع الفرامل)، إزالة كافة ولكن 500 ميكرولتر من الماء (لتجنب مقلقة مكعبات اليرقات L3) و resuspend بيليه في كل مرة.
  3. لغسل الثالث، إضافة الماء إلى وحدة تخزين المحدد (عادة 40 مل)، ونضح 20 ميكرولتر مع خفض غيض 200 ميكرولتر لتوسيع الفتحة التي. مكان اثنين 20 عينة ميكرولتر على سطح صحن الثقافة 60 مم وعدد اليرقات L3 (عادة المحمول، وأفضل ينظر تحت 50X التكبير مع مجهر تشريح). resuspend الكرية النهائي في الماء المقطر إلى concentratioن من 2،000 L3 اليرقات لكل مل.
  4. لإنتاج دورة الحياة، وتصيب القديم أسابيع 8 F1 (C57BL / 6xCBA) الفئران مع 400 H. polygyrus L3 اليرقات في 200 ميكرولتر من الماء المقطر عن طريق أنبوب تغذية عن طريق الفم (كبح الفئران في وضع مستقيم من القفا من الرقبة وتمر بلطف الإبرة أنبوب تغذية حادة عن طريق الفم والمريء إلى المعدة). تستنهض الهمم قبل شامل لكل العدوى (اليرقات تستقر بسرعة في الماء) ونضح 200 ميكرولتر في حقنة 1 مل. استخدام إبرة التغذية الأنبوبية مخصصة مع نهاية مدورة. للعدوى التجريبية من الفئران الشابة (6-8 أسابيع من العمر)، أو السلالات الفطرية الأخرى (مثل C57BL / 6 أو BALBc)، تصيب الفئران مع 200 L3 اليرقات.

2. الانتشار وصيانة H. polygyrus

  1. وضع الفحم في وسط حوض بلاستيكية كبيرة وتسمح للماء الصنبور البارد لتشغيل أكثر من ذلك لمدة لا تقل عن 30 دقيقة (غير مغسولة الفحم المنشط هو سامة للL3 اليرقات). استنزاف المياه من الحوض ووضع الفحم على رالتعليم الجامعي طبقات من الورق ماصة، وتركها معرضة للهواء الغرفة حتى تجف تماما.
  2. إذا كانت هناك حاجة البيض، كشط البراز أول من خرج من القولون مع ملقط (ومقص إذا لزم الأمر). إذا كان هناك حاجة لعدد كبير من L3 اليرقات، ووضع الفئران على شبكة الأسلاك وجمع الكريات البرازية على مدى عدة أيام.
  3. مزيج البراز مع الفحم حبيبات في نسبة ما لا يقل عن 1: 1، لتحقيق الاتساق فقط رطبة بما يكفي لتنضم لتصفية الورق. تشويه طبقة رقيقة في وسط بعض ورق الترشيح مبللة في طبق بتري ووضع هذا في مربع رطب (إضافة بعض منشفة ورقية رطبة وطبق من الماء) في الظلام لمدة 12-14 يوما.
  4. إزالة L3 اليرقات من يوم 7 وما بعده، وجمع لهم على مناسبتين على الأقل قبل أن يتم التخلص منها ورقة. اليرقات تشكل حلقة حول حافة ورقة الترشيح. رفع ورقة الترشيح للخروج من طبق بتري وشطف اليرقات التي تم تركها من لوحة (باستخدام ماصة و 5 مل من الماء المعقم لكل لوحة) في أنبوب 50 مل.
  5. رفعمن ورقة الترشيح وحصاد اليرقات المتبقية تركت على لوحة مع الماء المقطر في أنبوب 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في حل النفايات السائلة في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. غسل اليرقات ثلاث مرات بالماء المقطر ثم تخزين عند 4 درجات مئوية في ما يصل الى 50 مل من الماء المقطر حتى المطلوبة.
    ملاحظة: يرقات تبقى قابلة للحياة والمعدية لمدة 6 أشهر على الأقل.

3. جمع الكبار H. polygyrus الديدان

  1. إعداد جهاز بيرمان تعديل مقدما كما هو مبين في الشكل (1).
  2. الفئران الذبح بعد أربعة عشر يوما من العدوى.
  3. يغسل البطن مع الايثانول 70٪. قطع الجلد على البطن وسحب الكشف عن جدار البطن الأمامي. جعل شق خط الوسط لدخول التجويف البريتوني.
  4. إزالة الأمعاء الصغيرة والكبيرة بأكمله (من الاثني عشر الداني إلى القاصي المستقيم). ضع في طبق بتري الجاف.
  5. تصويب القناة الهضمية على طوله بأكمله؛ استئصال القولون براز التي تحتوي على. وضع هذا في طبق منفصل للتحضير البيض في وقت لاحق.
  6. استئصال 20 سم الداني من الأمعاء الدقيقة التي تحتوي على الديدان البالغة -identified من قبل جدار سميك نسبيا من العفج وغالبا ما يكون ظهور الأحمر بسبب الديدان داخل اللمعية. المكان الى (100 مم) طبق بيتري مع 5 مل من محلول هانكس "، تحسنت إلى 37 درجة مئوية (عينتين لكل طبق).
  7. فتح الداني الأمعاء جزء مليئة دودة طوليا مع مقص (مقص ذهابا وانتهت هي الأفضل لهذا)، وكشط أسفل داخل القناة الهضمية بطانة مع اثنين من الشرائح الزجاجية لإزالة الديدان. ثم تجاهل جدار الأمعاء نظيفة.
  8. الديدان معلومات سرية إلى أكياس صغيرة الشاش، التيلة مغلق وآمن مع الدبابيس الورقية حول حافة القمع الزجاج (الشكل 1).
  9. ملء قمع مع الحل هانكس "وإضافة ما يقرب من 4 أطباق بتري من الديدان في كل القمع.
  10. مكان الجهاز في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة، اثارة بلطف في منتصف الطريق من خلال لإزاحةالحطام من إعداد القناة الهضمية التي قد تسد مرشح الشاش. الحرص على تجنب تسرب الحطام خارج كيس الشاش - وهذا سوف يسبب تلوث إعداد HES النهائي. الديدان البالغة يجب أن هاجر ببطء من خلال قطعة قماش الشاش واستقروا في الجزء السفلي من أنبوب الاختبار الزجاج. فصل بعناية أنبوب الاختبار من ربط خرطوم مطاطي خلال بالوعة (مع الحرص على تجنب فقدان الديدان عند هذه النقطة).
  11. باستخدام ماصة بلاستيكية، ونقل الديدان في أنبوب 50 مل وغسل ست مرات مع هانكس "الحل (السماح الديدان ليستقر مع الجاذبية، وإزالة وسائل الاعلام مع stripette، إضافة 40 مل من هانكس" الحل وكرر خمس مرات).
    يجب أن تبقى الثقافة دودة عقيمة من هذه النقطة فصاعدا: ملاحظة.
    1. الانتقال إلى غطاء تدفق الصفحي وغسل ست مرات أخرى في محلول معقم هانكس "تستكمل مع 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل، وعلى استعداد للثقافة في المختبر.
  12. عدالديدان البالغة تعافى من خلال اتخاذ عينتين من 20 ميكرولتر تناولها مع خفض غيض الأصفر لتوسيع فتحة فيه؛ نتوقع ما يقرب من 50٪ من كمية اليرقات الملقحة.

4. إعداد الثقافات لHES: متوسطة إعداد وغسل الديدان الكبار

  1. نقع الديدان من 3.11 في حوالي 10 مل من RPMI تستكمل مع 10٪ جنتاميسين لمدة 20 دقيقة، وترك يستريح أنبوب في زاوية لضمان وتغطي الديدان بشكل كامل.
  2. تنفيذ هذا في غطاء تدفق الصفحي: يغسل مرة أخرى ستة مرات مع الحل هانكس "(تستكمل مع 5 U / البنسلين مل و 5 ميكروغرام / مل الستربتومايسين).
  3. إعداد H. وسائل الإعلام polygrus.
  4. الحفاظ على عقم في الصفحي تدفق غطاء محرك السيارة، إلى 500 مل من RPMI1640، إضافة 11.1 مل من 45٪ جلوكوز (تركيز النهائي 1.2٪ كما RPMI1640 يحتوي على 0.2٪ الجلوكوز)، 5 مل من 100X Peniclllin، الستربتوميسين (تركيز النهائي 5 U / البنسلين مل، 5 ميكروغرام / الستربتومايسين مل)، و 5 مل من L-الجلوتامين (تركيز النهائي 2 مم)، و5 مل من جنتاميسين (تركيز النهائي 1٪). لا تقم بإضافة FCS.
  5. الديدان قسامة في قوارير T25 تنفيس، تقريبا. 1،000 الديدان في 15 مل H. polygyrus وسائل الإعلام في قارورة، ومكان تستقيم في الحاضنة 37 درجة مئوية (5٪ CO 2) لمدة 3 أسابيع.

5. إعداد HES

  1. جمع HES التي تحتوي على وسائل الإعلام ثقافة من الثقافات على فترات لا تزيد عن مرتين في الأسبوع، ووضع جانبا الأول جمع بعد 24 ساعة من ثقافة (بسبب ارتفاع مستويات التلوث LPS والبروتينات المضيفة - يمكن معالجتها أو التخلص منها بشكل منفصل). إبقاء كل مجموعة منفصلة وصفت بشكل واضح مع تاريخ ورقم الدفعة. استبدال مع حجم مساو من H. وسائل الإعلام polygyrus في كل مناسبة.
  2. الطرد المركزي HES التي تحتوي على وسائل الإعلام في 400 ز س لمدة 5 دقائق. ثم تصفية تعقيم خلال 0.2 ميكرون مرشحات منخفضة البروتين ملزم إلى 50 مل أنابيب. متجر في الثلاجة -20 درجة مئوية وصفت بشكل واضح مع تاريخ الحصاد دودة وتاريخ HES جollection.
  3. بعد 21 يوما من جمع HES من الثقافة، وتجاهل الديدان.
  4. تجمع 500-1،000 مل من HES طاف (عادة من الأسهم المجمدة، وليس بما في ذلك جمع ساعة الأولى 24) والتركيز على مرشح 3،000 MWCO في جهاز الترشيح الفائق تحت ضغط النيتروجين.
    ملاحظة: كن حريصا جدا على ألا تدع على المدى مرشح الجافة.
    1. لإعداد جهاز مرشح، وغسل أول الجانب اللامع 3 كيلو دالتون غشاء أسفل في كوب 1 لتر بالماء المقطر لمدة 3 × 20 دقيقة في حين اثارة. تجميع جهاز الترشيح الفائق وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع غشاء فلتر الجانب اللامع فوق. مكان في مجلس الوزراء في 4 درجات مئوية وتمرير 50 ​​مل من الماء المقطر من خلال قبل البدء في التركيز HES المجمعة.
    2. إضافة كل أنبوب من HES في جهاز الترشيح على النحو المطلوب (100-140 مل في اليوم الواحد)، حتى يتركز خفض مستوى الصوت إلى 2-5 مل.
  5. من أجل إزالة الملوثات من وسائل الإعلام الثقافة HES التي تحتوي على، إضافة 50 مل من فندق Pyrمجانا ogen-PBS إلى الجهاز الترشيح وثم التركيز وصولا الى ما يقرب من 2 مل. كرر هذه الخطوة مرتين (150 مل من برنامج تلفزيوني في المجموع). نقل HES في أنبوب 15 مل، تعقيم فلتر (مع 0.2 ميكرون فلتر) في غطاء تدفق الصفحي وقياس تركيز البروتين باستخدام مقياس الطيف الضوئي (E 280 = 10) أو عن طريق الفحص برادفورد.
  6. قسامة، والتسمية مع رقم الدفعة وتاريخ، وتجميد في -80 ° C.
  7. إجراء فحص LAL مولد اللون وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة على كل دفعة من HES قبل استخدامها. إذا كانت مستويات LPS أكبر من 1 U LPS لكل 1 ميكروغرام من البروتين، والنظر في عدم استخدام هذه الدفعة لفي التجارب المجراة أو في الثقافات المختبر.
  8. معالجة HES جمعها في 24 ساعة على حدة بنفس الطريقة. وسوف تحتوي LPS وبعض البروتينات المضيفة و، في حين لا تصلح للتجارب وظيفية، بل هو مصدر مفيد للجزيئات الفردية التي قد تكون معزولة التي كتبها وحيدة النسيلة تنقية الجسم المضاد التقارب.

Representative Results

القابلية للإصابة مع H. يتم التحكم polygyrus إلى درجة كبيرة من الخلفية الوراثية للسلالة الماوس (الجدول 1)؛ C57BL / 6 و CBA الفئران هي عرضة 21،22. لصيانة دورة حياة الطفيل، وقد تم اختيار هجين F1 بين هذه السلالات اثنين لقدرته على تحمل أعباء دودة أعلى من ذلك بكثير دون الاعتلال (المفرط الضرر الظهارية في الأمعاء) مقارنة إما سلالة الأبوية. يستخدم أنبوب تغذية عن طريق الفم من 400 L3 اليرقات للحفاظ على دورة الحياة في الفئران F1 (مما يؤدي إلى أعباء دودة الكبار هو مبين في الشكل 2)، في حين جرعة من 200 L3 اليرقات يستخدم عادة للتجارب في سلالات الفطرية متماثلة اللواقح (على سبيل المثال، C57BL / 6 أو BALBc). ومع ذلك، قد تحتاج هذه الجرعة إلى أن تخفض اعتمادا على العوامل البيئية المشتركة التي قد تختلف بين مرافق الحيوانات، مثل الاختلافات في النباتات الأمعاء.

وقد أثبتت دفعات من HES ايفي استنساخهcacy في المقايسات الفنية وتكوين البروتين. وعلاوة على ذلك، وعندما تم تحليل supernatants من كل أسبوع على التوالي من الثقافة، وتصل إلى ما مجموعه 4 أسابيع، وعثر على ملامح البروتين لتكون مشابهة جدا (الشكل 3). وعندما يتم قياس تركيز HES التي كتبها برادفورد فحص (انظر 5.5)، والمجموع البروتين هو عادة حوالي 1 ملغم / لتر (الشكل 4).

طريقة بديلة من التركيز HES هو مع المكثف الطرد المركزي (على سبيل المثال Vivaspin 3 كيلو دالتون قطع غشاء)، حيث يتم نسج عينات على ما يصل إلى 4،000 غرام في الدوار الطرد المركزي سوينغ التدريجي، وإزالة الأملاح العازلة وانخفاض مكونات الوزن الجزيئي. هو الانسب تركيز الطرد المركزي في أحجام معالجة صغيرة (1-10 مل)، وتقتصر على عامل تركيز أقصى ما يقرب من 30X.

عند جمع HES، وتجنب التلوث أمر بالغ الأهمية. لتجنب التلوث مع جزيئات المضيف، نحن تجاهل HES-تابعaining سائل الإعلام والثقافة من ساعة 24 الأولى بعد الحصاد دودة البالغين من الأمعاء الماوس. نحن أيضا قياس مستوى التلوث LPS في كل دفعة من HES مع مقايسة اللونية LAL (انظر 5.7). 1 U من LPS يعادل ~ 100 خريج LPS وتعتبر مستويات أقل من هذا لا تذكر 23. في أيدينا، فإن معظم دفعات من HES هي أقل بكثير من الحد المسموح به، متوسط ​​تركيز LPS في HES كونها 0.23 U / ميكروغرام (الشكل 5). آثار LPS في نماذج في الجسم الحي علم الأمراض (على سبيل المثال قمع الردود الربو) يتطلب لا يقل عن 10 نانوغرام من LPS 23. وبالتالي في إدارة الجسم الحي من 5 ميكروغرام HES من دفعة مع 100 خريج LPS / ميكروغرام HES ستشمل 500 LPS خريج، أقل بكثير من التركيز الفعال حيث يصبح LPS مشكلة.

الشكل (1)
الشكل 1: بيرمان جهاز بايرمان الإعداد جهاز لجمع H. الكبار polygyrus (كما هو موضح في القسم 2).

الشكل 2
الشكل 2: يعني دودة عبء 14 أيام بعد الإصابة مع 400 L3 اليرقات متوسط ​​دودة الأعباء بعد 14 أيام من العدوى مع 400 L3 اليرقات. نقاط البيانات المبينة لمن 19 جولات منفصلة من إصابة الفئران C57BL / 6xCBA. يعني ± SEM هو مبين.

الشكل (3)
الرقم 3: لمحات من البروتين HES من أسابيع متتالية في الثقافة الشخصية SDS-PAGE من البروتينات HES جمعها في الأسابيع المتتالية للثقافة.

الشكل (4)
الشكل (4): ترونج> الكمية النهائية من HES من 500 مل وسائل الإعلام العائد من البروتين HES من 11 دفعات مختلفة مشتقة من حوالي 500 مل من ثقافة طاف يحتوي على ES-. يعني ± SEM هو مبين.

الرقم 5
الشكل 5: LPS تلوث مستويات HES التلوث LPS في 41 دفعات من HES يقاس ameobocyte فحص الليمول. متوسط ​​تركيز LPS = 86 U في ملغ من HES.

الشكل (6)
الشكل 6: الرسوم المتحركة تخطيطي لH. ملخص polygyrus دورة الحياة من رئيسية من مراحل دورة حياة من أنبوب تغذية عن طريق الفم من L3 اليرقات، من خلال استرداد من اليرقات والديدان الكبار لعزل HES.

-together.within صفحة = "دائما"> الرقم 7
الرقم 7: الرسوم المتحركة تخطيطي لHES وظائفها الآثار المناعية الرئيسية للوساطة القابلة للذوبان وexosomes الواردة في HES.

النمط الجيني (وسلالة الخلفية) النمط الظاهري العدوى الأولية إشارة
سلالات الفطرية
A / J، CBA، C3H عرضة للغاية 22،29
C57BL / 6 و C57BL / 10 عرضة 22،30
BALB / ج، DBA / 2، 129 / J متوسط 22،31
NIH، SJL، SWR انخفاض القابلية 22،32
المعدلة وراثيا لالسيتوكينات أو مستقبلات خلوى
IL-1β - / - أكثر عرضة 33
IL-1R - / - أقل عرضة (أ)؛ أي تغيير في حساسية ولكن زيادة حبيبية (ب) (أ) 33
(ب) 34
IL-2Rβ المعدلة وراثيا (C57BL / 6) مقاوم 35
IL-4 - / - الخصوبة أعلى 36
IL-4R - / - (C57BL / 6 أو BALB / ج) عرضة للغاية 22
IL-6 - / - (BALB / ج أو C57BL / 6) مقاومة عالية 37
IL-9 المعدلة وراثيا(FVB) مقاوم 38
IL-21R - / - (C57BL / 6) نقص TH2، وانخفضت الحبيبي gormation 39،40
IL-25 - / - (BALB / ج) أكثر عرضة 33
IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / ج) أي تغيير في حساسية 33
TGFβRIIdn (C57BL / 6) ارتفاع TH1، زيادة الميل 41،42
المعدلة وراثيا لعلامات خلية T
CD28 - / - (BALB / ج) أعلى هامشيا الخصوبة 43
CD86 (B7-2) - / - (BALB / ج) الخصوبة أعلى 44
OX40L - / - (BALB / ج) الخصوبة المرتفعة و# 160؛ 45
المعدلة وراثيا لمواضع المناعي الفطري
نوع 1 الانترفيرون مستقبلات (IFNAR) - / - (C57BL / 6) الخصوبة أعلى، والمزيد من أورام حبيبية 34
MyD88 - / - (C57BL / 6) أكثر مقاومة، والمزيد من أورام حبيبية 34
C-KitW / ببخار الماء (WBB6) أكثر عرضة 46،47

الجدول 1: العدوى الأولية مع H. polygyrus في سلالات مختلفة الماوس وراثيا والجينات مستهدفة.

Discussion

دورة حياة H. عائدات polygyrus بطريقة متسقة بشكل موثوق. بعد تناولها طبيعي أو أنبوب تغذية عن طريق الفم من L3 اليرقات في اليوم 0، الخراجات تبدأ في تشكيل تحت المصلية الاثني عشر بعد يوم 5، تتقدم إلى التبديلات اليرقات ثم الناشئة مثل الديدان البالغة في تجويف الأمعاء من يوم 10، ويمكن رؤية البيض في البراز من اليوم 14 وأورام حبيبية مرئية على سطح المصلي الاثني عشر من يوم 21. البروتوكول هو موضح أعلاه (وتلخيصها في الشكل 6) يسمح لإنتاج عالية الإنتاجية من H. polygyrus-مطرح إفرازية المنتجات (HES)، بالإضافة إلى الانتعاش يمكن الاعتماد عليها اليرقات L3 قابلة للالتهابات دورة التجريبية والحياة في المستقبل.

وقد تبين H. العدوى polygyrus إلى حماية في نماذج من الربو تعتمد على OVA أو دير ص 1 (بيت سوس الغبار الحساسية) 14. وعلاوة على ذلك، يمكن نقل قمع التهاب الشعب الهوائية مع CD4 + CD25 + 14 أو CD19 + CD23 مرحبا خلايا B التنظيمية 24 من غير توعية، H. -infected polygyrus الفئران. في نماذج من المناعة الذاتية، H. وقد تبين إصابة polygyrus أن تكون قمعية في التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي (EAE) نموذج تجريبي من التصلب المتعدد 9، ويمكن نقل قمع إما خلايا CD4 + T أو خلايا CD19 + B من الفئران المصابة 24.

Heligmosomoides polygyrus المنتجات مطرح-إفرازية (HES) تعدل الاستجابة المناعية المضيفة وقمع التهاب TH2 بوساطة من قبل عدد من الآليات (المبين في الشكل 7)، بما في ذلك: أ) تثبيط الاستجابة الخلايا الجذعية لتحفيز 25، ب) تحريض CD4 + Foxp3 + خلايا T التنظيمية 18. وج) الحصار من IL-33 إنتاج 20. وقد تبين HES إلى حماية عندما تدار لر توعية أو تحديا في النموذج OVA-الشب من الربو 19 وأيضا عندما تدار الأنف مع استخراج النوباء حساسية 20، من خلال قمع أوائل IL-33 الإصدار. تجنب التلوث LPS من HES غالبا ما يكون حاسما لنجاح التجارب المناعية في المستقبل. في البروتوكول المذكورة هنا، والخطوات الحاسمة في تحقيق هذه هي لضمان أن الحطام الواردة ضمن أكياس الشاش لجهاز بيرمان لا يدخل إعداد HES النهائي (انظر 2.10) وتوضع جانبا حل ES من ساعة 24 الأولى للثقافة (انظر 5.1).

خلال السنوات الأخيرة، تم HES تتميز بدقة على مستوى بروتيوميك مع أكثر من 370 البروتينات متميزة حددت 26،27. وبالإضافة إلى ذلك، ES من مرحلة اليرقات 4 قد تعرض للتحليل البروتين 28. ويشمل العمل الجاري تميز مكونات غليكان الرئيسية للHES، من المعروف أن مناعة بقوة 3، ويفرز الصغرى RNكما أن يتم تغليف في الحويصلات 50-100 نانومتر أو exosomes (باك وآخرون، المقدمة للنشر). مع إنشاء بروتوكولات استنساخه لجمع ES من هذا الطفيلي المناعية للغاية، والذي يتضمن بيانات البروتين واسعة تحديد المكونات الجزيئية للHES، يتم تعيين الآن مرحلة لتحديد واختبار العلاجي من الجزيئات الفردية من H. polygyrus التي يمكن التوسط آثار رئيسية على الجهاز المناعي المضيف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon concentrator Millipore 5112 Model 8050 50 ml
http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM
_NF-5122
Hanks’ buffered salt solution Sigma H9394 500 ml
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB
Penicillin streptomycin Invitrogen 15070-063 100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063
L-glutamine Invitrogen 25030-081 200 MM 100ml
https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081
Activated charcoal Merck 1.09624.0500 18-35 mesh
http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624
Glucose solution Sigma G8769 100 ml 45% solution
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB
Falcon tubes Sarstedt 62.547.254 50 ml
http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon
T25 Flasks Sigma CLS430639  25cm vented flask
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB
Chromogenic LAL assay Lonza 50-647U QCL-1000 assay
http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx
Gentamicin Gibco 15710-049 100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Gibco 11875093 500 ml; without L-glutamine
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monroy, F. G., Enriquez, F. J. Heligmosomoides polygyrus : a model for chronic gastrointestinal helminthiasis. Parasitol. Today. 8, 49-54 (1992).
  2. Maizels, R. M., et al. Immune modulation and modulators in Heligmosomoides polygyrus infection. Exp. Parasitol. 132, 76-89 (2012).
  3. Hewitson, J. P., et al. Heligmosomoides polygyrus elicits a dominant nonprotective antibody response directed at restricted glycan and peptide epitopes. J Immunol. 187, 4764-4777 (2011).
  4. Walk, S. T., Blum, A. M., Ewing, S. A., Weinstock, J. V., Young, V. B. Alteration of the murine gut microbiota during infection with the parasitic helminth Heligmosomoides polygyrus. Inflamm Bowel Dis. 16, 1841-1849 (2010).
  5. Rausch, S., et al. Small intestinal nematode infection of mice Is associated with increased enterobacterial loads alongside the intestinal tract. PLoS ONE. 8, e74026 (2013).
  6. Reynolds, L. A., et al. Commensal-pathogen interactions in the intestinal tract: Lactobacilli promote infection with, and are promoted by, helminth parasites. Gut Microbes. 5, 10-19 (2014).
  7. Saunders, K. A., Raine, T., Cooke, A., Lawrence, C. E. Inhibition of autoimmune type 1 diabetes by gastrointestinal helminth infection. Infect Immun. 75, 397-407 (2007).
  8. Liu, Q., et al. Helminth infection can reduce insulitis and type 1 diabetes through CD25- and IL-10-independent mechanisms. Infect Immun. 77, 5347-5358 (2009).
  9. Donskow-Łysoniewska, K., Krawczak, K., Doligalska, M. Heligmosomoides polygyrus: EAE remission is correlated with different systemic cytokine profiles provoked by L4 and adult nematodes. Exp Parasitol. 132, 243-248 (2012).
  10. Mishra, P. K., Patel, N., Wu, W., Bleich, D., Gause, W. C. Prevention of type 1 diabetes through infection with an intestinal nematode parasite requires IL-10 in the absence of a Th2-type response. Mucosal Immunol. 6, 297-308 (2013).
  11. Sutton, T. L., et al. Anti-Inflammatory mechanisms of enteric Heligmosomoides polygyrus infection against trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in a murine model. Infect Immun. 76, 4772-4782 (2008).
  12. Hang, L., et al. Heligmosomoides polygyrus bakeri infection activates colonic Foxp3+ T cells enhancing their capacity to prevent colitis. J Immunol. 191, 1927-1934 (2013).
  13. Bashir, M. E., Andersen, P., Fuss, I. J., Shi, H. N., Nagler-Anderson, C. An enteric helminth infection protects against an allergic response to dietary antigen. J Immunol. 169, 3284-3292 (2002).
  14. Wilson, M. S., et al. Suppression of allergic airway inflammation by helminth-induced regulatory T cells. J. Exp. Med. 202, 1199-1212 (2005).
  15. Kitagaki, K., et al. Intestinal helminths protect in a murine model of asthma. J Immunol. 177, 1628-1635 (2006).
  16. Hartmann, S., et al. Gastrointestinal nematode infection interferes with experimental allergic airway inflammation but not atopic dermatitis. Clin Exp Allergy. 39, 1585-1596 (2009).
  17. Pritchard, D. I., Lawrence, C. E., Appleby, P., Gibb, I. A., Glover, K. Immunosuppressive proteins secreted by the gastrointestinal nematode parasite Heligmosomoides polygyrus. Int. J. Parasitol. 24, 495-500 (1994).
  18. Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-β pathway. J Exp Med. 207, 2331-2341 (2010).
  19. McSorley, H. J., et al. Suppression of type 2 immunity and allergic airway inflammation by secreted products of the helminth Heligmosomoides polygyrus. Eur. J. Immunol. 42, 2667-2682 (2012).
  20. McSorley, H. J., Blair, N. F., Smith, K. A., McKenzie, A. N. J., Maizels, R. M. Blockade of IL-33 release and suppression of type 2 innate lymphoid cell responses by helminth secreted products in airway allergy. Mucosal Immunol. 7, 1068-1078 (2014).
  21. Behnke, J. M., Menge, D. M., Noyes, H. Heligmosomoides bakeri: a model for exploring the biology and genetics of restance to chronic gastrointestinal nematode infections. Parasitology. 136, 1565-1580 (2009).
  22. Filbey, K. J., et al. Innate and adaptive type 2 immune cell responses in genetically controlled resistance to intestinal helminth infection. Immunology and Cell Biology. 92, 436-448 (2014).
  23. Bortolatto, J., et al. Toll-like receptor 4 agonists adsorbed to aluminium hydroxide adjuvant attenuate ovalbumin-specific allergic airway disease: role of MyD88 adaptor molecule and interleukin-12/interferon-gamma axis. Clin Exp Allergy. 38, 1668-1679 (2008).
  24. Wilson, M. S., et al. Helminth-induced CD19+CD23hi B cells modulate experimental allergic and autoimmune inflammation. Eur J Immunol. 40, 1682-1696 (2010).
  25. Segura, M., Su, Z., Piccirillo, C., Stevenson, M. M. Impairment of dendritic cell function by excretory-secretory products: A potential mechanism for nematode-induced immunosuppression. Eur J Immunol. 37, 1887-1904 (2007).
  26. Hewitson, J. P., et al. Proteomic analysis of secretory products from the model gastrointestinal nematode Heligmosomoides polygyrus reveals dominance of Venom Allergen-Like (VAL) proteins. J Proteomics. 74, 1573-1594 (2011).
  27. Moreno, Y., et al. Proteomic analysis of excretory-secretory products of Heligmosomoides polygyrus assessed with next-generation sequencing transcriptomic information. PLoS Negl Trop Dis. 5, e1370 (2011).
  28. Hewitson, J. P., et al. Secretion of protective antigens by tissue-stage nematode larvae revealed by proteomic analysis and vaccination-induced sterile immunity. PLOS Pathogens. 9, e1003492 (2013).
  29. Prowse, S. J., Mitchell, G. F. On the choice of mice for dissection of strain variations in the development of resistance to infection with Nematospiroides dubius. Austral J Exp Biol Med. 58, 603-605 (1980).
  30. Behnke, J. M., Robinson, M. Genetic control of immunity to Nematospiroides dubius: a 9-day anthelmintic abbreviated immunizing regime which separates weak and strong responder strains of mice. Parasite Immunol. 7, 235-253 (1985).
  31. Zhong, S., Dobson, C. Heligmosomoides polygyrus: resistance in inbred, outbred, and selected mice. Exp. Parasitol. 82, 122-131 (1996).
  32. Behnke, J. M., et al. Genetic variation in resistance to repeated infections with Heligmosomoides polygyrus bakeri, in inbred mouse strains selected for the mouse genome project. Parasite Immunol. 28, 85-94 (2006).
  33. Zaiss, M. M., et al. IL-1β suppresses innate IL-25 and IL-33 production and maintains helminth chronicity. PLoS Pathog. 9, e1003531 (2013).
  34. Reynolds, L. A., et al. MyD88 signaling inhibits protective immunity to the gastrointestinal helminth parasite Heligmosomoides polygyrus. J Immunol. , (2014).
  35. Morimoto, M., Utsumiya, K. Enhanced protection against Heligmosomoides polygyrus in IL-2 receptor β-chain overexpressed transgenic mice with intestinal mastocytosis. J Vet Med Sci. 73, 849-851 (2011).
  36. Urban, J. F., Katona, I. M., Paul, W. E., Finkelman, F. D. Interleukin 4 is important in protective immunity to a gastrointestinal nematode infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 5513-5517 (1991).
  37. Smith, K. A., Maizels, R. M. IL-6 controls susceptibility to helminth infection by impeding Th2 responsiveness and altering the Treg phenotype in vivo. Eur J Immunol. 44, 150-161 (2014).
  38. Hayes, K. S., Bancroft, A. J., Grencis, R. K. Immune-mediated regulation of chronic intestinal nematode infection. Immunol Rev. 201, 75-88 (2004).
  39. Fröhlich, A., et al. IL-21 receptor signaling is integral to the development of Th2 effector responses in vivo. Blood. 109, 2023-2031 (2007).
  40. King, I. L., Mohrs, K., Mohrs, M. A nonredundant role for IL-21 receptor signaling in plasma cell differentiation and protective type 2 immunity against gastrointestinal helminth infection. J Immunol. 185, 6138-6145 (2010).
  41. Ince, M. N., et al. Role of T cell TGF-β signaling in intestinal cytokine responses and helminthic immune modulation. Eur J Immunol. 39, 1870-1878 (2009).
  42. Reynolds, L. A., Maizels, R. M. Cutting Edge: In the absence of TGF-β signaling in T cells, fewer CD103+ regulatory T cells develop, but exuberant IFN-γ production renders mice more susceptible to helminth infection. J Immunol. 189, 1113-1117 (2012).
  43. Ekkens, M. J., et al. Memory Th2 effector cells can develop in the absence of B7-1/B7-2, CD28 interactions, and effector Th cells after priming with an intestinal nematode parasite. J Immunol. 168, 6344-6351 (2002).
  44. Greenwald, R. J., et al. B7-2 is required for the progression but not the initiation of the type 2 immune response to a gastrointestinal nematode parasite. J. Immunol. 162, 4133-4139 (1999).
  45. Ekkens, M. J., et al. The role of OX40 ligand interactions in the development of the Th2 response to the gastrointestinal nematode parasite Heligmosomoides polygyrus. J. Immunol. 170, 384-393 (2003).
  46. Hashimoto, K., et al. Immunity-mediated regulation of fecundity in the nematode Heligmosomoides polygyrus--the potential role of mast cells. Parasitology. 137, 881-887 (2010).
  47. Hepworth, M. R., et al. Mast cells orchestrate type 2 immunity to helminths through regulation of tissue-derived cytokines. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 6644-6649 (2012).

Tags

علم المناعة، العدد 98،
زراعة<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; إن المناعية نيماتودا الطفيلي ومنتجاتها يفرز
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnston, C. J. C., Robertson, E.,… More

Johnston, C. J. C., Robertson, E., Harcus, Y., Grainger, J. R., Coakley, G., Smyth, D. J., McSorley, H. J., Maizels, R. Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products. J. Vis. Exp. (98), e52412, doi:10.3791/52412 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter